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农药24D与通用Ⅱ型拟除虫菊酯完全抗原和多克隆抗体制备.pdf74页
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一,;童≯『‘啊,,一.
,上海师范大学硕士论文 摘要
随着农业产业的快速发展,农药杀虫剂与除草剂等降低虫害和提高产量农药产品
在农业领域中广泛应用。由于农药使用不当和过量使用,导致过量的农药残留而
引发食品安全问题,引起了全世界食品安全领域的广泛重视。所以美国、欧盟等
发达国家相继严格限用和禁止使用农药,从而产生对农残检测的需求。而传统的
农药残留分析方法需要复杂的仪器和专业技术人员,不能满足在大批量检测的要
求。因此建立高效、灵敏的残留分析方法具有重要意义。因此,本文利用酶联免
疫分析法技术,建立,.与通用型拟除虫菊酯检测检测体系。
对采用两种,.合成方法免疫原注射只新西兰兔,抗,.兔血清采用直接
法测定效价,并对其中对号兔血清进行间接竞争法测定。结果表明
采用混合酸酐法的号兔抗,.兔血清半抑制率分别为半数最大抑制浓度为
./ ./。对不同免疫原免疫,效价不同的抗,.血清
进行荧光淬灭检测,获得抗体结合常数为./和.
对只新西兰兔采用法合成通用型拟除虫菊酯免疫原,获得通用Ⅱ型拟
除虫菊酯抗血清,采用通用型拟除虫菊酯兔抗血清采用直接法测定效价,
结果为,间接竞争法测定 对氯氰菊酯为. /,氰戊菊酯
/,氰氟菊酯 为.弘/,氯菊酯 /。
关键字:、拟除虫菊酯、酶联免疫分析法、荧光淬灭法上海师范大学硕士论文 ,,,
:一,, 上海师范大学硕士论文 目录
第一章绪论。
.农药残留?
,年农药概述??~:.拟除虫菊酯概述?
.色谱法??..
..气相色谱?。
..高效液相色谱??.
..联用技术..毛细管电泳技术?.
.免疫学检测..
...抗原制各?
..多克隆抗体.
..单克隆抗体.
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小分子半抗原设计
用​于​免​疫​动​物​ ​小​分​子​半​抗​原​需​要​有​目​的​的​选​择​,​本​文​介​绍​其​选​择​原​理
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【讨论】为什么小分子一般连接BSA免疫偶不是连其他蛋白啊
【讨论】为什么小分子一般连接BSA免疫偶不是连其他蛋白啊
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这个帖子发布于7年零321天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
动物对BSA本身产生的抗体，怎么办？还是对BSA本身不怎么产生抗体？选用BSA关键是有哪些优点呢？谢谢！
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平时，一般偶联蛋白BSA，，OVA，KLH 都是用的很多的。并不是只有BSA用的普遍。动物是一定会产生针对BSA的抗体的，如果是做单抗的话，那这种针对BSA 的抗体当然就丢掉了。现实中用于免疫的偶联蛋白，我用的最多的就是这三种了，还真没用过其他偶联蛋白。这三种免疫原性都挺好的。但我就不明白为什么其他偶联蛋白就很少听到，用到。你这个问题实在是太好了，知道结果请通知我一声。
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你可以查一下，BSA的化学结构。它的化学结构简单，空间构象简单，接近直链，抗原决定簇少，免疫后产生的抗体类型要少很多。半抗原连接上后，可以把自己的构象突出在蛋白外面，更容易获得你想要的抗体。同时，BSA上的结合位点还是较多的。连接的抗原数符合免疫要求。偶联比适中，一般都用BSA或klh 进行免疫。KLH 上的结合位点多，结合的半抗原分子也较多。效果也好，但是比较昂贵。OVA 一般就用做包被原的制备，ova与半抗原合成的免疫原，在免疫后，在机体中容易脱落，免疫效果不确定。
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你可以进入小分子物质 单抗制备的主题，那里面有很多介绍.下面的帖子是我在战友那看到的。转贴给你。
chen365 edited on
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小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。以前查过一些材料，个人觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH2，COOH，OH等活性基团，可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体（周思祥， 刘福成，2005）。但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。（Yoo Jung Kima，2003）待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降（Chappey et al.