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人工伴侣辅助变性溶菌酶复性的研究
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蛋清溶菌酶稀释复性过程中集聚体和中间态的研究
本文以溶菌酶为模型蛋白研究了蛋白质的复性机理。用荧光相图法研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程的中间态，用阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效凝胶排阻层析法(SEC)研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程形成的集聚体。本研究结果为探索蛋白质折叠机理提供了有益的帮助。
在用荧光相图法研究脲和盐酸胍诱导去折叠蛋清溶菌酶的折叠过程中发现：当去折叠体系中有还原剂β-巯基乙醇时，还原变性溶菌酶的稀释复性过程中都没有中间态产生，符合典型的“二态模型”；当去折叠体系中没有还原剂存在时，变性溶菌酶的稀释复性过程中都会产生两个中间态，符合“四态模型”。
当用复性缓冲液稀释还原脲变性溶菌酶时，会迅速产生可观量的沉淀。上清液和沉淀的非还原SDS-PAGE结果表明还原脲变性溶菌酶除了能直接复性成天然态溶菌酶分子外，还能在上清液中形成溶菌酶分子三聚体，同时在沉淀中形成溶菌酶分子二聚体。上清液的SEC分析结果也验证了上清液中含有溶菌酶分子三聚体。上清液和沉淀的还原SDS-PAGE结果表明，二聚体和三聚体主要是还原脲变性溶菌酶分子通过分子间二硫键错配形成的。同时沉淀的阴极PAGE电泳和在复性过程中加入SDS的复性结果表明复性过程中形成的二聚体是可溶的，可溶的溶菌酶分子二聚体之间通过非共价键相互作用形成了溶菌酶分子四聚体沉淀。
非还原脲变性溶菌酶稀释复性液的非还原SDS-PAGE结果表明当溶菌酶浓度小于7.0mg/mL时，复性过程中不会形成集聚体；而当溶菌酶浓度大于7.0mg/mL时，复性过程中会形成溶菌酶分子二聚体和三聚体。复性液的阴极PAGE表明，当溶菌酶浓度小于4.0mg/mL时，复性过程中不会形成集聚体；而当溶菌酶浓度大于4.0mg/mL时，复性过程中会形成溶菌酶分子二聚体和三聚体。同时，复性液的SEC结果也证实了非还原脲变性蛋清溶菌酶在复性过程中产生了溶菌酶分子二聚体和三聚体。
综合以上实验结果可以得出以下结论：(Ⅰ)还原脲和盐酸胍变性溶菌酶的稀释复性过程中没有中间态产生，它们的复性过程均为“二态过程”。还原脲变性溶菌酶的稀释复性过程为：还原脲变性溶菌酶分子通过分子间二硫键错配形成可溶的溶菌酶分子二聚体和三聚体，然后可溶的二聚体之间以非共价键相互作用形成四聚体沉淀。(Ⅱ)非还原脲和盐酸胍变性溶菌酶的稀释复性过程中都产生两个中间态，它们的复性过程均为“四态过程”。非还原脲变性溶菌酶的稀释复性过程为：当溶菌酶浓度小于4.0mg/mL时，复性过程中不形成集聚体；当溶菌酶浓度为4.0～7.0mg/mL时，中间态会由于分子间非共价键相互作用形成二聚体和三聚体；当溶菌酶浓度大于7.0mg/mL时，中间态会形成集聚体凝胶。
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TG115.222.3
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蛋白质复性
蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的（denaturation）。变性作用并不引起的破坏，而是以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为。
蛋白质复性
变性后的蛋白质称为
因受某些物理或化学因素的影响
分子的空间被破坏
复性，如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。如果变性条件不剧烈，这种 是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下 可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。例如加热至80～90℃时，失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37℃，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。
分离 并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆 ，回收后，加入 溶解，使之成为可溶性伸展态，再除去使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低。究其原因，蛋白质的 虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展 折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。
