Western Blot常见问题及处理
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Western Blot常见问题及处理
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&&&&& 1、western blot 的优点　　答： 灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。　　2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？　　答： 原因有很多: a） 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b） 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。　　3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？　　答： a） 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长， b） 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。　　4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？　　答：可以选择0.2&ml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。　　5、我的目的带很弱，怎么加强？　　答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。　　6、胶片背景很脏，有什么解决方法？　　答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。　　7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？　　答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即&反亮现象&。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。　　8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？　　答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。　　a） 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c） ECL底物没覆盖到相应位置；d） 二抗失活。 　　9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?　　答：a） 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b） 显影时间过长。　　10、DAB好还是ECM好？　　答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。　　11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？　　答：a）抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b）蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等　　12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？　　答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时间不够，。　　13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？　　答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。　　14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？　　答： ① 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。　　② 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。　　15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120&g，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？　　答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。　　16、细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？ 　　答：一般5&10^6就足够了　　17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？ 　　答：能，没有问题。　　18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？　　答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。　　19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？　　答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。　　20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？　　答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇。　　21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？　　答：200kd的蛋白不好做， 分离胶用7％，积层胶 3.5％。　　22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？ 　　答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。　　23、蛋白变性后可以存放多久？　　答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。　　24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？　　答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。　　25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？ 　　解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．　　26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？　　答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。　　27、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？　　答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。　　28、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？　　答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择&7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。　　29、有什么方法可以提高上样量？　　答：a）可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b）用5倍的上样缓冲液来稀释变性　　30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？　　答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超载.　　31、一抗，二抗的比例是否重要？　　答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。　　32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？　　答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。　　33、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？　　答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。　　34、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗？　　答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。　　35、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？　　答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。　　36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？　　答：可以。　　37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？　　答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。　　38、做Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而Western Blot却不能？　　答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和免疫组化。　　39、如果是6&8转印膜，要加多少一抗？　　答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。　　40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。　　答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液　　41、跑电泳的时候配的胶总是&缩&是什么原因呢？是有的成分不对吗？　　答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。　　42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？　　答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE， 湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。　　43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？　　答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）.　　44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。　　答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。　　45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？　　答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。　　