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怎么减少组胺的释放和数量？
病情描述：
请问如何减少身体组胺的数量或者什么东西可以杀死组胺，自由基可以吞噬肥大细胞而释放组胺是这样么？人的身体自由基太多的话，它是不是会破坏细胞造成免疫力紊乱，内分泌失调，等因素？还有组胺大部分存在于肥大细胞里面那么肥大细胞又是一个什么角色？
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医生建议：你说的这个情况一般关键问题是不要接触过敏原，不要吃辛辣刺激的食物，这些是解决根本问题的做法，如果有必要的话也可以吃一些抗过敏的药物，你说的肥大细胞它也是过敏导致的，
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肥大细胞在应激性肠屏障损伤中的作用
成都市第三人民医院消化内科，四川 成都 610031
[关键词] 肥大细胞；应激；肠屏障
Effects of mase cell on stress-induced intestinal barrier dysfunction
[key words] M S Intestinal barrier
[First author’s name and address] TANG Yu, Department of Gastroenterology,&Chengdu 3rd&People's&Hospital, Sichuan, Chengdu 610031, China
中图分类号：R574&& &&文献标识码：A&&&&&& &收稿日期：
文章编号：(00－00
1肥大细胞的生物学特性
1.1&来源及分型&& 肥大细胞是一种重要炎症效应细胞，来源于骨髓多能造血干细胞的肥大细胞前体，经过血液循环进入组织内。正常情况下，肥大细胞广泛分布于全身结缔组织、呼吸道和消化道黏膜、血管和淋巴管周围，肥大细胞的这种分布可使其产物被血管内皮细胞、呼吸道、胃肠道平滑肌细胞所利用。动物肥大细胞分为黏膜肥大细胞MMC和结缔组织肥大细胞CTMC。人类肥大细胞分为含类胰蛋白酶的MCT型及含类胰蛋白酶和胃促胰酶的MCTC型。MCT与MMC相似，主要位于肠黏膜固有层和肺脏，而MCTC与CTMC相似，主要位于皮肤和肠黏膜下层。肥大细胞在循环中以未分化的定向前体形式存在，易于聚集在炎症部位，并增殖为成熟肥大细胞[1]。
1.2&肥大细胞的作用机制 &&MC是神经-免疫-内分泌网络调节过程中的关键细胞，参与机体多种生理及病理过程的调节。在炎症反应中，一些细胞因子诱导MC产生脱颗粒作用，释放炎性介质，分泌系列细胞因子影响机体内多种生物反应过程[2]，包括：①淋巴细胞反应如黏附、趋化、IgE生成、增殖和嗜酸性粒细胞激活。②纤维母细胞反应，如增殖、空泡形成和胶原生成。③酶底物反应，如IV型胶原和脂蛋白的降解、凝血反应系统的激活。④血管反应，如微静脉通透性增加，淋巴细胞黏附。MC激活后所释放的化学介质及细胞因子在组织损伤和修复中也起着重要作用，如趋化中性粒细胞、增加血管通透性、促进炎症反应等。
2肠屏障的组成和功能
&&& 肠屏障包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障、化学屏障。机械屏障由上皮层、上皮顶端的紧密连接和黏液层及黏膜血管内皮组成。上皮层是由一层单层柱状上皮细胞紧密排列于肠腔构成，是肠与外界环境之间最主要的组织屏障。上皮顶端之间的紧密连接由多种蛋白质复合物组成，对物质转运起选择作用，可以阻止大分子的进入。黏液层由肠杯状细胞分泌，覆盖上皮表面，可阻止细菌的穿透，稀释、冲刷、黏附有毒物质。毛细血管内皮在正常情况下只允许特定大小的分子通过，是物质进入血液的最后一道机械屏障。免疫屏障由肠相关淋巴组织及其分泌的免疫球蛋白SIgA组成，作用是阻止细菌对肠上皮的黏附并与补体和溶菌酶协同杀菌。生物屏障是指肠道菌群所形成的相互依赖又相互制约的微生态平衡。正常情况下，肠道正常菌群可抑制其他侵入性微生物的增殖。一旦此平衡紊乱，优势繁殖的细菌便可突破黏膜屏障而移位[3]。肠液内含的胃酸、胆汁、溶菌酶、黏多糖和蛋白分解酶构成化学屏障，可以稀释、分解肠腔内有害物质和细菌毒素，并可杀灭细菌，从而防止有害细菌的侵入。
3应激状态下肠屏障的变化及其机制
&&& 应激是指机体受到各种内外环境刺激所出现的非特异性全身反应。任何生理的或心理的刺激只要达到一定的强度和时间，除了引起与刺激直接相关的特异性变化外，都可引起与刺激无直接关系的全身性非特异性反应。胃肠道是机体与外界接触面积最大的器官，且由于其黏膜血管的解剖特点，使它更容易在应激状态下受到损害。应激状态下肠屏障形态和功能的变化是多方面的。光镜下可见绒毛肿胀，绒毛顶端间隙增宽，上皮脱落、破溃，炎性细胞浸润，固有膜崩溃，电镜下可见肠上皮细胞线粒体肿胀，自噬体出现，肥大细胞脱颗粒，上皮顶端紧密连接松散等。应激状态下肠黏膜对大小分子通过量均增加，离子、水分、黏液、SIgA分泌增加。肠道正常菌群的生态平衡遭到破坏。G-菌过度生长，对黏膜的黏附性和侵袭力增加[4]，肠道正常菌群移位到肠系膜淋巴结和其它器官，可引起，甚至多器官功能衰竭(MOF)。目前对应激状态下肠屏障功能变化的机制存在许多观点，包括细胞内酸中毒和ATP耗竭，乙酰胆碱、促肾上腺皮质激素释放激素和糖皮质激素介导离子分泌和通透性增加，氧化剂应激和一氧化氮促进肠上皮凋亡，谷氨酰胺缺乏抑制上皮修复等，但是没有哪种单一的机制可以解释肠屏障变化的所有方面。近年来对肥大细胞在应激诱发的肠屏障功能失调中的作用的研究越来越受到重视。
4肥大细胞在肠屏障损伤中的作用
4.1肥大细胞与肠屏障损伤的证据&& 国内外已有较多研究证实肥大细胞在IBS的肠黏膜屏障中有显著的活化脱颗粒等改变，表明IBS症状产生的病理生理基础可能与肠道自主神经系统和肥大细胞间通路的活化有关。而多数IBS患者在发病前经历过严重的应激事件，并且应激可影响功能性胃的发生、发展和预后，因此有理由推断肥大细胞在应激性肠屏障损伤中发挥着类似的重要作用。Gue等[5]发现应激大鼠肠黏膜的肥大细胞数目无显著变化，但活化肥大细胞数目明显增加，并且从应激大鼠肠黏膜分离得到的肥大细胞对肥大细胞脱颗粒剂更敏感，受刺激后释放组胺明显增加。组织学研究发现肥大细胞主要位于黏膜的血管、淋巴和神经附近，是一种理想的抗原感受器。Mckay等[6]认为肥大细胞和肠道神经间的相互作用代表了肠道对抗原反应中的稳态单位，是研究神经-免疫相互作用的理想模型。Newson等[7]在电镜下观察导肠肥大细胞与神经末梢直接接触，为肥大细胞活动受神经支配提供了形态学依据。另有报道电镜下可见肥大细胞与肠道等器官的含神经肽P物质和降钙素基因相关肽等感觉神经纤维直接接触或毗邻，而这些神经肽参与应激和条件应激后肠黏膜肥大细胞活化增多。以上的研究结果证明了肥大细胞在应激所致肠屏障功能变化中作用的重要性。
4.2肥大细胞致应激性肠屏障损伤的机制 &&国内有研究发现在束缚应激的大鼠中肠黏液和离子的分泌增加，而与之相伴的是肥大细胞所释放的介质组胺等在肠腔内释放增加。而使用肥大细胞膜稳定剂色甘酸二钠可以阻断应激所诱导的这些肠道变化，而对对照组的动物无明显影响。Castagiliuololo等[8]将肥大细胞缺陷的小鼠与正常小鼠对照研究发现，应激所诱导的肠黏蛋白分泌增多和前列腺素释放只在正常小鼠中出现，而在肥大细胞缺陷的小鼠中没有发生。Santos等[9]发现重复避水应激使野生型大鼠空肠肠段短回路电流升高和辣根过氧化物内流增加，病理检查固有层和黏膜下层出现激活的肥大细胞，细胞内辣根过氧化物内含体增多，细胞旁路也出现辣根过氧化物，这些现象在肥大细胞缺乏性大鼠是不存在的。
4.2.1& 细胞因子和炎性介质：应激状态下，肥大细胞通过脱颗粒释放多种炎症介质和细胞因子影响肠道屏障功能[10]。肥大细胞释放的介质主要有以下几类：生物胺、酶、花生四烯酸代谢产物、腺苷、神经肽、细胞因子等。其中既有已预先合成，在受到刺激后立即释放的介质，如组胺、5-HT，各种蛋白酶、神经肽以及某些细胞因子(TNF、IL-1等)，也有受刺激后新合成的介质，主要是花生四烯酸的代谢产物，如前列腺素、白三烯。5-HT和白三烯可增加血管的通透性，促进黏液的分泌。肥大细胞的脱颗粒反应，既是机体的一种防御反应，也是炎症、免疫等病理反应的基础。肥大细胞脱颗粒依赖于细胞内钙离子稳态。肥大细胞可分泌神经生长因子(nervous growth factor, NGF)，与肥大细胞膜上特异NGF受体结合，通过第二信使钙离子刺激肥大细胞本身活化而脱颗粒，释放一些性介质和组胺作用于神经末梢促使其释放神经递质[11]。肥大细胞脱颗粒释放的蛋白水解酶-2可使大鼠空肠黏膜对辣根过氧化物酶的通透性增加。肥大细胞的其它产物，如细胞因子、前列腺素、NO等也可增加肠道的通透性。应激状态下肥大细胞分泌的类胰蛋白酶可裂解结肠细胞表面存在的活化蛋白酶受体-2从而使结肠细胞的通透性明显增加。对正常人予冷刺激(手浸入4℃冰水)，可使空肠黏膜内肥大细胞释放胰蛋白酶和组胺增多[12]。Demaude等[13]发现应激可引起迟发性结肠旁路通透性增加，伴肥大细胞脱颗粒增加和IFN-γ过度表达，编码肠上皮紧密连接蛋白ZO-2和occludin的mRNA表达下调。活化的肥大细胞释放类胰蛋白酶将蛋白酶激活受体2(PAR2)活化，后者与β-arrestin依赖的ERK1/2途径的活化相耦联，重整紧密连接周围的F肌动蛋白来增加肠上皮的通透性[14]。
4.2.2& 神经和神经递质：肥大细胞与神经-内分泌-免疫系统关系密切，是中枢神经系统调节肠黏膜功能的桥梁。机体对应激的反应始动于中枢神经系统，中枢神经系统也可调节肠肥大细胞的活性，刺激神经纤维能引起肥大细胞释放生物活性介质，因此肥大细胞可能始应激时神经系统作用于肠黏膜的一个中间环节。电镜及光镜发现肠肥大细胞有来自中枢神经系统的纤维支配，且胃肠道肥大细胞有巴甫洛夫条件反射性释放。另有研究表明肥大细胞与迷走神经传入纤维存在密切接触，两者在炎症过程中都有增生。肥大细胞可通过活化肠道神经调节紧密连接的通透性，增加抗原的细胞旁转运。Moeser等[15]的研究证实断乳引起的猪肠屏障功能紊乱中检测到小肠黏膜CRF受体蛋白表达上调、肥大细胞类胰蛋白酶水平增高和脱颗粒增多，这些可被肥大细胞膜稳定剂色甘酸钠阻断。Barreau等[16]发现给予外源性CRF或肥大细胞脱颗粒剂BRX-537A都可以使应激大鼠的肠道细胞旁路通透性增加，而这一效应能够被肥大细胞膜稳定剂doxantrazole阻断。予大鼠腹腔内注射促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)可使肠黏膜短环电流(代表离子转运)，电导(代表离子通透性)及辣根过氧化物酶从黏膜侧导浆膜侧的通透性(代表大分子物质的通透性)增加，此作用可被六氮四唑硫嗯酮(肥大细胞膜稳定剂)所拮抗，说明肥大细胞参与了CRF刺激肠道通透性的增加。冷束缚应激大鼠回肠末端肥大细胞周围神经肽Y、P物质、血管活性肠肽、降钙素基因相关肽可通过肥大细胞表明的相应受体促使肥大细胞活化释放多种生物活性物质。而这些生物活性物质也可直接作用于血管活性肠肽、降钙素基因相关肽、5-羟色胺等神经递质，反过来又调节肥大细胞的功能，形成正反馈循环，最终效应是强化了肥大细胞对肠屏障损伤的作用。
[1] Morii E. Development of mast cells: analysis with mutant mice[J]. Int J Hematol, ):22-26.
