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实验方法原理
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、实验材料准备
动物：各个品系的小鼠2-4只。
试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。
器械：一次性注射器、手术器械。
二、实验方法
如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。
用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。
很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。
严格无菌操作，在超净台内进行。
为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。
吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。
(共3个问题)
相关实验Protocol
谁能提供实验帮助？
谁做这个实验？
简单明了。很实用，谢谢
觉得很简单
先关注一下
作为初学者，觉得很难控制消化的程度~还有酶的浓度和时间？
应该讲述一些具体操作！
取腹腔巨噬细胞比较难取，难消化，不好掌握细胞数！但研究很有意义！
谁关注这个实验？
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在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验中,影响吞噬细胞吞噬指标的实验因素有哪些
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注入异物量,免疫原性,小鼠体质
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【求助】小鼠腹腔巨噬细胞的分离提纯
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这个帖子发布于4年零354天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
我在做小鼠腹腔巨噬细胞分离提纯的实验，按照文献上说的：1. 提前2-4天腹腔注射4%巯乙基淀粉肉汤2ml/只小鼠。2. 引颈处死小鼠后，腹腔注入5mlPBS，按摩近半小时。3. 抽出细胞悬液，洗涤后加入培养基，贴壁提纯1-2小时。4. 胰酶消化贴壁细胞并收集。但是，我的试验中总是收集不到正常数量的细胞，按照文献所述，经过刺激的小鼠腹腔应该可以获得1*107细胞的，但是我在实验中仅仅在1-2*106，有的时候甚至更少，很困扰，希望有做过的同仁指点啊！谢谢！
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1. 提前2-4天腹腔注射4%巯乙基淀粉肉汤2ml/只小鼠。2. 引颈处死小鼠后，腹腔注入5mlPBS，按摩近半小时。3. 抽出细胞悬液，洗涤后加入培养基，贴壁提纯1-2小时。4. 胰酶消化贴壁细胞并收集。不知道你的实验目的是什么
我们当时用氧化低密度脂蛋白刺激后
用油红O染色
做AS相关模型首先确定你的肉汤有没有问题
步骤细节上需要改进
个人认为 4%(质量体积比)巯基乙酸盐肉汤：用去离子水配制，并经高压蒸汽灭菌（121℃，20min），贮存于4°C。肉汤配制完毕后要立即高压灭菌4°C保存，常温下可见其变色并酸败。颜色会变绿不知道你第四步为什么要用胰酶消化？不理解我当初是用肉汤刺激96h 可以达到下表的量刺激剂、预期收益和腹膜细胞的组成
腹腔细胞的类型
刺激剂的量
注射到收集细胞的时间
每只小鼠预期的细胞数
贴壁前MΦ的百分比
贴壁后MΦ的百分比
腹腔固有细胞
巯基乙酸盐刺激的腹膜渗出细胞
2-3ml 4%的Brewer’s巯基乙酸盐
96h（-120h）
15-25×106
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yancunliu 终于成功了，向大家汇报：1. 灌洗液要加入FBS，我加的是3%，这样才会促使巨噬细胞向外游离；2. 灌洗的时间要足够长，>30min，以保证足够的时间向腹腔游离；3. 将细胞灌洗液抽出后要置于冰上，或者抓紧时间离心重悬，减少巨噬细胞在离心管上贴壁。4. 小鼠周龄的问题还不知道有无影响，自己感觉最好是大一点的，25g比较好。5. 肉汤的问题，新配置的要比放置很久以后的效果好，但是这与国外文献上说的好像又不太一致，这个无解。另外，这段时间还检索到了一些国外的分离巨噬细胞的文献，在附件里。另外还有一个国外的视频http://www.jove.com/details.php?id=1488一个印度学者做的。就是这些，与大家共勉！加油！你好，你说的灌注液是在注射完3% Thioglycollate Broth三天后，处死小鼠时用来冲腹腔细胞的吗？意思是DPBS或者RPMI1640加入3%FBS？我最近也在重复这个实验，提前三天注射3% Thioglycollate Broth（sigma）2ml，三天后处死小鼠取腹腔巨噬细胞，总是只能取到2×10~6cell。我也尝试连续三天每天注射1ml Thioglycollate Broth，第四天处死取腹腔巨噬细胞，也只能取到2×10~6cell。文献报道不论哪种方法注射Thioglycollate Broth可是达到10~7cell，楼主你看我的方法哪里需要改进吗？十分感谢啊~~
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这个实验我一直在做，一般3%硫乙醇酸盐培养基用2 ml。4d以后一般达到4*10的6次。建议不要用胰酶消化，直接用细胞刮刀好了。不同小鼠细胞可以混在一起培养的，不然怎么调整细胞数量。呵呵。
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【求助】小鼠腹腔巨噬细胞是如何鉴定的？
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这个帖子发布于11年零166天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
小生正在做小鼠腹腔巨噬细胞提取、纯化、与鉴定。有问题想请教各位高手。
我分离出腹腔细胞后，培养两小时，弃培养液，得到贴壁细胞。但贴壁后细胞是不能重悬，而且胰蛋白酶也是不能消化下来的，那么采用什么方法鉴定所得细胞是不是我所要的巨噬细胞，而且怎么判断其纯度。我用的是六孔培养板，曾试图就板染色但效果不佳。
请问有何方法能够做到。谢谢！！！
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原代腹腔巨噬细胞是不容易消化的，胰酶对它是无效的。国外有用EDTA+利多卡因消化的，也可以用cell scraper或rubber policeman将细胞刮下来，具体可参见国外比较经典的两本书《basic cell culture protocols》和《manual of macrophage methodology》。纯化鉴定可以用流式细胞术，取获得的细胞样品上流式细胞仪，检测巨噬细胞表面标记CD86+和/或F4/80。
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aspen26 编辑于
你在培养板上放一个小玻片，贴壁后取出染色试试，在其它原代细胞是这样做的。
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谢谢yuyu05,我现在就是将灭菌后的小载玻片置入培养皿，24小时后取出分别做了HE和GIEMSA染色，但怎么才能判断其纯度呢？也没有很好的把握说就是巨噬细胞，我看别的好多文献上也是这样写的，取出细胞经HE或GIEMSA染色后，鉴定纯度》95%。这样做可以吗？我觉得挺含糊希望大家指点啊。谢谢！！！
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飘泊 编辑于
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【交流】小鼠腹腔巨噬细胞实验
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最近在做小鼠腹腔巨噬细胞实验，想考察药物对巨噬细胞吞噬能力的影响。我先是用LPS作为阳性药做预实验，做了三次了，结果发现LPS组没什么作用（浓度从10ng~到20ug/ml都做了），甚至比不加药组的巨噬细胞吞噬中性红的能力还要弱，我在显微镜下看了一下细胞，比较了一下，发现LPS组的细胞有部分是圆的，没有未给药组的细胞贴壁的多。LPS是在sigma公司买的。不知道有没有做过类似实验的朋友，求帮助，很感谢啊！
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同意战友的意见，建议不要注射肉汤，直接用健康小鼠，处死后直接取腹腔巨噬细胞，虽然量会少很多（但是一只小鼠足够铺一个6孔板），但是理论上这个是没有高度激活的，可以被LPS诱导（本人没有做过LPS，但是做过oxLDL，确定可以用此方法）祝好运！
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你是腹腔注射？？？？
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不是，是体外实验，从腹腔提取出来的。
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