46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适？　　答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。　　47、做半定量Western Blot，内参&-actin，GAPDH哪个好？　　答：选用beta-actin就可以。　　48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？　　答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。　　49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉&，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？　　答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L.　　50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?　　答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。　　51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？　　答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。　　52、怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？　　答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55v，分离胶75v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶.　　53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?　　答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。
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谁有Western Blotting Protocol？
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免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤：
①蛋白质的电泳分离
②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域
③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
免疫印迹法原理示意图
第一阶段为SDS&聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，&二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
样本的制备
几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白质样品。例如，不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等。免疫印迹还可分析各种组织、器官或微生物等来源的粗制样品。
用于免疫印迹的样本种类繁多，处理的方法也有所不同，为了选择理想的处理方法，应当考虑细胞的类型和待测抗原的性质。
细菌表达蛋白质和样本制备
一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解，具体方法如下：
[试剂与设备]
（1）表达待检测蛋白质的细菌。
（2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
（3）2xSDS凝胶加样缓冲液：
100mmol／L Tris&HCl（pH6.8）
200mmol／L 二硫苏糖醇（DTT）
4％ SDS（电泳级）
0.2％ 溴酚蓝
不含有二硫苏糖醇（DTT）的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前须从1mol／L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。
（4）台式离心机。
（5）超声破碎仪。
（6）水浴箱。
（7）涡漩振荡器。
（8）加样器与吸头等。
[操作步骤]
（1）表达靶蛋白大肠杆菌经诱导适当时间后，用微量离心机以12 000g离心30s，收集1ml培养的菌体。
（2）吸取培养液，加入0.5ml用冰预冷的50mmol／LTris&HCl（pH7.4），振荡沉淀的菌体，
使之复悬，用微量离心机于0&C以12000g离心30s回收菌体。
（3）再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能使沉淀物不带有残留液体。
（4）加入25&l水，振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来，立即加入25&l 2XSDS凝胶加样缓冲液，继续振荡20s。
（5）样品在沸水浴中放置5min。
（6）采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切，根据所用超声处理仪的输出功率及其设定状态，以最大功率处理0.5&2min应能有效地将裂解液粘度降至可控水平；
（7）样品于室温以12000g离心10min，将上清液移至另一管中，弃沉淀物；
（8）吸取经剪切或超声处理的样品25&l电泳，剩余样品保存于&20~C备用。
快速裂解酵母细胞制备样本
使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。
[试剂与设备]
（1）待检测的酵母菌。
（2）25％三氯乙酸（TCA）
（3）1％SDS。
（4）丙酮。
（5）RIPA缓冲液：
50mmol／L Tris&HCl（pH7.5）
150mmol／L NaCl
1％ Nonidet P-40 （NP-40）
0.5％ 去氧胆酸钠
（6）玻璃珠（直径0.45&0.50mm）。
（7）台式离心机。
（8）水浴箱。
（9）涡漩振荡器。
（10）加样器与吸头等。
[操作步骤]
（1）0&C以12000g离心lmin，从lml培养物中收集细胞，弃上清液（当靶细胞为分泌型蛋白时除外）。
（2）用0．5ml 25％三氯乙酸（TCA）重悬细胞。
（3）按步骤1离心回收细胞，重悬于1ml 90％丙酮中。
（4）按步骤（1）离心，估算沉淀物体积，加入等体积1％SDS重新悬浮沉淀物。
（5）加入经酸处理的玻璃珠（直径0．45&0．50mm）至溶液的弯月面处。
（6）振荡悬液5次，每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却lmin，在相差显微镜下监测细胞
（7）用一烧红的皮下注射器针头（23号）在微量离心管的顶盖上穿一小洞，以防加热过程中玻璃球冲出离心管。
（8）在沸水浴中加热3min。
（9）把玻璃珠转移到另一个微量离心管中，用0.5ml RIPA缓冲液洗涤原离心管，并把洗液合并于内装玻璃珠的管中。
（10）在微量离心管底部打一小洞，回收细胞提取液，这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上，把如此重叠的一对微量离心管，于4&C以2000g离心2min。
（11）回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管，于4&C12以2000g离心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一个微量离心管中，&20&C贮存备用。
[注意事项]
酵母细胞提取液储存于&20&C一般是稳定的，但是，如果待测蛋白被水解，则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂，并保存于0&C。
哺乳动物细胞和组织的样本制备动画0
哺乳动物细胞和组织的样本制备（点击播放）
哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。
这里介绍其中两种方法：①对单层细胞的处理方法 ②对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法
对单层细胞的处理方法
[试剂与设备]
（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）。
（2）1XSDS凝胶加样缓冲液（参见&&）。
（3）水浴箱。
（4）吸管、细胞刮棒等。
[操作步骤]
（1）用磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗细胞2次，弃去洗液并吸净残余的PBS液体。
（2）如直径为90mm的平皿，则加人100-200&l加热到85&C的1XSDS凝胶加样缓冲液溶解细胞，用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中。
对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法
[试剂与设备]
（1）悬浮缓冲液的配制：
0.1mol／L NaCl
0.01mol／L Tris&IICI（pH7.6）
0.001mol／L EDTA（pH 8.0）
1&l／ml Aprotinin
100&g／ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
（2）2XSDS凝胶加样缓冲液（参见&细菌表达蛋白质和样本制备&）。
（3）台式离心机。
（4）吸管或真空抽吸装置。
（5）加样器和吸头等。
[操作步骤]
（1）取1s组织或109细胞，加lml冰预冷的悬浮缓冲液分散细胞或组织碎片（把细胞悬浮于上述缓冲液是为了防止加入2XSDS凝胶加样缓冲液时形成不溶性团块，这一步应使用冰预冷的悬浮缓冲液而且操作应尽可能迅速，以减少蛋白质降解。大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用镊子分开或用剪刀剪碎。）
（2）于4℃以3000g离心5min，估算离心管底部沉淀物的体积。
（3）吸出上清液，用连接于抽真空装置的一次性使用吸头把管壁上的液滴吸净。
（4）尽快加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液。
[注意事项]
PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸人、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之，凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20&mol／L的PMSF水溶液的半寿期大约为35min，PMSF通常配成10mmol／L或100mmoL／L浓度的贮存液（1.74或17.4mg／ml溶于异丙醇中）保存于-20℃。
免疫沉淀蛋白的样本制备
一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时，用于免疫沉淀的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质，如果清楚该复合物的性质，并知道应该使用何种抗体时，这种方法就非常有用，为研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用提供了一种有效的方法。
[试剂与设备]
（1）样品缓冲液。
Tris／Glyeine SDS&PAGE样品缓冲液是：2％SDS，100mmol／L DTT（取自&20&C存放的lmoL／L贮存液，临用前加入），60mmol／L Tris（pH6.8），0.01％溴酚蓝和10％甘油。
（2）水浴箱。
（3）加样器和吸头等。
[操作步骤]
（1）将样品缓冲液加人吸附有抗原和抗体，并经过洗涤的A蛋白或C蛋白微珠中。使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为2：1&5：1左右更好，但一般不超过10：1.
