南京大学模式动物研究所
1.&为什么选择国家遗传工程小鼠资源库？
国家遗传工程小鼠资源库（NRCMM）是中国科技部唯一认证的遗传工程小鼠种子中心。资源库致力于小鼠遗传学研究和基因组改造技术的开发。已建立先进可靠的小鼠基因修饰平台，包括基因敲除，基因敲入，转基因，ENU化学诱变等。NRCMM是中国现有的最大的小鼠品系保种中旬，包括多种疾病模型，如心血管，肥胖，糖尿病，免疫缺陷，老年痴呆，肿瘤等模型，并成为我国最早获得AAALAC国际动物管理认证的国家级动物中心。我们连续3次通过了国际AAALAC完全认证。目前已为国内数百家单位、包括多家跨国医药企业，大学，研究所，医院等成功制备了众多基因改造小鼠品系。2012年，NRCMM作为中国唯一一家单位加入国际小鼠表型分析联盟（IMPC），致力于建立标准化的小鼠表型分析平台。
2.&贵公司提供哪些技术服务？
我们可以提供的技术服务有：
1）&遗传工程小鼠的制作，包括转基因（包括大片段转基因，如基于BAC的转基因），基因敲除（包括conventional KO, conditional KO, KI, Targeted mutation等），以及更为复杂的基因组改造小鼠模型；
2）&胚胎冷冻，复苏及代理繁育服务；
3）&培训服务，包括小鼠品系饲养与管理，遗传工程小鼠的制作，载体构建，ES 细胞的培养及电转，胚胎显微注射等；
4）&表型分析，包括全身的发育及生理学分析（比如行为学实验、听觉和视力测试、心电图和超声波测试、代谢测试及X-ray与骨密度测试等），组织病理学分析，分子水平分析。
3.&什么是常规的敲除（conventional knockout），什么是条件性敲除（conditional knockout），两者之间有什么区别？
在常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）策略中，我们会通过同源重组技术，将基因组上的目的片段替换成一个Antibiotic Selection Marker，如PGK-Neomycin等。由于我们使用的neomycin标记两侧有loxp位点，即loxp-PGK-neomycin-loxp结构，我们可以在中靶ES克隆中 表达Cre重组酶去除PGK-neomycin标记，当然，也可以选择在得到小鼠后，与全身表达Cre的小鼠交配的方式来去除这个标记。
在条件型敲除（Conditional KO）策略中，我们会通过同源重组技术，在目的片段的两侧各引入一个loxp位点，其中，1st loxp是独立的loxp位点，2nd loxp位点旁边带有Neomycin标记，这里使用的PGK-neomycin两侧添加了FRT位点，即FRT-PGK-neomycin-FRT-loxp，我们可以在中靶ES克隆中表达Flpe重组酶去除PGK-neomycin标记，也可以在小鼠中完成，当然，也可以直接 与组织特异性表达cre的品系交配，去除目的片段和筛选标记。
与常规敲除相比，条件型敲除能够与不同组织特异性的Cre交配而得到不同组织特异性的敲除模型，因此，具有更大的应用价值。
4.&什么是KO Frist，与条件性敲除有什么区别？
传统的conditional KO的做法是在需要敲除的片段（我们称为Critical region，下同）两侧各放置一个loxp site，为了便于筛选，我们在其中一个loxp site旁边同时带上Neomycin标记，此标记两侧带有FRT位点（即FRT-Neo-FRT-loxp）。这样的小鼠我们称为flox小鼠，将 flox小鼠与Flpe （识别FRT位点的重组酶）品系交配可以删除Neo标记，得到不带Neo标记的flox小鼠。flox小鼠与Cre表达品系交配可以删除两个loxp位点 之间的部分，包括Critical region及Neomycin标记。Cre品系是各种组织、细胞特异表达Cre重组酶的转基因或基因敲入小鼠，将flox小鼠与它们交配就实现了组织、 细胞特异的敲除，即Conditional敲除。
