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【专题讨论】【技术答疑】细胞培养实验技术交流，有问必答
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细胞培养技术作为重要的研究手段，在药物实验、细胞周期检测及动物造模等研究中有着广泛的应用。而原代细胞培养等大多技术的操作步骤虽不复杂，但实验过程中的一些细节问题，却会严重影响实验成败。根据不同实验目的、材料、设备等，都有一份属于自己的protocol和操作细节，即使简单到生长因子的选择也会对最终结果产生显著的影响。当实验结果不理想时，也要考虑改进因素的复杂性。受丁香园邀请，本人荣幸在此开展细胞培养实验技术交流专帖，对丁香园站友们提出的关于细胞培养和转染疑难等问题给予解答，任何有关于细胞培养的问题，大家尽管在此提出，本人尽力解答，也欢迎站友们参加讨论。本次活动技术支持来自威斯腾生物技术中心。威斯腾能够独力完成各类生物学及生物医学类整体实验，乐意为广大科研人员提供技术支持，共同解决科研过程中的各类问题。同时，感谢丁香园提供的交流平台及论坛版主的大力支持！
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cheff0412 edited on
dhlheyan 你好，我是基础医学院的一名学生，学校的细胞生物学实验课，我们自己动手养的细胞，经常被污染，细节也很注意啊，自己不知道什么原因，请问你能帮忙找找可能的问题吗？有什么较好的避免方法吗？谢谢了！你好！导致细胞污染的可能很多，如果要保证实验能够顺利进行，必须要注意养成自己平时良好的一个科研习惯。以下方面我们一起来交流探讨试试：1.每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分以上。 2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。 4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。 5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。 6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。 7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。多注意细节，每次从细胞房出来，都反思一下，操作过程中是不是哪里做的不够好。
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huangqian123 你好！我们学校有关心肌细胞生理特性的观察研究，需要一些体外培养的心肌细胞，要获得生理状态良好的与体内各性状相差不大的心肌细胞，请问有什么特殊注意的方面吗？谢谢！ 心肌细胞的原代培养在选择活体动物上很重要，一般选择新生大鼠或者小鼠，保证心肌细胞的活性和纯度；另外在取材时，尽量取心尖部位，组织不纯，很容易导致杂细胞增长，影响目的细胞。
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缺氧的牙 你好！请问如何提取细胞中的活性蛋白，并且保证蛋白的无菌。因为我要提取某种细胞的活性蛋白，并作用于另一种细胞，请帮忙解决这个问题。最好是用物理方法，这样对细胞的损伤应该能小些吧 这种情况下，建议做细胞共培养；因为单纯从某个细胞分离纯度很高的蛋白，并且无菌处理，这个是很复杂的。最理想的结果是细胞共培养，再观察作用细胞的变化。
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某些春末夏初 你好！我是一名医学院的在读研究生，课题需要养细胞，想问一下Tregs应该怎么养，有什么资料可以学习吗？需要的培养密度是多少？谢谢！ 如果做Tregs细胞的培养，按照通常的研究，是需要你做诱导培养的，算是细胞建模的一种。
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老板最近让做一个药物对肝脏的毒性研究工作，希望用细胞模型来完成。原因之一是细胞模型可以更深入的研究一些药物毒性机制。但经过查阅文献，发现国内研究药物的肝毒性细胞模型选择很多，不同的人用不同的模型，有人正常肝细胞L02、人正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞HepG2、肝癌细胞(BEL细胞)、人肝癌细胞系 Huh7、肝癌细胞株(SMMC-7721)、还有两部灌流法提取大鼠肝原代细胞的。我接触细胞培养时间不长，现在纠结着不知道选择哪一种比较好，还请予以提示。谢谢。你这个涉及到细胞株选择，这点还是建议你根据你的研究方案来选择，如果细胞株对你的实验影响不大，那可以选择常用，好养的细胞来做，但是如果你的实验方案和你的细胞株有至关重要的关系，那就需要你选好细胞了。
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nakice 你好，看到报道说是现在细胞实验很大一部分研究结果不准确，说细胞培养过程中受到支原体的影响，不知道有没有文献专门研究支原体对细胞生长等产生影响的报道，谢谢个人认为，任何技术在研究过程中，都不可能做到100%绝对的准确。就像你提到的支原体对细胞生长的影响，这一块的研究也是非常多的，你可以通过一些文献了解一下。在做科研的过程中，我们不能单一的通过某一种或一类实验，就去下定义，通常情况下，体内体外实验都进行，如果能够相互佐证，那说明结果的可靠性更高一些。现在一些影响因子较高的杂志上，对与实验结果的要求也越来越高，常常对与一个结果，是需要多方面的实验来支撑的，比如你验证一个基因的表达是不是受到影响，那么，你需要在转录水平，表达水平，形态学多角度来证明。所以，任何技术都只是科研手段之一，我们要清楚哪些地方不准确，想办法通过其他途径来弥补，提高结果的可靠性。下面这些都是关于支原体和细胞培养过程中相互作用，用于细胞造模研究的一些文献，你可以了解一下。Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures.Nucleoside-catabolizing enzymes in mycoplasma-infected tumor cell cultures compromise the cytostatic activity of the anticancer drug gemcitabine.Implementing high-temperature short-time media treatment in commercial-scale cell culture manufacturing processes.