（2）样品置70&C水浴加热至少5min。除特殊情况外，在凝胶内加样之前不必去除微珠。
（3）样品既可立即使用也可冻存。&20&C存放的样品可稳定保存数月。
[注意事项]
（1）对照设置：实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样品。通过两者比较可以鉴别抗体所形成的特异性条带和非特异性条带（例如，来自于重链的条带）。此外还应该包括含有已知的或标准量的待测抗原的阳性样品，阳性对照可以是含有已知或标准量待测抗原的任何样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或来源于已充分鉴定的细胞系。该样品不必经过免疫沉淀但应在临近的胶道和其他样品同时上样电泳。这样能够提示免疫印迹是否成功，并对抗原的相对分子量进行精确比较。如果阳性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计待测样品中抗原的含量。
（2）常见问题与解决方法：有一个值得注意的问题，将免疫沉淀制备的蛋白用于免疫印迹时，来自免疫沉淀的抗体会出现在印迹膜上。该抗体可被二抗试剂检出。通常抗体重链和轻链的大小并不干扰待测抗原的鉴定。然而，若待测抗原的大小在50kD或25kD左右（大约为重链和轻链多肽的大小），则难以对待测抗原进行鉴定。出现这种情况，有两种解决办法：一是可将免疫沉淀抗体共价结合在A蛋白或C蛋白微珠上；其二是采用直接检测技术进行测定。
蛋白质凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板，见图2.SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。
图2 SDS-PAGE凝胶分层示意图
待分离蛋白质样品在电泳中的泳动速度，或相对迁移率（Mr）与蛋白质本身性质（如分子大小）、凝胶孔径和电泳条件（如电流、电压）等密切相关，蛋白质结合大量的SDS后，各组分之间的的形状和电荷差异被抵消，此时蛋白质在电场中泳动速度的快慢，仅与各自分子量的大小有关。因此，可根据下列公式计算分子量大小:
lgMW=lgK&bMr
其中，MW为蛋白质的分子量，K为常数，Mr为相对迁移率，b为斜率。将已知分子量的几种标准蛋白质在电泳中的相对迁移率对其分子量的对数做图，即可得到一条蛋白质分子量校正曲线。根据待测样品的相对迁移率，可由校正曲线查到其分子量大小，蛋白质样品中加SDS煮沸后，蛋白质发生变性，为保护和还原二硫键，尚需加还原剂2-巯基乙醇（2-ME）或二硫苏糖醇（DTT）。蛋白质变性使亚基聚合形式存在的蛋白质解聚成单个亚基。因此，对于一个纯化蛋白质，可经SDS-PAGE确定其亚基种类、数目及大小。上述蛋白质分子量测定更确切地说是蛋白质分子各亚基分子量的大小。
丙烯酰胺凝胶孔径对电泳速度及分离效果影响很大。凝胶孔径的大小取决于丙烯酰胺（Aery）单体及N，N&亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及比例。总胶浓度（T）可在3％～30％范围内变动，T为8％～15％的凝胶，适用于大多数蛋白质样品的分离。交联度（C）是反映凝胶聚合情况的一个指标。凝胶聚合过程中，Acry单体之间形成延伸的多聚链，并通过Bis的作用，连接和交叉成网状结构，最终成为肉眼可见的凝胶。催化剂过硫酸铵（APS）和加速剂四甲基己二胺（TEMED）直接影响凝胶聚合质量。二者加量过多，会使Acry单体聚合链较短，聚合不充分，胶的脆性增加；反之，如加量过少，则聚合速度大大降低，甚至只出现所配制的胶溶液黏度稍增加、无胶状物出现的现象。见图3.