[2]& Bachelet I, Levi-Schaffer F. Mast cells as effector cells: a co-stimulating question[J]. Trends Immunol, ):360-365.
[3]& Magalhaes JG, Tattoli I, Girardin SE. The intestinal epithelial barrier: How to distinguish between the microbial flora and pathogens[J]. Semin Immunol, ):106-115.
[4]& Bischoff SC, Kramer S. Human mast cells, bacteria, and intestinal immunity[J]. Immunol Rev, ):329-337.
[5]& Gue M, Junien JL, Bueno L. Conditioned emotional response in rats enhances colonic motility through the central release of corticotrophin-releasing factor[J]. Gastroenterology, ):964-970.
[6]& Mckay DM, Bienenstock J. The interaction between mast cells and nerves in the gastrointestinal tract[J]. Immunol Today, ):533-538.
[7]& Newson B, Dahlstrom A, Enerback L, et al. Suggestive evidence for a direct innervation of mucosal mast cells[J]. Neuroscience, ):565-570.
[8]& Castagliuolo I, Lamont JT, Qiu B, et al. Acute stress causes mucin release from rat colon: role of corticotrophin releasing factor and mast cells[J]. Am J Physiol,
Pt 1): G884-G892.
[9]& Santos J, Benjamin M, Yang PC, et al. Chronic stress impairs rat growth and jejunal epithelial barrier function: role of mast cells[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, ): G847-854.
[10]& Soderholm JD ,Yang PC, Ceponis P, et al. Chronic stress induces mast cell-dependent bacterial adherence and initiates mucosal inflammation in rat intestine[J]. Gastroenterology, ): .
[11]& Metcalfe DD, Baram D, Mekori YA. Mast cells[J]. Physiol Rev, ):.
[12]& Santos J, Saperas E, Nogueiras C, et al. Release of mast cell mediators into the jejunum by cold pain stress in humans[J]. Gastroenterology, ):640-648.
[13]& Demaude J, Salvador-Cartier C, Fioramonti J, et al. Phenotypic changes in colonocytes following acute stress or activation of mast cells in mice: implications for delayed epithelial dysfunction[J]. Gut, ):655-661.
[14]& Jacob C, Yang PC, Darmoul D, et al. Mast cell tryptase controls paracellular permeability of the intestine: role of protease-activated receptor 2 and beta-arresins[J]. J Biol Chem, ):.
[15]& Moeser AJ, Ryan KA, Niqhot PK, et al. Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, ):G413-421.
[16]& Barreau F, Cartier C, Leveque M, et al. Pathways involved in gut mucosal barrier dysfunction induced in adult rats by maternal deprivation: corticotrophin-releasing factor and nerve growth factor interplay[J]. J Physiol, (Pt 1):347-356.
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神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究中文摘要神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞 释放组胺的实验研究专、『ｋ：外科学 赵李平博士研究生： 导师： 利天增教授摘要增生性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ，ＨＳ）不仅在形体上损害患者的功能和外貌，而 且增生性瘢痕一般都伴有不同程度的瘙痒，有的早期瘢痕瘙痒更是让病人难以忍 受，严重影响患者的日常生活和社会交往， 对病人的身心健康造成极大的伤害。目前，对增生性瘢痕瘙痒的研究尚处于起步阶段，相关研究甚少。主要是没有可 靠的动物模型和用于人体的简便、敏感、可重现的客观测痒方法。组胺（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ） 是公认的皮肤致痒介质［１］Ｊ神经肽Ｐ物质（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ，ｓＰ）也是现在研究的热点之 一，它是一种致炎性神经肽，由感受伤害的ｃ类神经纤维转运到外周，使肥大细 胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ，Ｍｃ）脱颗粒释放组胺引起皮肤瘙痒田１。为ＴＮＸＴ解组胺与神经肽Ｐ 物质在瘢痕瘙瘁发生中所起的作用，初步探讨瘢痕瘙痒发生的机制，为临床治疗 提供新的思路，我们设计并开展了本研究。 实验分六部分： 首先对增生性瘢痕、非增生性瘢痕（ｎｏｎ―ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ，ＮｔｔＳ）ｊ｝ｎ皮肤中组胺与神经肽Ｐ物质进行定量、 半定量分析； 接着在电镜下观察肥大细胞的超微结构在上述三种组织中的区别；然后将组织中的肥大细胞分离、培养并鉴定；观察神经肽Ｐ物质对分离的肥大胞 释放组胺的影响及Ｇ蛋白（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ在肥大细胞的表达，以探讨它与瘢痕瘙 痒是否有关。第１章人瘢痕和正常皮肤局部组织中组胺含量的测定目的：比较ＨＳ、ＮＨＳ和皮肤局部组织中组胺含量的差别，推测组胺在人ＨＳ 瘗痒发生中的意义。神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究中文摘要方法：去除所取标本的皮下组织，取等质量的全层组织，用高氯酸制成匀浆， 用荧光分光光度计测定组胺含量。 结果：ＨＳ组织中组胺的含量明显高于ＮＨＳ和正常皮肤（（２３６３２＋２６．７９）（１７０．１２士２０．５３），（１６２．３１－４－１８．９７）ｎｊｇ，Ｐ＜０．０１），但在ＮＨＳ和正常皮肤中却无明 显差异（Ｐ＞０．０５）。 结论：增生性瘢痕局部组织中组胺含量的升高可能与瘙痒有关。第２章Ｐ物质在人瘢痕和皮肤局部组织中的表达目的：比较ＨＳ、ＮＨＳ和皮肤局部组织中ｓＰ表达的差别，推测ＳＰ在人瘢痕 瘙痒发生中的意义。 方法：用免疫组织化学方法结合图像数据分析ｓＰ的表达。 结果：瘢痕组织全层可见ｓＰ的表达，皮肤中ｓＰ则主要表达在真皮层和表皮 基底层。ＨＳ中ｓＰ的表达（１ 皮肤（１２．７５＋２．０１Ｐ８．３６＋３．２８ＰＵ）明显强于ＮＨＳ（１３．１２士１．２２Ｐ Ｕ）和Ｕ）（Ｐ＜Ｏ．叭），但在ＮＨＳ和皮肤中却无明显差异（Ｐ＞０．０５）。另外，ＨＳ组织中分布在表皮基底层、小血管内膜的ＳＰ，其密度电明显高于正常皮 肤．并可见致密的胶原结缔组织间有ｓＰ神经纤维。 结论：增生性瘢痕局部组织中ｓＰ含量的升高可能与瘙痒有关。第３章人瘢痕和皮肤中肥大细胞超微结构的观察目的：观察ＨＳ、ＮＨＳ和皮肤局部组织中ＭＣ超微结构特点及其功能状态，推 测ＭＣ在人ＨＳ瘙痒发生中的意义。 方法：用透射观察电镜ＭＣ的超微结构。 结果：皮肤中ＭＣ散布于真皮浅层，瘢痕组织中ＭＣ主要分布在瘢痕浅层血 管周围及成纤维细胞临近处。皮肤和ＮＨＳ中ＭＣ结构类似，主要呈非活化状态； ＨＳ中ＭＣ数量多、体积大，多数呈活化脱颗粒状态，并含较多的幼稚ＭＣ。 结沦：增生性瘢痕局部组织中大量呈活化脱颗粒状态和幼稚ＭＣ是瘙痒产生神经肽Ｐ物质影响瘕痕中肥大细胞释放组胺的实验研究中文摘要的基础。第４章人瘢痕和皮肤中肥大细胞的分离和鉴定目的：分离并鉴定人瘢痕和皮肤组织中ＭＣ，为下一步实验奠定基础。 方法：用Ｉ型胶原酶和透明质酸酶消化分离ＭＣ；甲苯胺蓝染色和番红复染， 鉴定并计数ＭＣ。 结果：ＭＣ体积大、核呈蓝色，胞浆内含紫红色分泌颗粒。ＨＳ中ＭＣ占有核 细胞的百分ＬＬ（８．