KO first与conditional KO最大的不同在于，我们在上述neymycin标记的位置的元件更为复杂，是一个带有剪接受体位点的LacZ和Neomycin的合并体。这 样，neomycin作为筛选标记，功能与上述conditional KO中一致，LacZ就能够作为reporter在目的基因的promoter启动下，与目的基因一同表达，可以方便地对目的基因的表达进行定位。同样， 与Flpe表达品系交配可以删除lacZ-neo标记，转变成常规的conditional KO的flox小鼠。
在与Flpe品系交配之前，KO first模型的flox小鼠与conditional KO模型的flox小鼠不同，conditonal KO中的flox小鼠表型正常，但KO first却是KO （knockout)表型。与Flpe品系交配之后，两种策略的flox小鼠相同，都表现正常。
一般来说，conditional KO带有neomycin的小鼠可以直接用cre品系交配获得条件型敲除的鼠，但是，KO first必须先与Flpe品系交配后再与Cre品系交配，因此，在时间上会多一代时间。
5.&什么是转基因小鼠模型？
对于普通的转基因，表达的区域将取决于启动子。如果选择全身表达的启动子，如Rosa26, CAG等，将得到全身表达的转基因小鼠；如果选择一些组织特异性表达的基因的启动子，将得到组织特异性表达的转基因小鼠，如在AP2的promoter启 动下进行表达，会得到脂肪组织特异表达的转基因小鼠。
需要特别说明的是，这种转基因的策略是将转基因片段直接注射到小鼠的受精卵中，转基因片段将会在小鼠基因组中进行随机插入，因为是完全随机的，有 可能会插入到一些抑制区导致转入的基因不表达，也有可能插入到一些增强区导致转入的基因高表达。通过原核注射的方法得到的第一代转基因小鼠称为 founder（首建鼠），由于上述随机性，每一只founder都是不一样的，以每一只founder起源的品系称为line，不同的line 之间的表达可能会有差异。
6.&如果客户需要研究的基因在国际的数据库中有现成的活体小鼠或是胚胎干细胞，公司可以提供代理进出口服务吗？
我们可以提供活体小鼠，冷冻胚胎，ES细胞及精子等得代理进口服务，您可以联系我们的进出口部门（tel：025-，email：）。
7.&你们接受打靶载体及正确中靶的胚胎干细胞之后的服务吗?
我们可以接受来自于外单位的打靶载体或是ES细胞，但是对于外单位提供的载体（包括直接进口载体）来说，因为载体不是按照我们自己的体系来构建的，在ES的鉴定过程中缺乏阳性对照，结果很难判断，而且我们这边的鉴定采用PCR及Southern blot，大多数从KOMP进口的载体都没有在设计的初期将Southern blot的酶切位点加入进去，后期的鉴定会非常困难。在周期上，如果进口载体大概需要2-3个月左右，单是后期鉴定花的时间可能会比较长；如有从头构建的话，大概需要3-4个月，后期筛选会顺利一些，所以建议您最好从载体开始构建。
对于外单位提供的胚胎干细胞（包括进口细胞），因为正确重组的胚胎干细胞本身不是我们构建的，所以我们不保证使用该细胞一定可以得到嵌合鼠或是嵌合鼠一定可以遗传，但是我们保证为客户注射至少400枚囊胚，因为根据我们的经验，即使在细胞状态不太好或者细胞GLT(germline transmission)的比例较低的情况下，注射这个数量的囊胚也可以得到预期的结果。
8.&对于基因敲除，条件性基因敲除，基因敲入及基因突变项目，你们提供什么背景的服务，区别在哪里？
我们提供两种背景：C56BL/6N及129S6/SvEvTac。他们的区别在于：