图3 相对迁移率与分子量对数关系简图
根据电泳的目的和要求及样品的特点，可采取恒流或恒压条件进行电泳。
由于印迹技术需将蛋白质成功地从胶中转移至膜上，因此，选择合适的凝胶甚为重要。一般情况下，丙烯酰胺和交联剂的比例越低，转移就越易进行。超薄胶转移的速度快，而且彻底。通常，应根据目的选择厚度、大小均适合的凝胶。若想寻求蛋白质的最佳分辨力，长胶的效果较好，使较大分子量的蛋白质更好地分离。若想达到最大的灵敏度，胶的厚度可增加到1.5mm，并且在不发生变形的前提下，尽量提高蛋白的上样量。若主要考虑的是分离速度，则选用微型胶，厚度为0.5mm。表1显示SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围。
表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
试剂与器材
（1）Acry／Bis贮存液：29.2gAcry，0.8gBis，加60m1双蒸水充分溶解后，再加双蒸水至100ml。过滤后，于4℃避光保存。
（2）分离胶缓冲液：1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8：18.15g Tris，溶于60ml双蒸水中，用1mol/L HCl调pH至8.8，加双蒸水至100ml，于4℃保存。
（3）成层胶缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl，pH6.8：6.0g Tris，溶于60ml双蒸水中，用 1mol／LHCl调pH至6.8，加双蒸水至100ml，于4℃保存。
（4）10％APS：1.0g APS加10ml双蒸水溶解，一20℃分装冻存，或新鲜配制。
（5）TEMED：原液。
（6）10％SDS：10g SDS溶于80m1双蒸水中，加热搅拌至完全溶解，定容至100ml。室温保存。
（7）50％甘油：50ml甘油加50ml双蒸水，配成100ml溶液。
（8）样品缓冲液（6X）：成层胶缓冲液1.Oml，50％甘油0.8ml，10％SDS 1.6ml，2-ME0.4ml，0.05％溴酚蓝0.2ml，双蒸水4.0ml。混合均匀后，分装冻存。
（9）电极缓冲液（1X）：pH8.3：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加双蒸水至1000ml。
（10）蛋白质分子量标准晶：蛋白质分子量标准（高分子量和低分子量）均有商品供应。
（11）垂直板电泳装置：电泳槽（JM&250型，大连）。
（12）电泳仪。
（13）玻璃微量进样器：加样枪配扁而长的加样头亦可。
操作步骤 【动画】
（1）将两块玻璃扳组成的灌胶模具（其中一块上口带有凹槽，另一块内面两侧粘有凝胶板隔离胶条，胶条厚度为0.5mm、0.75mm、1.0mm，按所需凝胶厚度选择）洗净、晾干，按图4安装好。
图4 灌胶模具安装示意图
（2）选择合适的分离胶浓度，按表2配制所需分离胶溶液。
表2 分离胶溶液配方
（3）将分离胶液混合后缓慢倒入玻璃板之间，并即刻在胶表面用滴管沿凝胶板内壁滴加2～3mm高的水饱和正丁醇（无水乙醇亦可），以防止空气中的氧扩散进入胶液，影响聚合（胶液与正丁醇分界面可见清晰的折光线）。
（4）待分离胶聚合后（约30～40分钟），倾去表面液体，用少量分离胶缓冲液洗2～3次，多余的液体用滤纸条吸干。
（5）配制成层胶缓冲液：3.05ml双蒸水，0.65ml Acry／Bis液，1.25ml成层胶缓冲液，50&l 10％SDS 50&l 10％APS，5&l TEMED。总体积5.0ml，T为4％。
（6）将成层胶液混合后，缓慢加到分离胶表面，至凹口玻璃板上缘。小心插入梳子（梳子应在步骤1安装完毕后，预先试一下是否合适），注意排除气泡。
（7）30分钟至1小时后，小心拔出梳子，去掉四周封闭乳胶管，将凝胶板与上、下电泳槽连接好。
（8）上层电泳槽中加电极缓冲液没过加样孔，并用电极缓冲液冲洗加样孔。如个别孔发生扭曲，可将玻璃微量进样器针头插入孔中，把孔间的短胶柱推正。
（9）待测蛋白质溶液中按1：4比例加样品缓冲液，如为沉淀及冻干粉，样品缓冲液应稀释4～5倍后加入，并使样品充分溶解。蛋白质分子量标准按商品说明书处理。沸水浴中煮3～5分钟后上样。
（10）恒压电泳。样品在成层胶中泳动时，电压为100V，进入分离胶后，电压增至150～200V（约15V／em）。为防止电泳产热过多，应外接冷却水装置。
（11）当样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂移至凝胶底部时，终止电泳（约3小时左右）。取出凝胶板，小心将两板之间的胶移至较大的表面皿中。此凝胶可直接进行染色观察；亦可进一步通过免疫印迹技术，对待测蛋白质进行检测。
（1）分离胶中加入少量甘油可增加胶的柔韧性，使胶不易破裂。
（2）配制胶液时，最后加APS和TEMED，加入后即刻使胶液充分混合，但要防止剧烈摇晃而产生气泡。
（3）表中所加试剂的量是依据灌制面积为14cm&l4cm，厚度为1mm的凝胶而设定，其他规格的凝胶板试剂用量可参考此表，进行适当调整。
（4）Acry、Bis具有神经毒性，实验中应带手套操作。
（5）可选用恒流条件进行电泳，如：样品在成层胶中泳动时，电流为30mA，进入分离胶后，电流增加至40mA；亦可以4～5mA低电流，电泳过夜，次日增加电流至10～12mA 5～10分钟，以改善样品的少量扩散。
（6）待分离样品的质、量直接影响电泳效果，如：若电泳出现波浪线，则说明上样量过多，应减少上样量；若样品中含盐浓度过高，应先透析，以便除掉盐分；若样品黏度过大（如细胞蛋白质），最好先用超声波破碎染色体DNA后再电泳。
（7）如果待分离样品中蛋白质组分分子量的变化幅度大，则应考虑用梯度发生器制备5％～20％的梯度胶，以达到满意的分离效果。
基本原理 【动画】
将蛋白质从凝胶中转印致膜上（点击播放）
电泳后蛋白质样品转移的方法，包括半干式转移、湿式转移等。各种转移方法原理相似，都是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成&Sandwich&样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极（连接方式如图5所示）。
图5 转移单位示意图
可用于免疫印迹的固相载体有多种，硝酸纤维素膜、尼龙膜、带正电荷的尼龙膜及PVDF（聚亚乙烯双氧化物）膜。硝酸纤维素膜最为常用，具有结合能力强，膜不需要活化，背景浅，能进行多次免疫检测并可用常规染色方法，功能基团寿命长等优点，但极易破碎不易操作。尼龙膜软且结实，较硝酸纤维素膜易操作，具有与蛋白质或蛋白质-去污剂混合物有很高的结合力，每平方厘米可结合480pg蛋白（而硝酸纤维素膜只能结合80Pg），因此灵敏度高，背景也高，因为其高电荷密度使对其非结合区进行封闭较为困难。带正电荷的尼龙膜能有效地结合低浓度的小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖，当转印液中有SDS时，蛋白质容易从膜上泄漏，用甲醇固定能提高蛋白质在尼龙膜上的保留指数。PVDF膜在制备多肽供蛋白质化学分析中最为常用。在进行蛋白水解和序列分析时，通常是先将蛋白质结合在PVDF膜上。