６±１．９）明显高于ＮＨＳ（６．１±１．５）和皮肤（５．３±１．２）（Ｐ＜０．０１），但皮 肤组与ＮＨＳ组之间的差异不明显（Ｐ＞Ｏ．０５）。培养１２ｈ后，大部分悬浮细胞为ＭＣ。 结论：用ｌ型胶原酶和透明质酸酶可以成功分离皮肤及瘢痕组织中的ＭＣ。第５章Ｐ物质对瘢痕和皮肤中肥大细胞释放组胺的影响目的：探讨ｓＰ与ＨＳ瘙痒发生的关系及可能的机制。 方法：用荧光分光光度法检测ｓＰ对分离的ＭＣ组胺释放率的影响，观察时间 及剂量一效应关系。 结果：ＨＳ中ＭＣ的组胺释放率随ｓＰ刺激时间的延长和浓度的增加而递增， 与ＮＨＳ组及皮肤组差异有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）。 结论：ＳＰ明显提高ＨＳ中ＭＣ释放组胺的水平而产生痒觉，这可能是增生性 瘢痕瘙痒发生的机制之一。第６章Ｇ蛋白对瘢痕和皮肤中肥大细胞释放组胺的介导作用及Ｐ物质对Ｇ蛋白Ⅱ亚基ｍＲＮＡ表达的影响目的：探讨Ｇ蛋白在Ｈｓ瘙痒发生中可能的作用及ｓＰ的作用机制。 方法：将细胞分为对照组、ＳＰ刺激组、ＮＥＭ预处理＋ｓＰ刺激组，用荧光分光 光度法检测组胺释放率并用ＲＴ－ＰＣＲ法半定量测定ＭＣｓ内Ｇ蛋白。亚基ｍＲＮＡ的塑丝堕！塑壁墅堕堕壅生！！奎塑堕登墼丝堕笪壅堕堕壅―量璺塑！墨一表达蕾。 结果：用Ｇ蛋白失活剂ＮＥＭ预处理细胞后，削弱了ＳＰ增强ＭＣｓ分泌组胺的 效应。Ｈｓ中ＧｉⅡｍＲＮＡ的表达明显弱于ＮＨＳ和皮肤（Ｐ＜０．０１），ＧｓｄｍＲＮＡ在上述三种组织中的表达差异无显著性（Ｐ＞０．０５）；ＳＰ作用后，ＧｓⅡｍＲＮＡ在三种组织 中的表达均明显增强（Ｐ＜Ｏ．０１）。 结论：Ｇｉ蛋白。亚基的弱表达可能在增生性瘢痕瘙痒发生中起重要作用，而 ＳＰ则主要通过上调ＧｓｎｍＲＮＡ在肥大细胞的表达影响组胺的释放。关键词：增生性瘢痕瘙痒组胺Ｐ物质肥大细胞Ｇ蛋白ＩＶ神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究英文摘要Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐｏｎｔｈｅｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｂｙ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｎＶＤｅｒｔｒ０ＤｎｌＣ ｓｃａｒｖ Ｉ ｌＭａｊｏｒ．‘ＳｕｒｇｅｒｙＰＡ Ｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．Ｌｉ－ｐｉｎｇ ＺｈａｏＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＰｒｏｆＴｉ（ｍ―ｚｅｎｇＬｉＡｂｓｔｒａｃｔｓｃａｒｓ（Ｈｓ）ｇｅｎｅｒａｌｌｙｍａｋｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｉｓｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｃｈｉｎｇ，ａｎｄｎｏｔＨｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｆｕｒｔｈｅｒ，ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＳ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｆｅｌｌ ｕｎｂｅａｒａｂｌｅ ｐｒｕｒｉｔｕｓ，ｗｈｉｃｈｏｎｌｙ ｌｉｍｉｔｔｈｅｉｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｄａｉｌｙ ｌｉｆｅ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｈａｒｍ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｎｔａｌ ｈｅａｌｔｈ．Ｎｏｗ，ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔｕｄ），ｏｎ ｔｈｅ ｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ＨＳ ｉｓ ｖｅｒｙ ｆｅｗ ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅｒｅ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ａｎｄａｒｅ 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ｏｆＰ（ＳＰ）ｏｎｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡ ｉｎ ＭＣｓ ｗｅｒｅＶ神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究英文摘要Ｃｈａｐｔｅｒ Ｏｎｅ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎｓｃａｒａｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｐｒｅｓｕｍｅ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｉｎｓｃａｒｔｉｓｓｕｅｓｏｎｔｈｅ ｐｒｕｒｉｔｕｓｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｉｔ ｉｎ ＨＳ、ＮＨＳ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｑｕａｎｔｉｔｙｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ，Ｔｈｅｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｉｎｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒｓ（２３６．３２－－＋２６．７９）ｎ∥ｇ，ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｎｏｎ―ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒｓ（１ ７０．１ ２±２０．５３）ｎｇ／ｇ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｓｋｉｎｓ（１６２．３１ ４－１８．９７）ｒｌｇ／ｇ（Ｐ＜０．０１）．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌｉｔｔｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｎ―ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒｓａｎｄｎｏｒｍａｌｓｋｉｎｓ（Ｐ＞Ｏ．０５）．ｓｃａｒＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｉｎｔｉｓｓｕｅｓ ｍａｙｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｉｔｃｈｉｎｇ．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｔｗｏ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ ｉｎｓｃａｒａｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｐｒｅｓｕｍｅ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ ｉｎｓｃａｒｔｉｓｓｕｅｓｏｎｔｈｅ ｐｒｕｒｉｔｕｓｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｉｔ ｉｎ ＨＳ、ＮＨＳ ａｎｄ ｓｋｉｎ 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ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｄｙｅ ｔｈｅ ＭＣｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＭＣｓ ｗｅｒｅ ｂｉｇｇｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｂｌｕｅ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄｐｍｎｏｓｕｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＭＣｓ ｉｎＨＳ（８．６±１．９１ｗｅｒｅ―ＶＩＩ神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究英文摘要ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎＮＨＳ（６．１±１．５）ａｎｄｎｏｒｍａｌｓｋｉｎ（５．３±１．，）（Ｐ＜Ｏ．０１），ｓｋｉｎｓ（Ｐ＞０．０５）．ｍｏｓｔｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌｉｔｔｌｅ ｄｉｆｉｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＮＨＳ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ＭＣ ａｆｔｅｒ １２ｈ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＴＹｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅａｎｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｃｏｕｌｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅＭＣＳ ｉｆｌｓｃａｒａｎｄ ｓｋｉｎｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｆｉｖｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｂｙＰ（ＳＰ）ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅＭＣｓｉｎｓｃａｒａｎｄ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｃａｒ．ａｎｄｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＰ ａｎｄ ｔｈｅｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃＭｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＰａｔｔｏｅｘａｍｉｎｅ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ＭＣｓ． ｄｏｓｅ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ａｎｄＲｅｓｕｌｔｓ：ＳＰ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＭＣｓ ｉｎ ＨＳｔｉｍｅ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｏ ＮＨＳ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｓｋｉｎｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０ １）．ｉｔｃｈｉｎｇ ｃｏｍｐｌａｉｎｔ ｏｃｃｕｒｒｅｄｗｉｔｈ ｔｈｅＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ＨＳ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＳＰ．Ｔｈｉｓ ｐｒｕｒｉｔｕｓ ｉｎ ＨＳ ｐａｔｉｅｎｔｓ．ｅｆｆｅｃｔ ｍａｙ ｂｅｏｎｅｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆＣｈａｐｔｅｒ Ｓｉｘ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍＭＣｓｏｆｓｃａｒａｎｄｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＳＰａｏｎｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡ ｉｎＭＣｓＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｅｆｆｅｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｔｃｈｉｎｇＶＴＵ神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究英文摘要ｏｆＨＳｓｃａｒａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＳＰ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｍｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ＳＰ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＮＥＭ＋ＳＰ ｇｒｏｕｐ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ＭＣｓＴｈｅ ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓⅡ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｅｍｉ―ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｆｔｅｒ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｆｔｅｒ ＭＣｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｇｅｎｔ． Ｎ―ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ），ｔｈｅａｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＳＰｏｎｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｉｍＲＮＡ ｉｎ ＭＣｓ ｏｆ ＨＳ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅｏｆＮＨＳ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｓｋｉｎｓ（Ｐ＜０．０１）．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌｉｔｔｌｅ 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透入疗法进入皮肤的组胺选择性地发生反应，反应时间与人类产生痒觉所需的时问 相似，Ｌｇ－ｑ专ｒｊ的外周性Ｃ类神经纤维传导瘙痒所需的时问相吻合。然而，外周神经 末梢上并没有特异的痒觉感受器，所谓特异性痒觉神经元是冈为它通过脊髓与痒觉神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究引言通路相连，而不是有独特的外周感受器【７舶】。２ＭＣ的基本生物学特征和功能ＭＣ是起源于骨髓表达ＣＤ３４，Ｃ―ｋｉｔ和ＣＤｌ３抗原的多能祖细胞，仅少量作为定型 祖细胞（Ｃｏｍｍｉｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）参与循环…】。在ＭＣ胞浆内颗粒末完全成熟之前（该 时期用形态学方法无法识别），ＭＣ的前体细胞表达Ｆｃ―ｃＲｉ和Ｆｃ．ｙＲＩｌ／ＩＩｌ。在祖细胞 迁移到各种外周组织以后，它们以各种表型完成成熟过程‘１２，１３］。ＭＣ前体细胞产生 的基质金属蛋白酶明胶酶（Ｂ／ＭＭＰ一９）可能是迁移到组织所必需的。在外周组织的存 在和表型取决于跨细胞膜表面酪氨酸激酶ＩｌＩ受体、Ｃ．ｋｉｔＳｔｌ它的配体干细胞因子（通 常表达于成纤维细胞和基质细胞表面）。在人类，ＳＣＦ增加Ｍｃ的增殖、分化、趋化、 分泌和体内聚集。许多细胞因子包括ＩＬ．３，ＩＬ一４，ＩＬ．９，ＩＬ―ｌＯ，ＮＧＦ￥［１ＳＣＦ影响ＭＣ的生 长、分化。表面上成熟的Ｍｃ能够表达一种可增殖性和较大可能的游走性，但是并 不能参与循环［１４－１ ７］。 ＭＣ的激活可以通过免疫机制和多种非免疫机制被启动，然后发生脱颗粒，并且ＭＣ能够在数分钟或／和数小时内与生理、生化、和化学刺激物再反应㈣。从形态学观察，通过免疫和多种非免疫机制使ＭＣ激活发生脱颗粒有类似的表现， 但是ＭＣ释放介质的动力学和数量不同，这种差异取决于启动刺激物【Ｉ…。这些刺 激物包括过敏反应素（Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａ、ＩＬ．１、ｌＬ．３、ＩＬ．８、ＧＭ．ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＡＦ ．４、ＭＣＰ．１、Ｍ［Ｐ―ｌ－Ⅱ）、Ｐ物质、ＡＣＴＨ、吗啡、可待因、内皮素、多粘素Ｂ、 腺苷、葡聚糖、植物凝集素等。 ＭＣ通过释放、分泌的介质和细胞因予等发挥生物学作用。ＭＣ的功能主要有 作为免疫反应的效应细胞参与宿主抗感染免疫和启动超敏反应等。包括（１）淋巴细 胞反应：如粘附、趋化、ＩＧＥ合成、ＭＣ增殖和嗜酸性细胞激活。ｆ２）纤维母细胞反 应：如增殖、空泡形成和胶原合成。（３）酶底物反应：如Ⅳ型胶原和脂蛋白等的降解、 凝血酶系统的激活。（４）微血管反应：如微血管通透性增加、淋巴细胞粘附及微血管 收缩或扩张【２０。”。 皮肤真皮中含有丰富的ＭＣ，主要分布在真皮血管、毛囊、神经和皮脂腺周围， ＭＣ的主要功能是通过释放其颗粒和内容物而在免疫反应、炎症反应过程及正常生 理过程中起重要的作用［２３，２４１。ＭＣ释放的组胺和花生四烯酸代谢产物可诱导内皮细 胞表达粘附分子进而吸引炎症细胞到局部组织之中，皮内注射组胺可引起皮肤瘙２神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大绌胞释放组胺的实验研究引言瘁和风团一红斑反应；皮肤中Ｍｃ中的类胰蛋白酶和食糜酶能诱导中性粒细胞、嗜酸 性细胞以及淋巴细胞和巨噬细胞的聚集，被认为有激活和促进皮肤炎症反应过程 的功能‘２５－２７］。３ＳＰ的生物学特点及作用ｓＰ是目前发现最早、分布广泛、活性众多的一种神经肽。最早在１９３１年由ｖｏｎ Ｅｅｕｌｅｒ及Ｇａｄｄｕｍ等从马脑和小肠的提取物巾寻找乙酰胆碱时发现的，并将它分离 出来。ｓＰ是速激肽家族（ＴＫ族）的一种，分子量为１３４０的１ｌ肽，其结构如下，Ａｒｇ― Ｐｒｏ―Ｌｙｓ―Ｐｒｏ―Ｇｉｎ―Ｇｌｎ．Ｐｈｅ―Ｐｈｅ―Ｇｌｙ―Ｌｅｕ―Ｍｅｔ―ＮＨ２。ＳＰ存胞体的核糖体上合 成无活性的大分子前体蛋白，合成后被转送至内质网、高尔基复合体和分泌颗粒 或囊泡，装入囊泡后经轴浆转送到神经末梢，受刺激时即可释放。ＳＰ能以神经分 泌的方式作用于各种免疫细胞，参与免疫调节，促进免疫功能，既能增强单核巨噬 细胞的吞噬和趋化活性，又可以促进Ｔ细胞增生，Ｂ细胞合成和分泌免疫球蛋白，从多方面影响免疫反应川。研究表明ｓＰ反应阳性神经在真皮中主要分布于真皮浅层微小血管周围，并由 乳头层进入表皮，维持皮肤的感觉和感受伤害性刺激口”。研究证实ＳＰ在许多皮肤 性疾病中起重要的作用，如银屑病、变应性皮炎、白癜风等病变部位的ｓＰ含量增 高［３０－３３ｌ－ｓＰ可能是导致上述疾病瘙痒症状的重要介质［３４，３５１。 ４皮肤中ＭＣ与ＳＰ的相互作用 肥大细胞与ＳＰ）。泛存在于人类皮肤中，参与皮肤的正常生理和免疫炎症反应 过程，皮肤的瘙痒与ＭＣ脱颗粒和ｓＰ神经纤维密切相关。含ＳＰ的感觉神经末梢具有 双向传导功能，向中枢传递受刺激信息起递质作用，在局部释放ｓＰ及其他肽类物 质起调质作用，参与瘙痒和疼痛的启动过程。 人皮肤内的ｓＰ不但刺激ＭＣ释放组胺引起局部红肿瘙痒反应，ｓＰ还可直接作用 于微小血管，引起血管扩张，加之组胺的作用使渗出增加，炎细胞趋化，导致皮 肤神经血管内环境平衡紊乱，局部酸性代谢产物增多，更加重瘙痒症状。此外ｓＰ 可通过刺激皮肤中ＭＣ脱颗粒而诱导皮肤毛细静脉内皮细胞表达Ｅ选择素，Ｅ选择素 能增强白细胞对血管壁的黏附作用促进炎症的发生。同时借ＭＣ脱颗粒而问接的吸 收嗜酸性粒细胞，使其渗出游走，对炎症起推波助澜的作用［３６－３８］。可见，皮肤中 ＭＣ与ｓＰ的相互作用贯穿于皮肤免疫反应和瘙痒炎症作用的整个过程。３神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究引言微透析法研究人皮肤中ＭＣ结果证明：ｓＰ浓度达到ｌ×ｌｏ。ｍｏｌ／Ｌ致ＭＣ组胺显著 释放，并且ＳＰ导致的组胺释放具有钙依赖性‘３９，４０１。Ｌｅｍｂｅｃｋ提出轴突反应模式和 张保真提出的轴突反射、接力联动模型，他们的基本环节是当皮肤某～点受刺激 时，受刺激局部ＭＣ释放组胺、舒血管缓激肽及前列腺素等使局部的神经末梢兴奋， 经轴突反射使另一神经侧枝ｓＰ释放，与之相连的ＭＣ脱颗粒释放活性物质引起与 它相连的另一神经末梢兴奋，通过轴突反射重复上述过程，再引起与这一侧枝相 邻的ＭＣ释放生物活性物质。同时支配小血管的神经末梢释放的ＳＰ和ＭＣ释放的组 胺等引起血管扩张，血浆外渗，表现出潮红和风剀反应。 王俊明、张保真报道了人皮肤上神经与ＭＣ连接的突触样结构，发现与ＭＣ形 成突触样连接的神经纤维末梢内有ｓＰ免疫反应的囊泡，并报道了ｌ例两根ｓＰ样神经 轴突末梢与同一Ｍｃ形成突触样连接，为ｓＰ和ＭＣ相互作用提供了直接的形态学证 据［４１－４３】。ｓＧ蛋白对Ｓ Ｐ功能的调节ｐｒｏｔｅｉｎ／ＧＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇＧ蛋白（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ）是能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有水解ＧＴＰ生成ＧＤＰ，即具有ＧＴＰ酶（ＧＴＰａｓｅ）活性的蛋白，其主要功能是将激素 或神经递质信，宙，由细胞外表面的受体传递至细胞内的效应器，如腺苷酸环化酶等。 异源三聚体Ｇ蛋白（ＨｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃＧＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）是Ｏ蛋白超家族的一员，分子量大（１００ｋＤ左右），是受鸟嘌呤核苷酸调控的超级家族的信号传导分子，Ｏ蛋白 在绌胞内外信息传导中有着极其重要的作用［４４，４５１。异源三聚体Ｇ蛋白由三条蛋白 链组成，按相对分予质量从大到小排列为ａ、１３和Ｙ。Ｇ蛋白ａ亚基是功能亚基，不 同的ａ亚基构成不同的Ｇ蛋白，Ｂ、ｖ亚基通常以二聚体形式发挥作用１４…。 Ｇ蛋白偶联的信号传导系统由Ｇ蛋白偶联受体（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ即ＧＰＲｓ）、Ｇ蛋白和效应器（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）分子组成。Ｇ蛋白是一个分子开关，传导南 ＧＰＲｓ接收的信号，再以Ｇ蛋白解离亚基作为传导物，活化相应酶和离子通道，产生 重要的第二信使，从而引起胞内相应的生物反应。当特异的活化剂存在时，活化的受 体激活特异的Ｇ蛋白，催化ｄ亚基结合的鸟苷二磷酸（ＧＤＰ）转变为鸟苷三磷酸 （ＧＴＰ），从而ａ亚基构象改变，降低１２亚基和Ｂ Ｙ亚基的亲和力，使三聚体分离为Ｏａ（ＧＴＰ）和Ｇ Ｂ Ｙ。解离的Ｏ ａ（ＧＴＰ）和Ｇｔ３ Ｙ通过直接调控下游各自的效应器将 信号传到细胞质和细胞核中；当Ｇ ａ亚基与ＧＤＰ结合时，再结合Ｏ Ｂ Ｙ，抑制信号４神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究引言传导［４７，４８］。Ｇ蛋白直接调控腺苷酸环化酶（Ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、磷脂酶Ｃ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ，Ｃ）、Ｃａ２＋、Ｋ＋通道以及ｐ肾上腺素受体激酶等㈣。 ＴＫ族的ＮＫ―ｌ、ＮＫ一２、ＮＫ一３三种受体都能与Ｓ Ｐ结合，其中Ｓ Ｐ与ＮＫ―ｌ受体的结合能力最大，因而将Ｎ Ｋ一１受体特称为Ｓ Ｇ蛋白偶联的受体族，从鼠脑组织中分离出来的ＳＰ Ｐ Ｒ。Ｓ ＰＲ受体属于与Ｒ（ＮＫ一１受体）具有七个ｎ一螺旋的疏水性跨膜区域、三个亲水性细胞外环、三个亲水性细胞内环和～个亲水性胞质侧的Ｃ一端区域；受体激活后通过Ｇ蛋白调节第二信使的形成［５０－５２Ｉ。研究发现，Ｓ Ｐ主要引起１，４，５一三磷酸肌醇（ＩＰ３）和／或环一磷酸腺苷（ｃＡＭ Ｐ）的形成。依细胞类型的不同，Ｓ Ｐ可通过不同的Ｇ一蛋白产生不同的第二信使而发挥作用： 在外周组织，兴奋ＳＰＲ可致ＩＰ３和／或ｃ ＡＭＰ的含量发生变化，进而引发一系列细胞内反应，如在急性分离的脊髓神经元细胞、培养的新生大鼠脊髓神经元细胞及 大鼠腺垂体Ｐ 联产生ＩＰＲＬ细胞，Ｓ Ｐ―ＳＰＲ复合物通过Ｇ蛋白与磷脂酶Ｃ（ＰＬＣ）相偶３：但在培养的成神经细胞瘤细胞，ｓ Ｐ的兴奋通过Ｇ ｓ与腺苷酸环化酶（Ａ Ｃ）的兴奋相偶联使ｃ ＡＭＰ的含量增加；而在鼠腮腺细胞，ｓ Ｐ Ｒ的兴奋则通过Ｇｉ与Ａ Ｃ的抑制相偶联使ｃ ＡＭＰ的含量减少；亦有研究表明，在人类皮肤的ＭＣ上，ｓＰ通过作用于Ｇ蛋白和蛋白激酶ｃ刺激ＭＣ释放组胺等物质的【５３－５５］。 综上所述，皮肤内含ＳＰ的神经纤维受刺激后，一方面向中枢传递瘁觉，另一 方面在局部释放ＳＰ，ｓＰ与肥大细胞上的受体结合，经Ｇ蛋白通道和下游的信号转 导从而刺激肥大细胞释放组胺。 二、研究目的和意义 为了探讨瘢痕瘙痒发生的机制，了解ＳＰ、ＭＣ及组胺是否在瘢痕瘙痒发生中起 作用以及Ｇ蛋白在介导ＳＰ庳Ｉ］激ＭＣ释放组胺的过程中所扮演的角色，我们设计并开 展了本研究。实验分六部分：首先对增生性瘢痕、非增生性瘢痕和皮肤中组胺与 神经肽Ｐ物质进行定量、半定量分析：观察上述三种组织中肥大细胞超微结构的区 别；然后将组织中的肥大细胞分离、培养并鉴定；观察神经肽Ｐ物质对分离的肥大 细胞释放组胺的影响及Ｇ蛋ｍＲＮＡ在肥大细胞的表达。神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放｜Ⅱ胺的实验研究第１章第１章人瘢痕和皮肤局部组织中组胺含量的测定１．１材料１．１．１标本： ３９例增生性瘢痕和１７例非增生性瘢痕标本均取自需手术切除瘢痕的病人，从 以上两组病例中各在８例大腿供皮区上取正常皮肤作对照。其中男３２例，女２４ 例，年龄３～５ｌ岁，平均（２８．２±１０．６）岁；病程６个月～１１年。增生性瘢痕明显 高于周围正常皮肤，局部增厚变硬，表面呈红色、潮红或紫红，凹凸不平并伴有 不同程度的瘙痒；而非增生性瘢痕平坦、质软、色浅，瘙痒减轻或消失。 纳入标准：①术前２个月内未应用止痒药物②经常规检查、心电图、经颅多 普勒超声和生化检查除外皮肤病、原发性高血压、糖尿病和其他器质性疾病③患 者知情同意。 １．１．２主要试剂 磷酸组胺 ２．５％三氯乙酸 正丁醇 正庚烷 邻苯二甲醛（Ｏ．苯二醛） 二甲基亚砜（ＤＭＳＯ） １．１．３实验耗材及设备 ７ｍｌ离心管 ２ｍｌ内螺口冻存管 ５ｍｌ烧杯 １００ｍｌ容量瓶 ５０ｍ［移液器 Ｔ１０高速组织匀浆机 Ａｌｌｅｇｒａ６Ｒ离心机 美国Ｃｏｍｉｎｇ公司 美国Ｃｏｍｉｎｇ公司 北京玻璃仪器厂 德国Ｂｒａｎｄ公司 德国Ｂｒａｎｄ公司 德国ＩＫＡ公司 美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司 Ｓｉｇｍａ公司 鼎国公司 鼎国公司 鼎国公司 鼎国公司 美同Ａｍｅｒｓｃｏ公司６神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第１章Ｈｅｒａｅｕｓ深低温冰箱 ＢＳ２２４Ｓ电子天平 １．１．４主要仪器 荧光分光光度计德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司 德国ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ公司日立Ｆ－３０００型１．２方法１．２．１标本制备 将手术中切取的瘢痕及皮肤组织在生理盐水中清洗干净，用眼科剪剪去皮下 组织，加组织冻存液（ＤＭＳＯ和生理盐水的体积比为２：８）中置一８０℃深低温冰箱‘保存。 １．２．２磷酸组胺标准品的配制 标准品Ａ：称取４ｍｇ磷酸组胺标准品至５０ｍｌ容量瓶中，加超纯水至刻度线（浓 度为０．０８９／Ｌ），混匀 标准品Ｂ：２５ｍｌ标准品Ａ＋２５ｍｌ超纯水（浓度为Ｏ．０４９／Ｌ） 标准品Ｃ：２５ｍ｜标准品Ｂ＋２５ｍｌ超纯水（浓度为Ｏ．０２９／Ｌ） 标准品Ｄ：２５ｍｌ标准品Ｃ＋２５ｍｌ超纯水（浓度为０．Ｏｌｇ／Ｌ） 标准品Ｅ：２５ｍｌ标准品Ｄ＋２５ｍｌ超纯水（浓度为Ｏ．００５９／Ｌ） １．２．３组胺含量的测定№”ｌ 从深低温冰箱中取出待测标本，置３７。Ｃ水浴箱中快速解冻，用电子天平（精 度为０．１ｍｇ）称取ｌＯＯｍｇ全层组织放入烧杯中，将烧杯放在碎冰中，在烧杯中加 ２ｍｌ的Ｏ．４ｍｏＩｌＬ的三氯乙酸，用匀浆机制成匀浆，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；提取ｌｍｌ 上清液至７ｍｌ的离心管内，该离心管内预先放有：５ｍｏ／／Ｌ的氢氧化钠Ｏ．１２５ｍ１， ０．３７５９氯化钠和２．５ｍ１正丁醇，振荡５ｒａｉｎ，３０００ｆｆｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。然后，将上层的 正丁醇移至另一７ｍｌ离心管内，加入Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠１．