129来源的ES培养相对容易，有较强的GLT潜力，即容易得到可遗传的F1代flox杂合子。但是，129品系的亚系非常多，遗传背景差异大，因此表型差异也比较大，有研究 证明129品系不适合做神经学、免疫学等方面的研究。因此，用129背景做出来的敲除模型一般都需要回交到C57BL/6等清晰的近交系背景，这 需要5-10代，也就是2年左右的时间。
C57BL/6是应用最为广泛的近交系，遗传背景也很清晰，因此，在实验中的反应和表型更一致，得到的结果重复性也会更好。但是，相对于129品 系，C57BL/6来源的ES培养要求更高，而且GLT的能力较弱，比129背景更难得到可遗传的F1代杂合子。对于我们来说，成本会更高，这也是价格较高的原因。C57BL/6来源 的敲除模型直接与C57BL/6回交就是纯的近交系，不需要像129那样回交5-10代，因此，会节省时间。
9.&对于转基因项目，你们提供什么背景的服务，区别在哪里？
我们主要提供两种背景：C56BL/6J及B6CBF1。他们的区别在于：B6CBF1是杂合背景，有杂交优势，生殖能力比较好；B6是纯背景的近交系，繁育能力要弱一些，对于我们来说B6背景在制作转基因小鼠上技术难度会大一些，所以费用也相对贵一些。我们认为杂合背景可能对某些基因的表达会有一定影响，而纯背景对基因表达的反应程度比较均一，也就是说不同背景对某些基因的表达的反应程度应该是不一样的，后期出现的表型可能也有区别。B6背景是目前国际上运用的最广泛的小鼠，遗传背景非常清楚，公共数据库中的小鼠基因组全序列也是用 C57BL/6基因组为模板测出来的，您可以根据您的实验来选择品系背景。
另外我们也可以根据客户的具体要求提供其他背景的转基因小鼠制作服务，如FVB，129等，小鼠准备的时间要比常规背景要稍长一些。
10.&委托你们制备基因敲除/转基因小鼠需要提供哪些材料，流程是怎样的？
您需要向我们提供基因的名称或者ID，类型，选择的背景，相关的参考文献。
基因敲除小鼠制作流程：确定敲除方案--签订合同（预付第一笔款项）--构建打靶载体--纯化打靶载体--电转载体到ES--ES的抗生素筛选--ES的PCR及Southern blot筛选--囊胚注射及移植--嵌合鼠鉴定--嵌合鼠回交--F1代杂合子鉴定--通知取鼠--胚胎冷冻。
转基因小鼠制作流程：表达载体构建----原核注射----founder鼠。我们首先会跟您沟通方案，确定方案后，我们就可以签订协议和项目启动。您首先需要告诉我们您想做成什么样的转基因小鼠模型，是否能提供CDNA，promoter选择那种，是否还需要加标签等信息。
11.&从DNA原核注射到得到Founder鼠（首建鼠）需要多长时间？
通常，从纯化得到DNA到交付首建鼠大约需要8周（1~2周完成显微注射，3周左右幼仔出生，小鼠鉴定和交付前还需要3-4周）。DNA制备的质量和浓度测定的准确性会显著地影响结题周期。
12.&公司最后提供给客户多少只F1代小鼠？有相关的检测方法或检测报告吗？
我们最终提供给您4只Flox的杂合子小鼠，得到足够数量的杂合子小鼠后，我们会将该项目的Final report和genotyping protocol一并发给您。
13.&贵公司可以提供分离和制作原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）吗？
我们可以根据您的需要为您分离、制作原代Mef细胞，您需要告诉我们您想做的品系的名称，需要的基因型，一般一种基因型我们会提供给您3管冻存的P1代Mef细胞。
14.&制备的小鼠如何完成运输？
小鼠可以由您派专人过来取，也可以我们负责给您安排小鼠的铁路或是航空运输。
15.&如何付款？
在双方签署的最终协议上有我们的付款账户信息，客户可以直接汇款到此账户，电汇或是支票支付都可以。
客户可以按照协议中约定的方式分期支付或者是一次性全额付清。财务只有确认款已到账后才能开出发票。热搜TAGS：