将凝胶中的蛋白质转印至膜上的方法很多。目前常用方法是电洗脱或电印迹。其主要优点是转印迅速、完全。电洗脱有两种方法：一种是湿转印法，即将凝胶-膜夹层组合完全浸入转印缓冲液中；另一种是半干转印法，即将凝胶-膜夹层组合放在浸有转印缓冲液的吸水纸之间。前者是将夹层组合放人有铂丝电极的缓冲液槽中。而后者是将凝胶-膜夹层组合置于两个石墨平板电极之间。这两种转印的装置效果均较好，可根据实验室条件来选择。
试剂与器材
（1）电泳凝胶。
（2）转移缓冲液：pH8.1&8.4：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇充分溶解后，加双蒸水定容至1000ml。
（3）TBS缓冲液：1.21g Tris，8.77gNaCl，加HCl调pH至7.4，加水定容至1000ml。
（4）TTBS缓冲液：在TBS中加入Tween&20，浓度为0.1％，4℃保存1个月。
（5）封闭液：1.5g脱脂奶粉溶于50ml TTBS中，现用现配（用1％～3％的BSA，或10％胎牛血清亦可）。
（6）特异单克隆抗体：用封闭液适当稀释。
（7）酶标第二抗体：辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）标记。
（8）蛋白质转印膜：NC（硝酸纤维素）膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，或尼龙膜等均可。
（9）显色底物。
（10）恒温振荡器。
（11）半干式电泳凝胶转移仪。
（12）Whatman 3mm滤纸。
（13）手套。
（14）孵育及显色用塑料盒。
（15）塑料袋。
（16）塑料封口机
操作步骤（半干式转移）
（1）电泳后的凝胶先切除成层胶及需要进行凝胶直接染色的孔道部分，并将胶剪一小角作为定位标记，然后放在转移缓冲液中平衡30分钟左右。
（2）将转印膜1张及6张Whatman滤纸剪成与胶同样大小。转印膜用前需在转移缓冲液中平衡10～15分钟，滤纸用前在转移缓冲液中浸湿即可。
（3）由下至上将3层滤纸、膜、凝胶及3层滤纸依次放好。每放一层都应注意排除气泡。如有气泡，可用光滑的玻璃棒或试管在各表面缓慢滚动，予以排除。
（4）将转移装置连接好，接通电源。恒流下转移，0.8mA／cm2，转移30分钟至1小时。
（5）关闭电源，取出膜，然后用双蒸水漂洗l～2分钟，放在滤纸中干燥备用。注意膜上要做好标记。
（1）将膜放在塑料盒中，加入适量封闭液，于37℃恒温振荡器上放置1小时，或4℃过夜。
（2）将膜转入塑料袋中，加入用封闭液稀释的第一抗体，于37℃或室温孵育反应1小时。
（3）剪开塑料袋，倾去第一抗体液体，用镊子将膜移至塑料盒中，加TBS洗3次，每次15分钟。
（4）加入稀释好的酶标第二抗体，继续在37℃或室温孵育反应30分钟至1小时。
（5）同步骤（3），洗膜。
（6）加底物显色液。此步骤一般要求避光进行。最好即时检查一下，以控制显色程度，防止本底过高及出现非特异条带。
（7）终止反应，用双蒸水大量冲洗，然后将膜放于双层滤纸中干燥保存。
（1）如采用PVDF膜，使用前应在甲醇中浸泡一下，再移至转移缓冲液中平衡。另外，PVDF膜在检测时，采用TTBS缓冲液。
（2）电泳凝胶一般可重复转移1次，以获得两张相同的膜，第2次转移的时间可略延长。
（3）如待分析的蛋白质分子量大，转移时间也需延长。
（4）上述显色检测方法仅给出了基本步骤，采用不同检测系统，需按厂家说明书具体操作。
（5）电泳转移操作时，保证滤纸、膜、凝胶其间无气泡存在是实验的关键步骤。因即或有微小的气泡残留，电泳时局部温度升高，气泡膨胀会严重影响印迹结果。
转印后切取印迹膜
有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表3表明两种染料的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价廉和具有可逆性，在封闭过程中，染色易消褪，且不干扰进一步的检测。
在某些情况下，可能想用印迹中的较高分子量区域来检测一种抗原，用另一个区域来检测另一不同分子量的蛋白质。为了使印迹中不同的区域正好对应于相应分子量的范围，这需要在对照泳道中加入已知分子量的蛋白质。这样可方便地在印迹中找到适当的区域并将其剪下。
使用预染的分子量标记，可为转印后切下所需印迹提供良好的指示，此类标记已商品化，但是比丽春红S染色法昂贵。标记中的颜色除了增加成本对实验并无不良影响，而且在泳动时非常漂亮。
表3 用于免疫印迹染色的染料
印迹膜蛋白染色
[所需试剂]
（1）2％丽春红S浓贮存液（3-羟基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2，7&萘二磺酸）：溶于30％三氯醋酸和30％磺基水杨酸中。贮存液可在室温下稳定存放1年以上。
（2）PBS。
[操作步骤]
（1）在染色之前，先配制丽春红S的应用液。即将2％的丽春红S浓贮存液用1％醋酸1:10稀释即成为应用液（注意：如果使用硝酸纤维膜，须将丽春红S应用液更换为用水1:10稀释）。
（2）用丽春红S应用液将PVDF膜洗1次。
（3）加入新鲜稀释的丽春红S应用液，并在室温下搅动5～lOmin。
（4）将PVDF膜放人PBS中漂洗数次，每次1～2min，并更换PBS。
（5）根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记，至此PVDF膜可用于封闭和加入抗体。
免疫检测主要取决于抗原抗体的特异性，特别是能够识别膜上变性的和固定化抗原的抗体。因印迹膜上有非特异性吸附蛋白质的位点，因此需进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附。将印迹膜与一定浓度的不参与特异性反应蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭。然后通过抗体与膜上抗原的特异性结合来定位抗原。抗原可用易观察的标记的抗体进行检测。抗体本身可以标记，直接用于检测抗原，但更为常见的是，使用的抗体是非标记的，而用标记的二抗采进行抗原定位。