２５，振荡５ｍｉｎ，３０００ｆｆｍｉｎ 离心１０ｍｉｎ。２ｍｌ正丁醇移至７ｍｌ离心管内，该离心管内预先放有：０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸 ０．６２５ｍｌ和正庚烷３．７５ｍｌ，振荡５ｍｉｎ，３０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ。取水层Ｏ．５ｍｌ，加入 ｌｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠０．１ｍｌ和２∥Ｌ ０．苯二醛（荧光剂）０．０２５ｍ１，４ｒａｉｎ后Ｄｍｘ．３ｍｏｌ／Ｌ 盐酸Ｏ．０５ｍｌ终止反应，在３４０ｎｍ激活ＦＮ ４５０ｎｍ荧光。同时以空白管、标准品Ａ、神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第１章Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ作标准曲线。 １．２．２统计分析 所有计量资料以数据以均值加减标准差（ｆ＿±。）表示，均值自身前后比较，采用 配对ｔ检验；多组组间均值的比较用单因素方差分析，组问均值的两两比较用ＳＮＫ 法；计量资料以频数和率值表示，各组问构成比检验采用Ｐｅｒｓｏｎ 计软件ＳＰＳＳｌｌ．５软件完成。ａ＝０．０５ｘ２检验，由统１．３结果１．３．１病人基本情况见表ｌ―ｌ 表卜１ 病人基本情况表注：各组问比较：Ｐ均＞００５１．３．２绘制标准曲线如图１―１ 以相对荧光强度为横坐标，以组胺浓度（ｇ／Ｌ）为纵坐标绘制。８神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第１章Ｆｊ，７一二么。０一一ｌ相对荧光强度一１―――――――■图１－１相对荧光强度与组胺含量标准曲线图根据标准曲线：组胺含量；Ｏ．１×相对荧光强度一０．０２ １．３．３增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常皮肤中组胺含量比较见表１－２表卜２增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常皮肤中组胺含量（－士ｓ）注：增生性瘢痕与非增生性瘢痕、正常皮肤比：＋＋尸均＜Ｏ．０１；非增生性瘢痕与正常皮肤比：＋厅０．０５图１―２增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常皮肤中组胺含量一９一神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第１章１．４讨论组胺（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）是公认的致痒介质，由组氨酸经组氨酸脱羧酶（ＨＤＣ）脱羧而 产生。组胺为存在于肥大细胞和嗜碱性细胞中生物活性很强的炎性介质，是人体内 分布广、作用强的生物活性物质之～【５８，５９］。组胺在颗粒中以肝素结合的形式存在， 当通过脱颗粒作用释放到细胞外时，组胺与肝素分离，发挥活性作用。一般认为， 它和其他神经递质一样，首先和靶细胞上特异性受体结合，从而改变细胞的兴奋性 而发挥广泛的生理作用。组胺在炎症中的作用主要由Ｈ１受体介导。Ｈｌ受体分布 在中枢组胺能神经元中及外周的胃肠、气管、子宫、血管平涓‘肌等组织，组胺作用 于Ｈｌ受体，激活磷酯酰肌醇通路，Ｃａ２＋流入细胞内并动员细胞内储存钙，使胞内 ｃａ２＋浓度升高，将ＧＴＰ催化成ｃＧＭＰ，引起平渭’肌收缩等效应。局部作用时能使小 静脉和毛细血管扩张及通透性增加，可以引起局部皮肤充血、水肿、搔痒感和荨麻 疹。组胺可以直接作用于皮肤感受伤害的无髓鞘的类神经纤维末梢或作用于白细 胞或皮肤的其他细胞而释放细胞因予产生痒觉。荨麻疹、老年瘙瘁症等常见的皮 肤瘙痒与患者血液中组胺的含量密切相关联［６０－“。但是，组胺在瘢痕瘙痒的发生 中是否起作用？ 本实验采用荧光分光光度法测定组胺，是基于组胺与邻苯二甲醛在一定条件 下缩合成强而稳定的荧光物质这一原理进行的。其灵敏度较高，可达到Ｏ．５ｎｇ，线 形范围大（１―１０００），形成的荧光物质在室温下可稳定２小时；该方法操作简单，仪 器普及，药品易得，适于本实验。 从本文实验结果来看：组胺在增生性瘢痕中组胺的含量显著高于非增生性癞 痕和正常皮肤，由于绝大部分增生性瘢痕组织都伴有不同程度的瘙瘁，而非增生 性瘢痕和正常皮肤的瘙痒症状不明显或无瘙痒症状，表明组胺在增生性瘢痕局部 瘙痒中起重要作用并目．随着瘢痕的逐渐成熟局部组织中组胺含量逐渐降低，但在 临床工作中亦发现：单用Ｈｌ受体阻滞剂治疗瘢痕瘙瘁效果并不。卜分理想，提示瘢 痕瘙痒的发生除了组胺以外可能还有其他的痉痒介质如Ｐ物质、５一羟色胺等的参 与，是一个复杂的、多因素作用的结果。要了解还有哪些介质参与了瘢痕瘙痒的 发生以及这些介质之间的相互作用尚需进一步研究。ｌＯ神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第２章第２章Ｐ物质在人瘢痕和皮肤局部组织中的表达２．１材料２．１．１标本：来源同前 ２．１．２主要试剂 小鼠抗人Ｐ物质多克隆抗体 超敏广谱ｓ―Ｐ试剂盒 ＤＡＢ显色剂 美国ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ公司 美国ＭＡＸＩＭ公司 美国Ｇｉｂｃｏ公司其他多聚甲醛、二甲苯、苏术素等均为常规试剂 ２．１．３实验耗材及设备 防脱玻片及盖玻片 Ｌｅｉｃａ石蜡切片机 ＬＸ一７０型倒置生物显微镜 ＩＢＡＳ２．５仝自动图像分析系统Ｋｙ－Ｆ３０Ｂ美国Ｓｉｇｍａ公司 德国Ｌｅｉｃａ公司 口本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司 德周ＫＯＮＴＲＯＮ公司３ＣＣＤ彩色图像摄录输入仪日本ＪＶＣ公司 德国ＺＥＩＳＳ公司Ａｘｉｏｔｒｏｎ研究型显微镜 ２．１．４主要试剂的配制０．０２ ＭＰＢＳ（ｐＨ７．２―７．６）配法：１０００ｍｌ蒸馏水中加氯化钠８．５９，Ｎａ２ＨＰ０４ ２．８９，ＮａＨ２Ｐ０４ Ｏ．４９。０．０１Ｍ枸橼酸盐缓冲液：１０００ｍｌ蒸馏水中加枸橼酸三钠（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３０７?２Ｈ２０） ３９，枸橼酸（Ｃ６Ｈ８０７－Ｈ２０）０．４９。２．２方法２．２．１标本固定及ＨＥ染色 将手术中切取的瘢痕及皮肤组织在生理盐水中清洗干净，用眼科剪剪去皮ｒ 组织，用４％多聚甲醛固定标本４８ｈ，二甲苯透明１０ｍｉｎ，置于快速制片处理仪中，塑墅堕！塑亟墅堕堕壅±婴查塑堕登墼塑堕塑塞堕婴塑箜！童浸蜡（５６。Ｃ）１５ｒａｉｎ，包埋，石蜡切片机切片，垂直皮肤表面切取全层组织，厚５９ｍ。 甲醛固定每个石蜡块的一张切片５～１０ ｒａｉｎ。苏木素染色５～１０ ｍｉｎ。流水冲洗１０ ｍｉｎ，然后将切片放入Ｏ．５～１％的盐酸酒精中快速浸泡一下，取出后用液返蓝。烘 干后，用中性树胶封片。２．２．２Ｐ物质免疫组化标记①切片常规脱蜡至水：石蜡切片于防脱载玻片上经６０℃烤片１０～１５ｒａｉｎ，经 二甲苯脱蜡（５ｍｉｎ×２）、梯度酒精水化（１００％、９５％、８０％ｉｉ吾精中各浸泡５ｒａｉｎ）， 蒸馏水中浸泡５ｍｉｎ； ②灭活内源性酶：３０％Ｈ２０２ １份＋蒸馏水１０份混合，室温５～ｌＯ ｍｉｎ，蒸馏水 洗３次。 ③热修复抗原：将切片浸入０．０１Ｍ枸橼酸盐缓冲液（ＰＨ６．０），电炉或微波炉加 热至沸腾后断电，间隔５～１０ｍｉｎ后，反复ｌ～２次。冷却后ＰＢＳ洗２次。 ④每张切片上用ＰＡＰ画笔在距离组织边缘３ｒａｍ处画一道圈，圈内滴一滴 ５％ＢＳＡ封闭液，室温２０ｍｉｎ，以消除产生的非特异性结合，减少非特异性背景， 甩去多余液体，不洗。 ⑤滴加按１：２００稀释的Ｐ物质抗体，４℃过夜。ＰＢＳ洗２ｍｉｎｘ３次。 ⑥滴加生物素化山羊抗小鼠Ｉ９０３７。Ｃ ⑦滴加试剂ＳＡＢＣ，２０～３７６Ｃ２０ ２０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗２ ｍｉｎｘ３次。ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ ｍｉｎｘ４次。⑧ＤＡＢ显色：取ｌｍｌ蒸馏水，加试剂盒Ａ，Ｂ，Ｃ试剂各１滴，混匀后加至切片。室 温显色，镜下控制反应时间，当出现棕黄色阳性产物时终Ｉｒ显色。 ⑨苏木素轻度复染ｌ＿０～２０ｓｅｃ，流水冲１０ｒａｉｎ。脱水，透明，中性树胶封片。 ⑩设置特异性抗体（一抗）对照组，以ＰＢＳ代替Ｐ物质抗体作阴性对照，其余 步骤同上。 ２．２．３图像分析法【６４－６５］ 应用德国ＫＯｎｔｒＯｒｌ公司的ＩＢＡ Ｓ２．５全自动图像分析系统对免疫组织Ｅ Ｓ Ｓ化学玻片进行图像分析，将玻片置于图像分析系统的研究型显微镜（德国ＺＡｘｉＯｔｒＯｎ型）载物台上，在相同放大倍率下，三组标本各随机选取５０个视神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第２章野，通过日本ＪＶＣ公司的ｋＹ．Ｆ ３０Ｂ３一Ｃ ＣＤ彩色图像摄录输入仪摄取图像于电脑显示器的荧光屏上，用鼠标器选定阳性部分，将之输入图像分析仪，经主机对 扫描总面积（ｍ＋ｎ）、阳性部分的面积（１７－）、测试区域Ａ的灰度级（Ｇ Ａ）和阳性部分 ｄ相的灰度级ＧⅡ进行测评和显示，根据公式：Ｐ Ｕ＝１００×ｌＧ Ａ―ＧⅡｌ／｛Ｇｍ （１―１２／（ｍ＋ｒｔ））），其中Ｐ Ｕ为阳性单位。Ｇ ２．２．４统计分析 所有计量资料以数据以均值加减标准差（ｉ兰ｒ）表示，均值自身前后比较，采 用配对ｔ检验：多组组问均值的比较用单因素方差分析，由统计软件ＳＰＳＳｌｌ．５软 件完成。ｅｔ＝０．０５ｍａａＸ×Ｘ为最大灰度分级，ＧＩＴｌａＸ２２５６。２．３结果正常皮肤、ＮＨＳ、ＨＳ组织中Ｐ物质表达情况：正常皮肤的表皮基底层及真皮 乳头层、小血管膜周围、皮下神经纤维、汗腺、皮脂腺、毛囊周围可见Ｐ物质表 达：瘢痕组织全层皆可见其表达（附图２～７…一２～１８）。Ｈｓ中Ｐ物质的表达明显强 于正常皮肤和ＮＨＳ ｆ Ｐ＜Ｏ．０１），但其在正常皮肤和ＮＨＳ之间差异无统计学意义（Ｐ＞ Ｏ．０５１（表２－１）。另外，ＨＳ组织中分布在表皮基底层、小血管内膜的ＳＰ，其密度也明显高于正常皮肤，并可见致密的胶原结缔组织间有ｓＰ神经纤维（附图２…１１―２～１５、。 