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lcr666 我最近在做293T细胞某个基因的expression和knockdown实验，用的是脂质体转染法，293T贴壁不牢固，实验操作中得特别注意，我是等细胞长到80%密度后再进行转染实验的，但是转染后12-24小时后就出现大量细胞漂浮现象，应该是细胞死亡了吧？之后可能只有30%细胞还是贴壁。这种情况漂浮的细胞能否收样？细胞悬浮的现象正常吗？怎么避免这样情况啊？试了很多次都是这样，请各位大侠支招，谢谢！ 以下几点建议供您参考：1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。 2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。
3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的。5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。 6.控制好转染时间，经验是48h mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。
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lcr666 你好，我还想再问一个问题：我在做一种药物的细胞实验，就是用上面说的293T，我想研究细胞凋亡，细胞在某种药物处理后24h、36h和48h这3个时间点收的蛋白，后续WB实验检测凋亡相关蛋白的表达，发现这三个时间点凋亡都不是很明显，我想问的是需要延长检测时间点还是采取别的什么方法检测（比如流式），或者可以下结论：药物不会导致细胞凋亡，但是这不是我们预期的结果。在此求助各位，谢谢！ 您好，建议您在细胞加药后及时镜下观察细胞状态，我们的经验是研究细胞凋亡一般都要至少48h才能有明显的凋亡现象，形态上检测表现为类似细胞死亡，比如贴壁细胞较大量的变为悬浮，当然具体情况也要看您的具体药物。鉴于您的情况，建议您尝试更长时间点，另外贴壁变为悬浮的细胞要弃去，再重复一次实验，如果还是检测不到凋亡蛋白的表达增高，那改做流式也很可能检测不到凋亡。
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谢谢、、的解答，现在初定用HL-7702和原代，两种细胞同时养着。但查询了中科院的细胞库，发现HL-7702已经不供应了，但丁香通里面却有很多企业可以购买，请问我若是在企业购买的细胞，在发表后期发表文章或者、申报专利或者成功鉴定时，会有影响么？这个是没有影响的，但是你这边最好是在值得信任的细胞机构购买。
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应该没有影响的吧，现在很多人做实验都是买的细胞株
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：回复：【专题讨论】【技术答疑】细胞培养实验技术交流，有问必答我最近也做了一次心肌细胞的原代培养，取的也是心尖，培养了几天，观察发现很多杂细胞，不知道有没有什么纯化方法？这里有个战友的问题，发出来给大家讨论讨论
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干细胞研究你是做理论研究？也需要实验支撑，所以你那边必须要有开展细胞实验的条件，比如细胞房和对应的设备，仪器。
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dhlheyan 你好，请问细胞冻存，一般细胞保密度要在多大范围，其复苏存活率较大些？ 5×106/ml~1×107/ml都是可以的
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dhlheyan 有限细胞，一般在第几次传代时冻存较好？谢谢 细胞的生长状态而定的，一般影响不大，不过原代分离的细胞最好在3代以内
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huangqian123 细胞培养用的不同批号的培养基和血清，可混用于同一株细胞的培养吗？会有可能产生不利影响吗？谢谢！如果是正规渠道购买的培养基和血清理论上是没有影响的，但是在实际操作过程中，质控，保存，多少都会对它们造成不利影响，只是说影响不是致命的。