常用的标记方法有酶联法，一般是用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，具体的介绍见本书第四章&免疫标记技术&。近年来，化学发光（CL）法已成为常用的方法之一。该法是基于环化二脂酰肼（cyclic diocyhydrazide）的化学氧化作用，生成一种不稳定的中间产物，当其衰变时即可发光。发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。化学发光法比过去使用的显色或放射活性检测法更加灵敏。尽管对灵敏度增加的幅度还有很多争论，但一般认为比显色法大约增加20倍，比放射活性检测方法约增高 7倍。该法的关键是使用了辣根过氧化物酶偶联物作为二抗或二级试剂。辣根过氧化物酶可与抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白C或其他可与一抗特异结合的试剂共价结合。在过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶催化鲁米诺（氨基苯二酰一肼）氧化后即可发光。
除了蛋白质样品的电泳分离过程之外，在进行免疫印迹操作之前，还考虑下面两个问题。
印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭
表4 总结了常用的封闭液及其优缺点。尽管这些封闭液在某些情况下使用较为满意，但是仍需要仔细选择以确保其能适合于检测试剂。几乎适合于所有检测系统的两种封闭缓冲液是脱脂奶粉和牛血清白蛋白。若蛋白质封闭液造成本底过高或干扰检测，则可试用吐温20封闭液。
表4 常用的封闭液
*若不愿每次新鲜配制封闭缓冲液，应加入0.01%硫柳汞制剂作为防腐剂。避免使用叠氮化钠，因其能抑制辣根过氧化物酶的活性。
直接与间接检测方法
直接法是指用标记的第一抗体（一抗）来进行检测的方法，用这种类型的抗体对膜上抗原进行免疫检测的本底较低，并且在同一张印迹膜上可同时使用来源或特异性不同的多种抗体，但灵敏度不如间接法。间接检测是指先使用非标记的一抗，然后用可与一抗结合的标记第二抗体（二抗）进行检测的方法。由于二抗分子是多价的，具有放大效应，因而灵敏度较高。因此，除非需要直接检测抗原的特异性，否则最好是选择间接法进行免疫印迹测定。通常选用与辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白抗体商品试剂来检测一抗，分别针对不同种属来源的一抗。这样，一个实验室只需备用针对小鼠，大鼠，家兔和其他一抗的少数几种通用试剂即可满足各种免疫印迹实验要求。
下面以间接检测法为例介绍免疫检测的方法。
间接检测法
[准备工作]
在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，对不同来源的抗体，其特异性林的浓度都不相同。因此，对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例，预先滴定二抗对实也有帮助，一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可用商家提供的浓度进行检测。
[材料与试剂]
（1）PBS：称取8g NaCl；0.2gKCl；1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4，加蒸馏水800ml，用HCl调节溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034X105Pa高压下蒸气灭菌20min，室温保存。
（2）封闭液（见表4）。
（3）1%BSA/PBS。
（4）一抗试剂和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的二抗试剂（通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体）。
（5）碱性磷酸酶底物溶液:
1）NBT（氮蓝四唑）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5gNBT。
2）BCIP（5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5g BCIP。
3）碱性磷酸酶缓冲液：100mmol／LNaCl；5mmol／L MgCl2；100mmol／L Tris-HCl（pH9.5），置密闭容器中保存，此溶液稳定。
4）取66rdNBT溶液与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33plBCIP溶液。
5）辣根过氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol／L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg 3&3，&二氨基联苯胺，加入lml 0.3％（w／v）NiCl2或CoCl2，用Whatmanl号滤纸过滤以除去沉淀，加入10yB0％H202混匀后立即使用。此溶液须在临用时配制。
[操作方法]
（1）用PBS漂洗印迹膜数次。
（2）加入一种封闭液（见表4）。注意：不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行实验时，这会给解释实验结果造成一定的混淆，也给亲合素／链霉亲合素检测的应用带来一些问题。某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。若无信号或检测背景较高，则需尝试不同的封闭缓冲液。
（3）室温下搅动孵育。一般孵育20min～2h或4℃过夜较好。
（4）从封闭缓冲液中取出印迹膜，用PBS漂洗3次，每次5min。
（5）加入工作浓度的一抗溶液。每张15X15cm的印迹膜用量为10ml。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液，例如1％BSA／PBS。孵育可在浅盘或塑料袋中进行。在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有人认为4℃孵育过夜（12～18h）可提高灵敏度。
（6）用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min。 ，
（7）此时，印迹膜便可加人工作浓度的标记的二抗溶液。可在浅盘或塑料袋中室温孵育1h。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如 1％BSA／PBS。商品化的酶标二抗应在0.5～5&l／ml浓度之间使用（通常将商品试剂原液稀释成1：200～1:2000的应用液）。用辣根过氧化物酶标记的试剂
须用不含叠氮钠的封闭液稀释。
（8）用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min。
（9）将经漂洗的印迹膜移至另一干净浅盘中，按印迹膜面积加入0.lml／cm2的底物溶液（若使用碱性磷酸酶标记的二抗，用碱性磷酸酶底物溶液，若用辣根过氧化物酶标记的二抗则用辣根过氧化物酶底物溶液），于室温轻轻摇动，待蛋白条带的颜色深度达到要求（约2-20min），用水略为漂洗，放人PBS中。