表２ １增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常皮肤中ｓＰ表达的Ｐ Ｕ值比较悖±ｓ）注：增生性瘢痕与非增生性癜痕、正常皮肤比：?＋尸均＜００１；非增生性瘢痕与正常皮肤比：＋Ｐ）０ ０５１３神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第２章图２ １增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常皮肤中ｓＰ表达的Ｐ Ｕ值２．４讨论Ｐ物质是一种神经肽类物质，ｓＰ在胞体的核糖体上合成后被转送至内质网、高尔基复合体和分泌颗粒或囊泡，装入囊泡后经轴浆转送到神经末梢，受刺激时即可释放。ｓＰｆｌｇ以神经分泌的方式作用于各种免疫细胞，参与免疫调节。从多方面 影响免疫反应【”１。Ａｌｔｕｎ等脚１对２２例非全层皮肤烧伤的病例于烧伤后１、４、７个月对愈合的伤区进 行活检，同时测定神经纤维长入愈合区的进展，并且用免疫组化法测定愈合区的Ｐ 物质、神经肽Ｙ等。结果：在烧伤后７个月，增生性瘢痕组织中虽有神经纤维长入， 但数量低于未烧伤的皮肤组织，而非增生性瘢痕愈合组织中，神经纤维长入的数 量比增生性瘢痕要多，不过，含有神经肽的神经纤维，增生性瘢痕组织与非增生 性瘢痕组织基本相似。过去对Ｈｓ中Ｐ物质的分布研究不多，丛林等Ｍ认为Ｐ物质表达在表皮基底层处，Ｃｒｏｗｅ等‘“Ｉ认为在表皮底层。本实验的结果是增生性瘢痕组织表皮层中Ｐ物质 表达明显增多，可达表皮全层，虽然实验中未比较增生性瘢痕、非增生性瘢痕和正常１４神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第２章皮肤三种组织中神经纤维的数量，但可推断，增生性瘢痕组织中含Ｐ物质的神经纤 维数量要明显多于非增生性瘢痕和正常皮肤，并且随着瘢痕的逐渐成熟此类神经 纤维的数量逐渐降低。增生性瘢痕组织中的小血管膜及周围ｓＰ与显著高于正常皮 肤及非增生性瘢痕，说明ＳＰ可能参与增生性瘢痕组织血流调节。已有很多研究证 明，ｓＰ具有扩张小血管作用。血管扩张可引起增生性瘢痕表面潮红。另外，Ｓｐ ｒｑ‘促 使肥大细胞释放组胺，组胺也可使血管扩张，血流增加，并介导痉痒症状。组胺一 直被认为是重要的瘙瘁物质。人皮内注射ｓｐ－３Ｉ起红斑、瘙痒，证实为刺激肥大细胞 释放组胺神经末梢释放缓激肽类物质和前列腺素。而ｓＰ短肽拮抗和非肽类ＳＰＲ拈抗 剂都有抑，ｉＪｓＰ促释放组胺作用［６９］。有研究发现，临床表现瘙瘁症状的增生性瘢痕 组织中，ｓＰ阳性率高分布密度高，从形态学上提示ｓＰ与增生性瘢痕瘙痒有关。由此 推测Ｐ物质与瘢痕瘙痒的关系是：Ｐ物质在局部一方面可直接刺激ｃ类纤维向中枢传 导痒觉，另一方面刺激肥大细胞释放组胺，使得局部血管扩张、渗出增加、炎细 胞趋化，导致皮肤神经血管内环境平衡紊乱，局部酸性代谢产物增多，更加重瘙 痒症状。 ｓＰ作为神经源性炎症介质和免疫调节肽０７…，可能在皮肤损伤的早期就参与了 局部炎症反应及免疫反应，促进结缔组织修复，而在瘢痕不断增生的病理条件下，其作用可能更加复杂。Ｃｒｏｗｅ等㈣用免疫荧光法研究发现，ｓＰ在增生性瘢痕中分布明显比正常皮肤及非增生性瘢痕增多，增生性瘢痕组织中ｓＰ阳性反应增强。这提 示ｓＰ不仅在与瘢痕瘙痒的发生关系密切而且在组织修复及瘢痕持续增生过程中有 一定的作用。研究结果证明，ＳＰ多分布于人皮肤表皮基底细胞层及真皮乳头层，与 此处增殖修复能力强可能有关。增生性瘢痕组织中，表皮基底细胞层及致密纤维组织间ｓＰ增多，成纤维细胞上存在ｓＰ受体。Ｎｉｌｌｓｓｏｎ等人证实刚，ｓＰ能．Ｎ激体外培养人成纤维细胞的ＤＮＡ合成。起促进分裂因子的作用，使成纤维细胞增殖。同时ｓＰ 能刺激４，５一磷酸肌醇酯水解甘油和三磷酸肌醇，发挥第二信使功能，使细胞内钙 活动增强，间接参与成纤维细胞的增生。已有研究证明，ｓＰ与表皮生长因子（ＥＧＶ）、 成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）在人皮肤成纤维细胞的增殖上有交互作用。ＳＰ、ＥＧＦ、 ＦＧＦ都是成纤维细胞的促分裂因子，相互之问有协『司作用。成纤维细胞是瘢痕的主 要细胞成分，它的增殖，在创伤早期呵促进创面愈合。当创面已愈合，成纤维细胞 仍过度增殖，同时又大量合成分泌胶原等细胞外基质成分，导致瘢痕过度增生，ｓＰ神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第２章受体能调控这一作用［７２－７３］。瘢痕的增生与瘙痒的发生是个复杂的局部和全身病理 生理过程。ｓＰ在此过程如何作用，其作用环节、方式、机理怎样？尚待进一步研究。１６神经肽Ｐ物质影响瘕痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第３章第３章人瘢痕和皮肤中肥大细胞超微结构的观察３．１材料３．１．ｉ标本：来源同前 ３．１．２主要设备和仪器 ＬＫＢ２０８８型超薄切片机Ｐｈｉｌｉｐｓ瑞典ＬＫＢ公司 荷兰Ｐｈｉｌｉｐｓ公司ＣＭｌ０透射电镜３．２方法①固定：术中取下标本后，立即切成ｌｍｍ×１ｍｍ×２ｍｍ全层组织块，在４＂Ｃ、 ２．５％的戊二醛（ｐＨ＝７．４）中固定２小时，用Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ漂洗５分钟×２次， 再经１％四氧化锇（ｐＨ＝７．４）固定２小时。 ②脱水：去离子水漂洗５～１０分钟×３次，洗去固定液。用梯度酒精脱水。 ③浸透：先用包埋液Ａ（纯丙酮：Ｅｐｏｎ８１２＝ｌ：１）室温浸透３小时，再用包 埋液Ｂ（纯丙酮：Ｅｐｏｎ８１２＝１：２）充分浸透１小时，最后用包埋液Ｃ（纯Ｅｐｏｎ８１２） 在３７℃温箱内浸透２～３小时，’止丙酮挥发。 ④包埋：向塑料模板内注入包埋液Ｅｐｏｎ８１２，用牙签移取标本至包埋液面上， 自然下落。将塑料模板置３７℃孵箱过夜，４５。Ｃ ｌ天，６０。Ｃ １夜，然后在包埋块一端 贴上标签，６０＂Ｃ固化１～２天。 ⑤切片：在超薄切片机上刮备６０～８０ｎｍ的切片。 ⑥染色：用醋酸铀和枸橼酸铅双染色１分钟，双蒸水冲洗，室温干燥。 透射电镜观察，照相。冲洗胶片晒相后扫描，保存图像资料。３．３结果正常皮肤肥大细胞数量较少，散布于真皮浅层，主要为乳头层及网状浅层、１７神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第３章血管或皮肤附件周围。肥大细胞呈圆形或椭圆形，直径１３至２８ｊ．ｔｍ，胞膜完整，表 面有少数微绒毛突起，胞核位于细胞中央，常染色质丰富，核仁明显，胞质内的 颗粒电子密度一致，分布均匀（图３－１）有少量的高尔基氏体，线粒体和粗面内质 网。细胞表面有少量散在的微绒毛。 瘢痕组织中肥大细胞主要分布在瘢痕浅层血管周围及成纤维细胞ｌ｜｛『ｉ近处。有 的神经末梢附近亦见有肥大细胞。 非增生性瘢痕组织与正常皮肤中肥大细胞的形态结构类似（图３―２），偶见核 大、细胞器多、分泌颗粒少的幼稚肥大细胞（图３－４）。 增生性瘢痕中肥大细胞数量上明显有所增加，体积较大，形ｊ扶除与正常皮肤 的棚同外，还有相当一部分是呈梭形或不规则形，有的细胞直径甚至超过４０ｕｍ，核 较小，胞质丰富，内充满大量电子密度不很一致的颗粒，分布不均，体积不一， 多数呈活化脱颗粒状态（附图３．７），颗粒外有膜包裹，还可观察到有颗粒合并现象。 当颗粒移至细胞边缘时，部分胞膜消失，颗粒脱出（附图３．１２）；部分则以分泌形式 逐步释出颗粒中介质，可见有的尚未释尽（附图３―２１）。胞外的微绒毛，比正常皮肤 的更多更长，且具有趋向性。当邻近有成纤维细胞时，明显地朝着成纤维细胞延伸， 或以突起的伪足与成纤维细胞胞体作膜接触；而当邻近没有成纤维细胞时，微绒 毛多早贴胞膜倒伏的状态或消失（附图３一１８）。成纤维细胞可采用内吞方式，把肥大 细胞颗吞噬至胞体内，逐步降解；也可以由胞体膜吸收其释放的介质。多数这类邻 近的成纤维细胞，粗面内质网都呈显著扩张，反映其胶原合成功能特别活跃。 增生性瘢痕中幼稚肥大细胞的数量也较非增生性瘢痕组织明显增多。１８神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第３章图３．３度Ⅲ、一图３－４幼稚肥大细胞，核大，核质比大，胞质内颗粒少ｘ１００００１９神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第３章３．４讨论ＭＣ不仅是瘙痒介质组胺最主要的来源，而且作为免疫反应的效应细胞参与宿 主抗感染免疫和启动超敏反应等。皮肤真皮中含有丰富的ＭＣ， 主要分布在真皮血管、毛囊、神经和皮质腺剧围，肥大细胞脱颗粒除释放组胺外，还可释放嗜酸粒 细胞趋化因子，中性粒细胞趋化因子，引起粒细胞渗出而在免疫反应、炎症反应过程及正常生理过程中起重要的作用黔７６１。因此对ＭＣ的形态结构、活化状态、与神经和血管等的关系的研究是了解瘢痕瘙痒发生机制的重要一环。 肥大细胞有三种颗粒‘７７］：（１）高电子密度颗粒，有些颗粒中可有结晶状结构；（２） 低电子密度颗粒呈网状结晶结构；（３）有些颗粒内同时含有不同电子密度的内容物． 胞浆内有数量不等的空泡，空泡被膜完整或一些细胞膜消失，细胞周围可见许多颗 粒，形态结构与胞浆内颗粒无明显区别。Ｓｅｎｇｏｋｕ等认为肥大细胞脱颗粒时的形态 变化有三个特征：（１）胞浆内颗粒肿胀；（２）伴有电子密度减低的纤维素样和网状改 变颗粒；（３）颗粒物质消失，胞浆内遗有空泡。Ｓｈｉｏｔａ的研究表明，肉芽组织、增殖 性瘢痕、成熟瘢痕的肥大细胞数量显著不同。肉芽组织出现肥大细胞，趋向于产生 增殖性瘢痕。本实验结果也与此相似：瘢痕增生越明显，其肥大细胞数量就越多。 经观察我们发现正常皮肤肥大细胞多含高电子密度颗粒，而增生性瘢痕中活化的肥 大细胞可见颗粒变大、密度减低、电子密度不均及空泡形成，正处于脱颗粒过程 中‘７８－７９］。Ｃｒａｉｇ［８０１认为不成熟的肥大细胞体积小、核质比大、胞质内颗粒少且小， 缺乏激活特征。但本研究观察到在增殖性瘢痕中这种幼稚的肥大细胞也有脱颗粒 现象，因此认为幼稚的肥大细胞也有功能活动。增生性瘢痕中ＭＣ及内分泌颗粒 数量多，幼稚的肥大细胞数量也明显多于非增生性瘢痕和正常皮肤，为增生性瘢 痕瘙瘁发生的物质基础。 体外培养材料电镜观察发现，肥大细胞的颗粒可转移到相邻的血管内皮细胞 中Ｉ：８ｌＪ，肥大细胞颗粒所含成分之一肝素，可诱导毛细血管内皮细胞的增殖与迁移， 促进新生血管的形成。我们观察到正常皮肤组织内肥大细胞聚集在血管剧围，无血 管区域很难找到肥大细胞，而增生性瘢痕的新生毛细血管增多与扩张，毛细血管之 间肥大细胞仍较丰富呈明显的脱颗粒状态。