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huangqian123 悬浮细胞的培养，怎样减少细胞抱团聚集情况啊？细胞巢团怕影响其生长、
谢谢！ 要看你是什么细胞，有的细胞在培养过程中出现抱团现象是属于正常的。
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dhlheyan 96孔板做MTT，孔内接种的细胞浓度大概多少，培养基体积200ul吗？2-4*10 的4次方左右接种量。
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dhlheyan 细胞做流式，细胞量检测限大概多少，12孔板可以做吗？ 铺板密度要根据你的细胞类型决定，比如一般293T,6孔板要铺板4×105，如果是HELA,细胞比较大，就要铺大概1.6×105左右。 建议用6孔板，如果无特殊情况。
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huangqian123 不同培养板，加入干扰的药物浓度要一定吗，是改变药物体积吗？ 不管在任何实验中，改变条件都应该只是你需要处理的那个指标，比如你需要不同的药物浓度来干预，那么你这边应该在初试浓度中计算好，保证加进去的体积是一样的，如果你是用一种浓度，然后通过添加不同体积来达到差异，那么溶剂体积也是变量之一，不能准确验证单因子变量。通常能够很好证明实验结果的基础就是“形而上学”，也就是说保证一个因子变化，其他都是在理想范围内来操作。不然你多因子变量的话，需要更多其他实验来验证支撑证明。
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huangqian123 在收集细胞做流式检测时，收集过程是否需要无菌操作呢？ 需要看你的目的，流式做完之后，你需要再次培养细胞，再用，比如分选，那你肯定需要严格无菌操作；但是你如果流式检测之后细胞无用了，比如检测凋亡，周期等，那你可以要求不这么严格。
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dhlheyan 什么情况下要用混合消化液消化细胞呢？用的地方多吗？有固定的成分浓度比例吗？谢谢首先，如果是简单的细胞消化传代和冻存，用0.25%（含EDTA）胰酶消化液即可，如果设计到原代细胞的培养，在取组织 ，用到的消化酶的种类很多，如胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、木瓜蛋白酶等等。可尝试多种酶按照不同比例进行消化，效果也会不同。
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xinxin03 开始SD乳鼠心肌原代培养，只能自己摸索，做了4、5次结果很不稳定，有时得不到跳动的细胞，请教楼主！多谢！主要问题是，第五或第六次消化开始出现鼻涕状的东西，吸不上上清，过筛也下不去。有两次鼻涕状的物质比较少，最后能得到跳动的心肌细胞，但是非常少，5只小鼠只能铺6孔板的一孔，只有几十个跳动的细胞，达不到别人联合跳动的结果。我的实验过程是这样的：每次5只乳鼠，用混合酶（终浓度0.065%胰酶+0.05%胶原酶2），5ml，每次37度水浴6min，每隔一分钟摇晃1分钟。吸上清，0.5mlFBS终止消化。一共消化7-8次。最后一起离心，1000RPM，5min。沉淀用DMEM重悬，过筛。差速60min。计数（总是看不到什么细胞，不论死活）。种到6孔板上。 心肌细胞原代培养取材对象为1~3天的新生乳大鼠，并且数量需要在10只左右，在取材时，需要处死后立即取心脏组织，并且快速浸泡在PBS溶液中。消化过程也很重要，整个消化次数需要根据消化后的组织形态来看。一般我们做了大概12次左右，消化的组织先是边缘被消化，其次呈现鼻涕状，再后来变成很小的鼻涕状。最后我们用DMEM/F12+Hyclone进口胎牛血清+双抗培养，10只差不多可以铺6孔板的2个孔，保证培养基无菌。过筛是用的200目。60min差速后，我们得到细胞量还是较多的。24h换液，换液后细胞贴壁还不完全，并且波动也不是很明显。72h观察，此时还是有较多活性细胞。
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小p42 我也是刚开始做实验没多久，同时做两株胰腺癌细胞，其中一株生长的很好，胰酶加进去消化后，我会把胰酶倒掉让覆盖在上面的一层来消化，消化时间大约两分钟左右，效果很好。另外一株做了各种尝试，上次试着消化了3.5min，60mm的培养皿加了1.2ml胰酶，不弃，可是在镜下看还是部分被消化，并且吹打下来的细胞量有点少，我的问题出在哪里呢？ 虽然都是胰腺癌细胞，胰酶消化的时间，细胞生长的速度等还是有很大区别的。有些细胞很难消化，胰酶消化的时间很长，这对细胞也是不利的，这种情况下可考虑细胞刮刀；还有就是采用2次消化法来消化，也是可以的。