（10）拍摄照片，留作永久实验记录（过氧化物酶染色的蛋白条带经日光照射数小时后颜色将退去）。
抗体的性质
影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表5显示各种抗体的优缺点。
表5 抗体的选择
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Western-Blot操作流程
（一）母液
1.0mol/L Tris&HCl Tris (MW121.14) 30.29g
蒸馏水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl
7.4 约17ml
7.6 约15ml
8.0 约10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO&12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDS SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
1.5mol/L Tris&HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
0.5mol/L Tris&HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
超纯水至 100ml
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20 Tween20 20ml
蒸馏水至 100ml
混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris&HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100&g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50&l）。
（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO 19ml
0.2 mol/L NaHPO4 81ml
蒸馏水至 2000ml
（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20&的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便）
G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg
95％乙醇 50ml
磷酸 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸馏水至 100 ml
高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris&HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris&HCl（pH6.8） － 1.26ml
10％SDS 100 &l 50 &l
10%AP（过硫酸胺） 50 &l 25 &l
TEMED 5 &l 5 &l
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris&HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
（可以配制成10&电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）
（可以配制成2&转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
10X丽春红染液 丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
蒸馏水至 100ml
使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液 1 mol/L Tris&HCl（pH7.5） 10ml
蒸馏水至 1000ml
（可以配制成10&TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
TBST缓冲液 20％Tween20 1.65ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液 脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g
TBST 100ml
最好现用现配。
洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(&-巯基乙醇) 700 &l（通风厨里加）
0.5mol/L Tris&HCl（pH6.8） 12.5ml
超纯水至 100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
（可用可不用）
显影液（5X） 自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠（无水） 22.5g
碳酸钠（无水） 33.75g
溴化钾 20.95g
补水至 500ml
配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。
（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）
定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠（无水） 15g
冰乙酸 12.6ml
钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加水定容至1000ml，室温保存。
（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）
抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多
买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。
化学发光试剂 分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合。