转基因动物的研究进展与应用前景
转基因动物(transgenic animal)是在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA重组技术的基础上，通过实验方法人为地将人们所需要的目的外源基因导人某种动物的受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，随细胞的分裂而增殖，且能稳定地遗传给后代的一类动物。其实质就是按人们的需要有计划、有目的地定向改造动物的遗传组成，赋予转基因动物新的特征，使之更好地为人类服务。
1转基因动物的培育方法
胚胎干细胞技术(embryonic stem cells，ES)：ES细胞在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞，当被注入囊胚腔后．可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成．因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移，产生转基因动物。
2转基因动物的研究现状
转基因动物研究的重点包括：开展培育具有优良性状、提高抗病力的家畜育种、建立“生物反应器”和疾病模型进行药物筛选等方面。
2．1转基因鼠：Palmiter将大鼠生长激素基因与金属硫蛋白基因启动子拼接成融合基因，导入小鼠受精卵后，获得了称为“硕鼠(supermollse)”的转基因小鼠，这是外源基因首次在动物体内得到表达，被认为是世界上首批转基因动物。1987年，美国的Gordon等人首次报道在小鼠的乳腺组织中表达了人的tPA基因。英国人将克隆羊的B一球蛋白(BLG)基因转导人小鼠的受精卵，得到了携带有BLG基因的转基因小鼠，从而改良了乳汁品质．提高了乳汁营养价值，获得了可稳定遗传的新性状。
2．2转基因猪：为解决猪——人异种移植的超强免疫排斥反应，以缓解人体器官短缺的困难，英国科学家首次采用人的基因注入猪胚胎中，育出了带有人类基因小猪的这一创新性研究。我国科学工作者成功培育出了首例绿色荧光的转基因猪，也是世界上第4例通过体细胞核移植技术培育的该类转基因猪，阳光下看，它们的鼻子、舌头和蹄子呈黄色，但在紫外灯照射下则泛出绿色的荧光。
2．3转基因鱼：加拿大、美国和新加坡组成的科学研究小组找到了一种极度活跃的生长素基因，将其导入太平洋鲑鱼的卵中．培育出了比正常鲑鱼大37倍的巨型鲑鱼。之后不久．世界上先后研制出转基因虹鳟、沟鲶、鲑鱼、斑马鱼、罗非鱼、白斑狗鱼、非洲鲶鱼、太鳞大麻哈鱼、大麻哈鱼、银大麻哈鱼等，转移的基因主要有生长激素(GH）基因、抗冻蛋白(AFP)基因和某些作为标记用的报告基因。
2．4转基因牛：20世纪80年代末，美国科学工作者采用转基因的方法育成了世界第l头带有人雌性激素基因的转基因牛。该牛能产出不饱和脂肪含量少并适于喂养婴儿的牛奶。在以后的几年中，又培育出了2头能产出胰岛素生长因子的新类型牛。2003年，李宁教授的研究小组培育出了中国首批转基因体细胞克隆牛，标志着我国转基因体细胞克隆牛的生产技术体系已经成熟。
2．5转基因禽类：生产转基因鸡可以改进现有品种的遗传特性，例如增加抗病性、提高生产性能、降低鸡蛋中的脂肪含量和胆固醇水平等。目前，已经获得了转入禽类白血病病毒(avianleukosis viruses，ALV)的外壳蛋白基因env的转基因鸡，实验证明，获得的转基因鸡对禽类白血病病毒具有一定的抗性。英国罗斯林研究所通过改造母鸡的基因，培育出一种能产抗癌蛋的转基因鸡。
除此之外，1985年，美国人用转移GH基因、GRF基因和IGFl基因的方法，生产出转基因兔、转基因羊和转基因猪。日，首只转基因猴“安迪”在美国诞生．这是世界上首次培育成功的转基因灵长类动物。