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mengshandoctor 你好，前辈有没有培养过从肿瘤患者体内取出的癌细胞，比如说穿刺取得的，或者手术切下的。如果有的话，能否分享一些经验？ 我们做过一些直接从病人身上的组织取下的组织做原代，如人皮肤瘢痕组织、人滋养层组织、人宫颈癌组织、皮肤组织等等。首先在保存样本时候需要注意无菌操作；用于收集样本的离心储存管必须是无菌的，使用无菌的目的细胞培养基（含血清和双抗）完全浸泡保存，立即取材后与离心管中保存，并密封后尽快做原代处理。组织中分离的癌细胞通常活性没有癌细胞株好，并且长势也不如癌细胞株快，所以需要在传代消化时更加细心。
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简单微恋 您好，我最近在做鸡原代肾细胞的提取，实验步骤是：1、3-5日龄小鸡断颈法处死，无菌取肾脏2、用D'Hhanks液清洗，并剔除肾脏的血管和结缔组织3、将组织剪碎，加入终含量为0.1%胶原酶1,置于37℃水浴30min，边消化边震荡，充分吹打4、先后用100、200目筛网过滤，收集滤液5、将滤液悬浮于D'Hhanks液中，1000r/min离心10min，反复清洗两次6、离心后弃上清，加入配置好的50%percoll细胞分离液，吹打混匀7、15000r/min，4℃离心30min8、离心后吸取细胞最底层的高密度条带，悬浮于D'Hhanks液中，1200r/min离心10min，反复清洗3次9、用不含血清的DMEM/F12培养液洗涤一次10、将收集的细胞悬浮于含10%胎牛血清的DMEM/F12中，并细胞计数11、以5*105个/ml接种至细胞培养板，置于5%CO2，38.5℃饱和湿度中培养。我按照这个实验步骤提出来的鸡肾小管上皮细胞不贴壁，偶尔少量贴壁但是不增殖，有大量成簇的细胞漂浮；一开始分析是用percoll分层的时候对细胞的伤害太大，导致细胞活力太低无法增殖。后来我省略了6-8步，用胶原酶消化后直接培养，细胞贴壁也生长良好，传代后原瓶生长良好，换培养瓶增殖速度一般，重点是杂细胞太多。想请各位老师帮忙分析下，谢谢！我觉得杂细胞多可能是由于省掉了用50%percoll细胞分离液处理细胞这一步，50%percoll可以将不同比重的细胞分开，我觉得在这个实验中这一步应该是纯化的关键步骤。如果细胞贴壁效果不好的话，可以先用多聚赖氨酸包被培养板有助于细胞贴壁。一般的原代细胞增殖能力都不强，成纤维细胞除外。之前我们做的大鼠的肾脏的原代细胞用过直接将剪碎的肾脏用10ml的注射器芯在细胞筛上研磨，研磨之后就不需用消化液消化，这个方法可以尝试一下。做原代直接按照文献是很难做出来的，而且每个文献的方法还可能不一样。也只有边实验边摸索边改变条件。
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雪月飘林 你好，老师我开始养内皮细胞，总是有些黑点点，使得视野脏脏的感觉，在丁香园搜索是“黑胶虫”，该怎么处理才能去除这些东西呢“黑胶虫”的出现有很多种可能，目前比较怀疑这个物质是与血清有一定的关系的。所以在操作过程中可以尝试换一下血清。在每次用血请的时候注意严格无菌操作，新的血清也分装后使用。可以用进口的塑料瓶来培养细胞，贴壁细胞可以尝试用无菌的PBS洗几次，能稍微缓解。如果实在不行，可以购买具有抑制“黑胶虫”的培养基来培养细胞。
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myfxdc 你好，我最近在养NCI-H716这种细胞，很多文章里提到处理前都要有一个诱导分化的过程，Two days before theexperiment,cells were seeded into six-well culture plates precoated with Matrigel,我想请教一下coating怎么做，铺胶得铺多厚，处理完后怎么收集细胞和上清？ 这里的coating的铺板的意思吗？不太明白你的分化具体是如何操作的。我们在实验中遇到过需要加明胶或是多聚赖氨酸铺被的，主要是将半贴壁的细胞促使贴壁，操作步骤是先制备明胶或是多聚赖氨酸，无菌过滤，首先吸取500ul于一个孔，轻轻晃动，使其均匀铺于孔板内，其他孔同样操作。于培养箱中培养2h左右，取出，吸出多余液体，用PBS润洗两遍，可进行细胞铺板。实验结束后，细胞同样按照正常胰酶消化方式进行消化收集，上清液同样收集。