为了有的放矢地开发辅助蛋白质复性的技术，研究工作者纷纷开展了对 机制的探讨。目前有两种不同的假设：一种假设认为， 中的局部肽段先形成一些 单元，如 、 、 等 ，然后再由单元的组合、排列，形成 ；另一种假设认为，首先是由内部的 导致一个塌陷过程，然后经逐步调整，形成不同层次的结构。尽管是不同的假设，但很多学者都认为有一个所谓‘ 熔球态’的。在 熔球态中，蛋白质的 已基本形成，其整体 也初具规模。此后，分子 再做一些局部调整，最终形成正确的。总之， 的具体步骤可用下式描述：U→I→N↓A即伸展态U经过早期变化成为I，然后由过渡到最后的天然态N。但是从 折叠为天然态的同时，另有一条旁路，即相互聚集为凝聚物A( )。在折叠反应中，从伸展态到 的形成是非常快速的，一般在毫秒范围内完成，但从转变为天然态的过程比较缓慢，是反应的限速步骤。当溶液中或浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种 ，一是分子内的，二是部分折叠的 分子间的。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性。因此，在复性过程中，抑制间的 以防止聚集，是提高复性收率的关键。
80年代后期，人们开展了广泛的蛋白质复性研究。例如，Carlson等发现，具有协助蛋白质复性的作用；Cleland等发现，向稀释的 溶液中加入适当浓度的，可抑制蛋白质复性过程中的 ，使蛋白质复性收率提高两倍；Hagen等利用 人工变性的蛋白质后去除 进行复性，复性率可达100%(但由于的存在，萃取率很低)；Batas等利用介质的作用可防止间的接触和凝聚，辅助其正确折叠；Zardeneta等利用及混合，成功地辅助了脲变性酶复性。
与直链糊精辅助蛋白质复性的研究1995年，Karuppiah 和Sharma发表文章，介绍了使用 辅助B的复性。 由 通过 基 降解制得，是由D-单元以α-1，4-糖苷键相互结合成互为椅式 的环状，其分子通常含有6～12个吡喃单元。有实用意义的是含6、7、8个吡喃 单元的α、β、 γ-，但α-空腔较小，γ-价格昂贵，常用的是β-。 的特征是能形成包络化合物，客体分子从宽口端进入其分子空腔。包络物的形成主要靠非 相互作用如、 、 、几何形状匹配等。利用 的空腔结合
的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为 。1999年，Sundari等报道了用直链糊精辅助胰岛素、碳酸酐酶和复性，发现直链糊精基本上能够模拟 在辅助蛋白质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直链糊精的 形成一个疏水性，可以结合更多的蛋白质分子；在水中 较高，有利于提高复性酶浓度和实验操作；价格比便宜，实际应用前景广阔。?
重复利用性及稳定性
近来，越来越多的有关 的研究已转向利用GroE家族。有些学者已成功地利用分子伴侣在体内和体外辅助蛋白质复性[12、13]。但分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并需要与复性 等缺点，因此研究开发分子伴侣的重复利用性及稳定性是实现其应用的关键。GroEL具有 的作用，相当于 的亲和。 GroEL柱( )相当于 的 ，从而可提高样品的处理量，并使蛋白质在复性的同时得到浓缩和纯化。其特点在于：①不仅可以解决 的重复利用问题，而且由于 的利用(近于流)，可提高的利用效率；②由于采用连续操作，原料处理量大，产品可以得到浓缩、纯化；③易于建立相关的模型，对于放大生产具有重要的指导作用。Teshima等利用 ，在体外辅助了、 、的折叠复性。还有报道利用“小 ”对目标蛋白质进行复性[15、16]。“小 ”是指GroEL的一个片段，而这个片段并不是GroEL的水解产物，而是由后包括GroEL191-345 片段(16.7kD)或191-376片段(21kD)密码的基因片段在大肠杆菌中的表达产物。它们能有效地促进 亲环、酶以及 的复性。由于“小 ”分子较小，更适合于 ，且不需另加复性辅助因子(如GroES和ATP等)，因此具有很大的应用前景。 5. 人工 在蛋白质复性中的应用受蛋白质 辅助蛋白质复性的启发，Rozema和Gellman对人工体系(+ )辅助 和鸡蛋白 复性进行了研究[17、18]。与 GroEL+ATP辅助复性的作用机制相似，其复性过程分为两步进行：第一步捕获阶段，在 溶液中加入去污剂，去污剂分子通过 与蛋白质的疏水位点结合形成复合体，抑制 间的相互聚集；第二步剥离阶段，加入 ，由于分子对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使 多在此过程中正确折叠为 [17、18]。其反应机制可用下式表示：U→U-dn→→→U-dn-m→→→F→N即伸展态U首先与去污剂d形成 物U-dn，加入 后，小分子去污剂被逐次剥离下来，变为部分折叠、不含去污剂分子的非活性状态F，进而折叠为天然 N。与GroE等蛋白质 相比，联合使用去污剂和 作为人工辅助蛋白质复性具有明显的优点：①人工不属于蛋白质，不易受而失活，操作条件较为宽松；②去污剂和均可直接购买，省去 的步骤；③去污剂与的分子量较小，容易与 ，有利于提高工业生产效率。?