3转基因动物的应用
转基因动物技术能在个体水平从时间、空间角度同时观察基因表达功能和表型效应，有效地将基因水平、蛋白水平与临床、生产水平的研究有机地统一起来，显示了良好的应用前景。目前，关于转基因动物在动物育种、制造生物反应器、改善畜产品的营养结构、建立人类疾病模型、器官移植等领域的研究越来越广泛。
3．1转基因动物在生物制药中的应用：20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了高产值、高效率的基因药物，它的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展。转基因动物技术日趋成熟．在医药学领域中，既可作为基因药物的“生物反应器”应用，也可作为疾病动物模型用于疾病发生机制及药物筛选等的研究。
利用高效表达的克隆转基因动物生产珍贵医用蛋白是各国一直研究的重点，将医学上非常珍贵的蛋白质(如抗凝血酶Ⅲ、人血清白蛋白、B一干扰素、降钙素、胰岛素、人生长激素等)的基因通过基因打靶技术，定点转入牛或羊的乳球蛋白质基因中．在乳腺中高效表达，便可自乳汁中回收该蛋白质。目前已从转基因的动物乳汁中生产出的治疗蛋白主要有：奶山羊乳汁中高度表达的抗凝血酶Ⅲ和Or--1一蛋白酶抑制因子，绵羊乳汁中表达的OL--1一抗胰蛋白酶和人凝血因子Ⅸ，牛乳中表达的a-乳蛋白和乳铁蛋白,兔乳中表达的a-葡萄糖苷酶等。
3．2转基因动物在疾病研究中的应用：①建立诊断和治疗人类疾病的动物模型。人类的许多疾病都与遗传因素相关．利用转基因技术制造出各种遗传病的动物模型，可以方便地分析检测m遗传病的致病基因、发病机理，从而更好地防治人类遗传病。②生产可用于人体器官移植的动物器官。异源器官移植可能是解决世界范围内普遍存在的器官短缺的有效途径。利用转基因技术改造异种来源器官的遗传性状，使之能适用于人体器官或组织的移植，是解决移植短缺的最有效途径。Lai等结合基因打靶和体细胞核移植技术，采用敲除a-1，3半乳糖转移酶基因的胎儿成纤维细胞作核供体，成功地获得了a-1，3半乳糖转移酶基因敲除猪，从而消除了猪作为人类器官供体的一个主要障碍，进一步推动了器官移植的发展与应用。③进行异种细胞移植。已知很多疑难疾病、生理功能紊乱都与细胞凋亡或细胞功能异常有关，但到目前为止，人类细胞还不能很好地传代培养，因此将异种细胞尤其是猪的细胞移植到合适的位点，将使人类实现细胞治疗成为可能。1994年，Groth等将猪的胰岛细胞移植给糖尿病病人，取得了一定的成效。1997年,Deacon等将猪胎儿神经细胞移植到患有帕金森疾病的病人大脑中，研究发现移植后的细胞能长久保持活力。
3．3转基因动物在动物育种中的应用：在畜牧业方面，可以在实验条件下进行转基因整合、预检和性别预选，并采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移。通过转基因克隆技术大量快速地繁殖出具有高产优质性状的转基因动物．以有利于降低生产成本，提高经济效益。
许多科学家在研究疯牛病的病因时，采用转基因老鼠进行PrP基因结构分析．并利用转基因鼠研制出了抗PrP的单克隆抗体，通过临床试验已取得了有效成果,使人类对疯牛病在分子水平上有了科学评价和诊断依据,对疯牛病的病因有了明确的定位,只要提取其他动物抗PrP基因获得转基因牛，将会更好地防止疯牛病的发生㈣。
4转基因动物技术的不足
第六．尽管转基因动物给人类带来巨大的益处，但也存在一些安全性问题。如外源基因的插入可能造成基因污染，对生态平衡以及物种的多样性产生不良影响；转基因移植可能加大人畜共患病的传播机会，给人类带来灾难性的危害等等。
5转基因动物技术的展望
(作者：佚名
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