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雪月飘林 我培养的是人内皮细胞，请问如何选择抑制黑胶虫的培养基，您的意见是？ 如果是常规细胞，最好是舍弃，再复苏。因为这种污染很容易在空气中，影响其他细胞。不能有效抑制的。
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Red_Shoulder 我想问问，所谓的转染后稳定表达细胞株，是指转染加药筛后所有的细胞100%都表达转入的目的基因，还是指药筛之后大部分细胞表达所转入的基因？若是指药筛后大部分细胞表达所转入的目的基因，那建立稳转株时，其中至少要有多少(？%)细胞表达目的基因才算是建立了稳转株？ 稳转是指稳定表达，可以看成是100%表达。所以在筛选这部分是很麻烦的，需要很多次的细胞分选，以及细胞克隆、PCR验证。但是在很多实验中，只需要有80%，就可以进行后续实验。
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herrmayor 老师您好，去年公司买的菌液提取质粒，一开始做慢病毒转染都能转进去，最近一个对照GV249总是转染不进去，用嘌呤霉素一杀就死，其他几个SH可以转染进去，您看是什么原因，是放久了还是？（一直保存负80°冰箱里的） 菌液放在-80°冰箱保存问题不大。可以分析其他原因，比如菌液的纯度，转染时的操作、细胞的状态等等原因。
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coral_lin 请教楼主，我用life的DMEM高糖培养基粉剂配成2X液体培养基（因为实验特殊需要），再使用的时候再用蒸馏水1:1配成1XDMEM培养基，现在我的问题是PH值很难控制，life说明书说这种粉剂培养基需要加3.7g碳酸氢钠，然后调PH值过滤除菌。这些我都照着做了，但是后面发现，最后的1X培养基的PH波动很大，影响因素包括：2X的DMEM培养基在不同气体环境（空气 vs 5%CO2培养箱）PH值不同，随着放置时间长短PH值也不同，另外买的life蒸馏水PH在不同批次间也不同，4-6.0都有，没有7.0的蒸馏水。因此最后的培养基PH有很大波动，养细胞死了很多。对于这个问题，你有什么好办法？谢谢！能不能加点HEPES？ 几乎所有的培养基的PH都会因温度和气体环境而改变PH，我们常用的液体瓶装一般使用不超过一个月。有时用的粉末装，就直接用实验室常用蒸馏水配制，然后用碳酸氢钠调节PH，最后无菌过滤，在培养细胞时，状态也还可以。
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探宝者 你好，我现在在做新生鼠大脑皮层元代神经元培养，但是杂质细胞比较多，我已经很注意取材了，但是结果不是很满意，杂质细胞还没有分清楚是什么，请问有哪些技巧可以提高细胞纯度吗？ 大鼠大脑皮质神经元细胞通常会用到一些细胞生长因子，可以筛选些细胞。如果对细胞的要求比较高，建议做细胞分选。另外关键还在于取材和消化步骤了。
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後青春彼岸 你好，我在做胎鼠脊髓原代神经元细胞的培养时，如何提高纯度，我培养出来的大部分都是胶质细胞。请问做原代细胞要注意哪些细节，谢谢。做神经元细胞的原代培养难度相对是会大一些，你这边注意看下生长因子的选择，这个影响是比较大的。
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桐彦无忌 你好，我在养兔子的原代血管平滑肌细胞，最近做的几次原代，游出的细胞总是会有很多黑色的点点，培养瓶底部也会有，培养基里也会漂浮着黑色细短线状的杂质，细胞长得速度还可以，只是传不了几代细胞就会变形，怀疑是支原体污染，做了一次DAPI染色，确实有絮状的东西，我现在的问题是不知道污染源在哪，要怎么避免污染？试剂全部都换新的，还是有。会是动物的血液里带来的吗？还是其他的可能？要怎么预防？谢谢！你可以参见楼上有个关于黑色杂质的帖子，这个有可能是血清保存问题，也可能是培养瓶问题，做的时候一定要严格无菌操作，如果想确实是不是动物血液里面带来的，可以扩大培养，镜检。
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