冷冻结晶脱盐
冷冻结晶在蛋白质复性研究方面的一些提示（集中精力在和缓的降低变性盐浓度上，之前的所有方法基本都是用稀释液体去增大体积，这个方法是让变性盐脱离溶液……）。通常意义上人们普遍认为冷冻是一种变性因素，原因是在溶液的冻结过程中会伴随发生物态的巨大变化，进而导致蛋白质分子表面的离子氛围、pH、水化状态等各种因素的改变，因此变性也就是自然而然的结果。不过从事生物领域的多半都有冻存细胞的经历，由此可以得出结论，在合适的存在的条件下，蛋白是可以耐受低温的。或者至少能有相当的蛋白能在低温下保持活性。况且在变性液体中也不存在有活性的蛋白质，本身都是以 自由肽链的形式存在，因此冷冻对肽链的损伤似乎可以不用考虑（对此还需要进一步的研究）。换个角度从物理学方面看，“冰”是一种 ，其生成过程中会自动排除其中的杂质。这也就是为何海上的冰山都是淡水的缘故。通常人们用于溶解
的液体是高浓度的变性盐（一般是8M的，或者6M的 ，两种盐的密度都在1.3左右），而这种溶质的溶解度受温度影响很大。随着温度的降低，会发生饱和、过饱和、结晶析出现象。溶质结晶析出自然也就意味着溶液浓度的下降，进而使变性能力的下降。下降到一定程度时， 其内在的塌缩的趋势逐渐占据优势，引导进行自行复性至其活性状态，即能级最低状态。也就是说，折叠的 动力是由的 （氨基酸序列）决定的， 人类直到目前所能做的复性过程其实质不过就是提供了一个变性能力和缓下降的变性体系（由 或者 的浓度下降来实现）。在这个过程中最需要防止的就是之间的错误折叠（链间形成 ），这会产生“雪崩样”的效果，导致大量多聚体沉淀（密度也是1.3左右）。
冷冻方式用于蛋白复性可能的优势有几个方面。一、这种方式的简单易行，只需要冷冻设备即可；二、此方法的运用可以导致溶液体积的减少，很大程度上对蛋白进行浓缩，方便下一步的处理；三、变性盐以结晶沉淀方式脱离溶液，防止大量高污染复性尾液的产生；四、此方法的体系完全开放，可以很好的对接其他复性方式。至少冷冻一下降低一些初始变性盐浓度也是相当有价值的；五、此方法即便失败也几乎没有任何损失，体系可以很方便的复原，这一点是目前其他任何方法都不具备的，极其适合科研探索。　 　 　6、蛋白质的高压冷结晶复性法：如果把蛋白复性仅只理解为肽链在不同变性浓度中的存在状态。那么蛋白复性就没什么难的，无非是把 浓度从4M平缓的降低到2M即可。冷结晶析出无疑找到了一条行之有效的途径。但是之前的冷结晶方法似乎有个硬伤，也就是2M尿素时的溶解度，有可能相对的温度在零下——液体冻结对蛋白活性的实质伤害。解决办法可以加入甘油之类的防冻剂降低水的冰点。另外如果将结晶物理学的一些原理加于其中应该即可解决这个问题。在 的固液汽三相变化中，水是种异类。 其在零上4度的液体时拥有最大密度。固体变为冰时，其体积反倒变大，密度变小。在 强下，水的冰点下降。冰雪踩上去打滑就是冰在 强下融化的日常例子。而尿素之类的变性盐其固体密度大，强更能促进它们结晶析出。只是目前还不知道能以何种的压强达到目的，希望不会有太高的要求。更有可能的是辅助以防冻剂来达到所需效果。
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