毛细血管的增多与肥大细胞释放的肝 素等物质有关，同时肥火细胞颗粒释放的组胺等可引起血管通透性的增加，促使２０神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第３章毛细血管的扩张。本实验还观察到增生性瘢痕组织内肥大细胞与神经纤维接触明 显地增多，且相接触的肥大细胞多呈活化现象。还有的肥大细胞与成纤维细胞密切 接触，细胞膜融合，成纤维细胞呈功能活跃状态，肥大细胞町通过膜膜接触向成纤 维细胞释放血小板激活凶子等生物活性物质，它可引起血小板释放血小板源生长 因子，从而促使成纤维细胞活化，促使其合成胶原、基质。肥大细胞所释放的组胺 能刺激成纤维细胞增殖，使它功能活跃，纤维增生，组织内聚积细胞外基质，其分 泌的细胞因子又能导致成纤维细胞分泌大量的酶及细胞因子等［８２，８３１。这提示在上 皮组织增生时，结缔组织肥大细胞功能活动受神经递质的调节。肥大细胞与神经纤 维在形态上的密切接触，说明二者在功能上的相互作用，共同参与对局部组织微 环境的调节。神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第４章第４章人瘢痕和皮肤中肥大细胞的分离和鉴定４．１材料４．１．１标本：来源同前 ４．１．２主要试剂 ＲＰＭｌｌ６４０培养基 Ｉ型胶原酶 透明质酸酶 胎牛血清 Ｌ．谷氨酰胺ＨＥＰＥＳ美国Ｇｉｂｃｏ公司 美国Ｇｉｂｃｏ公司 美国Ｇｉｂｃｏ公司 美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司 美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司 美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司 美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司二甲基亚砜 ４．１．３实验耗材 ７ｍｌ离心管 １５ｍｌ离心管 ３５ｍｍ培养皿 ２ｍｌ内螺口冻存管 ６孔培养板 ４．１．４主要设备和仪器 Ａｌｌｅｇｒａ６Ｒ离心机Ｈｅａｌ Ｆｏｒｃｅ Ｈｅｒａｅｕｓ美目Ｃｏｍｉｎｇ公司 美国Ｃｏｍｉｎｇ公司 美国Ｃｏｍｉｎｇ公司 美国Ｃｏｍｉｎｇ公司 美国Ｃｏｍｉｎｇ公司美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司Ｆｏｒｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ．ＨＫＨＦｓａｆｅｌ２００生物安全柜ＨｅａｌＣ０２培养箱德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司 日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司 日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司 德国ＳＧ公司 日本ＨＩＲＡＹＡＭＡ 广东东方电热设备厂Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置相差显微镜 Ｏｌｙｍｐｕｓ荧光显微镜 ＳＧ超纯水系统ＳＧ一２０００ＨＩＣＬＡＶＥＨＶ－８５高压蒸汽灭菌锅东方一Ｂ型风热式电热干燥箱神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第４章ＹＴＰ３５０电子消毒柜 ＳＩＥＭＥＮＳ普通冰箱 液氮罐 深低温冰箱 ＤＫ．８０型电热恒温水槽 ４．１．５主要试剂配制 ＨＥＰＥＳ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ广东新成电器公司 西门子有限公司ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ公司德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司 上海精宏设备有限公司ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ，羟乙基哌嗪乙磺酸）：分子量２３８．３。取２．３８３９，加超纯水至１０ｍｌ，充分溶解，浓度为ｌｍｏｌ／Ｌ。滤膜过滤除菌， 用无菌１．５管ｍｌＥＰ分装，每支ｌｍｌ，一２０。Ｃ保存。每ｌＯＯｍｌ培养液中加入０．２ｍｌ，使 用浓度２ｍｏｌ／Ｌ。 Ｌ．谷氨酰胺：分子量１４６．１５。取Ｏ．２９２９放入小烧杯中，加超纯水至１０ｍｌ，充 分溶解，浓度为２００ ｍｏｌ／Ｌ，过滤除菌，用无菌１．５ｍｌＥＰ管分装，每支ｌｍｌ，一２０。Ｃ保 存。使用浓度２ｍｏｌ／Ｌ。 改良的Ｔｙｒｏｄｅ液：含ＮａＣｌｌ３７ｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ２．７ 糖５．６ｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ 装，室温保存。 Ｈａｎｋｓ液：ＫＣｌ０．４９、ＫＨ２Ｐ０４ ０．０６９、ＭｇＣｌ２‘６Ｈ２０ ０．１０９、ＭｇＳ０４。７Ｈ２０ １０ｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ｍｏｌ／Ｌ、Ｎａｉｌ２Ｐ０４Ｏ．４ｍｏｔ／Ｌ、葡萄ｌｍｏｌ／Ｌ以及ＭｇＣｌ２ Ｉｍｏｌ／Ｌ。过滤除菌，分０．１０９、ＣａＣｌ２ ０．１４９、ＮａＣＩ ８．００９、ＮａＨＣ０３ Ｏ．３５９、Ｎａ２ＨＰ０４。７Ｈ２００．０９９、葡萄糖１．００９加超纯水至１０００ｍｌ。过滤除菌，分装，室温保存。 消化液配制：消化皮肤：ｌｍｇ／ｍｌ Ｉ型胶原酶＋１ ｍｇ／ｍｌ透明质酸酶；消化瘢痕： ３ｍ∥ｍｌ ｌ型胶原酶＋ｌｍｇ／ｍｌ透明质酸酶，均以含２０％胎牛血清的Ｈａｎｋｓ液配制。 实验前临时配。 双抗贮存液（１万单位／）：青霉素钠１００万单位，链霉素１００万单位，加无菌 超纯水至１００ｍｌ，充分溶解后分装，一２０。Ｃ储存备用。 培养液配制：一包ＲＰＭｌｌ６４０培养基加超纯水至１０００ｍｌ并加２ ２９碳酸氢钠， 用磁力搅拌器搅拌ｌ小时，使之充分溶解，调节至ＰＨ至７．２～７．４。过滤除苗，分 装成９０ｍｌ。一２０。Ｃ保存。使用时加入胎牛血清１０ｒａｌ，配成１０％体积比浓度，并加 入ＨＥＰＥＳ。含血清培养液４ ０Ｃ保存，使用超过２周，添加等量Ｌ一谷氨酰胺。 细胞冻存液：按培养液和ＤＭＳＯ为９：ｌ的比例配制。４℃保存。神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第４章４．２方法４．２．１肥大细胞的分离‘酬 ①手术切取的人皮肤、瘢痕组织除去皮下脂肪，用改良的Ｔｙｒｏｄｅ液清洗皮片 ②将皮片剪成ｌｍｍ×ｌｍｍ大小，放入三角瓶中，按每克组织加２０ｍｌ消化液 （皮肤：ｌｍＮｍｌ Ｉ型胶原酶＋１ ｍ∥ｍｌ透明质酸酶；瘢痕：３ｍｇ／ｍｌ Ｉ型胶原酶＋１ｍｆｆｍｌ 透明质酸酶，均以含２０％胎牛血清的Ｈａｎｋｓ液配制）的比例进行消化，在３７。Ｃ摇 动水浴箱中孵育４ｈ。 ③在３７℃条件下，用磁力搅拌器搅拌消化物４５ｍｉｎ ④将消化物静置片刻，待残留的组织块沉到瓶底后，用注射器吸出上层悬液， 存放于另一容器中。 ⑤将残留的组织块用注射器挤压分散，再用吸管充分吹打分散细胞。静置片 刻后，尽量吸出上层悬液，与前面收集的悬液混合。 ⑥用孔径为１００１，ｔｍ的不锈钢滤网过滤悬液，除去组织碎片和较大的细胞团， 收集滤液 ⑦在４。Ｃ条件Ｆ离心滤液（１５０９，５ｍｉｎ），弃上清夜，用冰冷的Ｔｙｒｏｄｅ液重新悬 浮沉淀细胞，再离心，弃上清液。 ⑧将细胞悬浮于含ｌＯ％胎牛血清及１００ＩＵ／ｍｌ青霉素和庆大霉素的ＲＰＭｌｌ６４０ 培养液中，取少量细胞悬液制成涂片，快速冷风吹干，用Ｏ．１％甲苯胺蓝染色，０．１％ 番红复染，鉴定并计数肥大细胞。 ⑨调节细胞密度，使每毫升混合细胞悬液中肥大细胞数达到５×１０５个／ｍｌ ⑩按１ ｍｌ／－ｆＬ接种于６孔培养板中，于３７。Ｃ、５％Ｃ０２、饱和湿度的培养箱培 养约１２ｈ。 ４．２．２统计学分析 所有计量资料以数据以均值加减标准差（ｒ曩）表示，均值自身前后比较，采用 配对ｔ检验；多组组间均值的比较用单因素方差分析，由统计软件ＳＰＳＳｌｌ．５软件 完成。ａ＝０．０５２４神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第４章４．３结果分散的肥大细胞结构完整，直径在ｌＯｐｍ左右。培养１２ｈ的细胞悬液中大部分 黏附能力强的细胞已贴壁，而肥大细胞黏附性较差，轻轻摇动就可重新悬浮于培 养液中。 肥大细胞甲苯胺蓝、番红染色：细胞体积大，核呈蓝色，胞浆呈红色。（附图４―１、 ２）在×４００放大倍率下，三组标本各随机选取１５个视野，计数皮肤、非增生性瘢 痕及增生性瘢痕组织分离出的肥大细胞数量（表４―１）：肥大细胞占有核细胞的百 分比在皮肤、非增生性瘢痕及增生性瘢痕组织中逐渐增加，但皮肤组与非增生性 瘢痕组之间的差异不明显ｒＰ＞０．０５），而增生性瘢痕组与以上两组之间均有显著性差 异（Ｐ＜Ｏ．叭）。表４ １各组织中肥大细胞占有核细胞的百分比＠±ｓ，％）注：与正常皮肤比：＋序０．０５搴宰只Ｏ．０ｌ与非增生性瘢痕比：料爿０．０ｌ４．４讨论肥大细胞作为免疫系统的结构成分存在于多种组织内，并因所在组织器官的 不同具有不同的功能。肥大细胞是参与丰ｌ｜１经一免疫一内分泌网络调节的一种关键细胞， 参与人体多种生理和病理功能的调节【８“。因此．研究肥大细胞的生物学性质具有重 要的理论意义和广泛的应用价值。随着科学的进展，国内、外学者在日益关注并深 入对肥大细胞进行研究。 目前，对肥大细胞的研究还主要集中在组织水平上，大多应用组织化学的方 法对肥大细胞进行研究，而对离体培养的肥大细胞进行干预的研究甚少，一方面 是由于组织中肥大细胞的数量较少，分离出来较困难；另一方面则是因为肥大细神经肽Ｐ物质影响瘢痕中肥大细胞释放组胺的实验研究第４章胞在体外培养所要求的条件较苛刻、生存时间短、不增殖。随着实验技术和实验 条件的不断改进和完善，现已可以在体外对大鼠等的皮肤、肺以及肠的肥大细胞 进行培养。本研究借鉴Ｂａｒｒｅｔｔ等的方法并稍作改良对人德痕组织中的肥大细胞进 行分离，经Ｍｅｄｉｉｎｅ文献检索尚未见报导。由于瘢痕组织中有大量的胶原纤维，经 过反复探索，发现按每克组织加２０ｍｌ消化液计算，消化皮肤时：Ｉ型胶原酶和透 明质酸酶的浓度均为ｌｍ∥ｍｌ即可；而在消化瘢痕时，当Ｉ型胶原酶的浓度达到 ３ｍｇ／ｍ１}