（一） 蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、 按1ml裂解液加10 & PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4、 每瓶细胞加400 &含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200&的裂解液，按照上述操作，直接用200&裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）
（2） 组织中总蛋白的提取：
1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、 加400 &单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。
3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、 用枪洗干上清后，加100 &裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
（二） 蛋白含量的测定
（1） 制作标准曲线
1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0&g，2.5&g，5.0&g ，10.0&g ，20.0&g ，40.0&g。
3、 按下表在各管中加入各种试剂。
1mg/ml BSA
0.15mol/L NaCl
G250考马斯亮蓝溶液
4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。
（2） 检测样品蛋白含量
1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 &l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、 取一管考马斯亮蓝加95 &l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5&待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 &l样品含的蛋白量。
（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）
（三） SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）
2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩
减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（冲洗的话个人感觉可以使用5ml的针筒，当然操作不能太粗暴了）
6、 测完蛋白含量后，计算含20-50&蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200&l的EP管中，加入5&SDS 上样缓冲液至终浓度为1&。（上样总体积一般不超过15&l，加样孔的最大限度可加20&样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40&l，胶做得很好的话50&也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。（本人心得：可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：1.EP管容易炸开，样品丢失、2.容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量）
7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）
（3） 电泳：电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。（本人为了加快速度，浓缩胶时用80-100V跑，到分离胶以后用150-200跑，结果也不错，总时间2h左右）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas的比较好，就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好，不要局限于此说明）。
（四） 转膜
（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好）
（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上，注：个人感觉就垫1张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上
另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的&三明治&千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）
（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜）（2.硝纤膜建议使用0.22&的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件）（4.转膜时电极方向注意是膜正胶负）
（6） 转完后将膜用1&丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。（一般不需要做这步）
（五） 免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体）
（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
（六） 化学发光，显影，定影
（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2） 在暗室中，将1&显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（如果使用柯达的显影定影液，时间很快的，显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子，然后再放到定影液中进
行定影，这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七） 凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
回答者： 一级 一星助者
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