，1994）。这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。再者如果脂肪酸含有平面结构，也可以作为抗原决定表位，使产生特异性的抗体。这说明小分子的极性以及不饱和键，苯环结构都可以增强抗原性，简单的直链结构很难产生特异性很强的抗体，这也是一般选用直链作为间隔臂的原因。直链碳链本身的抗原决定性很差，不会产生针对间隔臂的抗体。合成人工抗原的过程中，即使半抗原绝大部分的官能团与待测物都是一致的，它也可能在联入蛋白载体的过程中受到屏蔽作用。小分子药物在与载体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽。从而产生的抗体就会丧失对那些屏蔽基团的特异性。确定半抗原不受蛋白的屏蔽作用在人工抗原合成中非常重要，解决这一问题的最佳方法就是联入间隔臂。间隔臂的连接位点的选择对于抗体质量至关重要，最好不要影响小分子化合物中特征性的基团暴露于免疫B细胞的抗原表位，这也是待测物本身的羧基，氨基一般不能直接联入间隔臂，因为这些基团对小分子药物的电性和极性影响非常大。而且引入的间隔臂不能影响主要基团的电子分布，例如苯环和其他杂环类的电子分布，这就要求间隔臂的极性和能量要低，将对小分子药物的电子排布和空间结构的影响降到最低，从这个角度来说，低能量的直链间隔臂是最佳的选择。联入间隔臂的半抗原的电子分布与目标待测物的电子特性一致性对抗体针对待测物的特异性至关重要。半抗原间隔臂的连接位点，最好选择极性较低且远离半抗原的特征性结构。如果待测物的极性较高，半抗原合成的过程中最好保持其与目标待测物极性的一致性。人工抗原具有较高的极性，对于引发免疫反应有重要作用。在结构如图3 Bentazon的抗体制备过程中，有三个介入位点。异丙基远离杂环，是联入间隔臂的理想位点，可以最小程度的改变待测物的物理和化学特性。但异丙基是这物质的特异性基团，对于保证制备抗体的特异性很重要，所以不能选择这个位点。Bentason II位的亚氨基具有很强的极性，如果间隔臂联入这个位点极性将会消失。这种化合物的衍生物大多为非极性，如果要制备多残留的抗体，增加交叉反应率，这个位点将是理想的间隔臂介入位点。但对特异性要求高的抗体制备，就必须要保证半抗原的极性，所以对于高特异性的抗体制备来说，这一位点也不适合连入间隔臂。在III位介入直链的间隔臂，可以保证与待测物极性的一致，而且中性的多甲基直链对杂环的电子排布影响也较小。试验结果显示II，III联入间隔臂制备的抗体对Bentason的灵敏度很差，但是对II位氨基衍生的样品的灵敏度高于目标待测物，说明衍生物的非极性是灵敏度高于原形Bentason的原因。这也与MQCA抗体对原型药物识别能力较差，但对丁胺衍生后的样品具有高灵敏度的实验结果相一致。说明半抗原与待测药物电荷状态的一致性，在这些极性很强的药物小分子免疫残留检测方法中要重点考虑。但III位接入间隔臂的人工抗原制备的抗体的灵敏度与预期不一致，这可能因为再III位联入间隔臂时，间隔臂上面自由的羧酸基团可能与II位自由的氨基发生偶联，所以III位联入间隔臂的人工抗原的极性与目标待测物不一致，这也是抗体对目标待测物识别能力较差的原因。在Eva M. Brun等（2004）的实验中，根据待测物杀螟松的结构设计了多种半抗原的组合，具有特异性的结构的是用椭圆标记出来的，在连接偶联臂时就要充分考虑暴露这一重要的抗原表位，研究中通过对比接入偶联臂的不同结构的半抗原（图4），显示充分暴露该结构的F7半抗原制备人工抗原免疫动物得到的多克隆抗体，具有最好的灵敏度和效价。(Eva M. Brun et al ，2004)间隔臂的介入位点，最好远离特征性的基团，而且要尽可能保存特异性较大的杂原子或带侧链的碳链结构，联入的间隔臂最好在苯环或其他杂环的碳原子上，这样可以最大程度的保证半抗原的极性与目标待测物的一致性，如果有远离大环的碳链结构，那么碳链的末端也是一个很好的介入位点，因为这样的结构对大环的电子排布影响较小。（Young Ae Cho et al ，2004）除了间隔臂的接入位点以外，间隔臂本身的结构也是影响半抗原合成是否成功的重要因素。虽然半抗原接入间隔臂是必要的，但间隔臂太长会导致半抗原分子的折叠，使其更接近载体蛋白，屏蔽作用增强。一些学者认为理想的间隔臂长度是中度的3－6个直链碳原子构成，这时得到抗体的灵敏度要高于间隔臂很短的人工抗原制备的抗体（6，13，20，21），但在另外的试验中，使用零间隔臂的免疫原也得到了特异性很好的抗体。在Yoo Jung Kim实验中，在间隔臂介入位点为最佳的时候（见图4），当间隔臂的长度在2－6之间时，分别制备了人工抗原，在载体蛋白以及其他的免疫程序一致的条件下，不同免疫原产生的抗体在亲和能力和灵敏度方面都没有明显的差异。也说明在间隔臂长度适中的情况下，间隔臂的长度对免疫检测的灵敏度没有明显的影响。间隔臂的选择，一般间隔臂要求本身不要产生针对间隔臂的抗体，而且对半抗原的结构影响要小，并且末端要含有能与载体蛋白氨基或羧基偶联的活性基团，一般为氨基，羧基，或羟基。间隔臂与小分子半抗原连接一端，最好以单纯的碳链连接，如果难以实现也要选择电性较低的连接基团，试验证明以酰胺键相连接，产生的抗体对间隔臂有很高的亲和系数。（高爱中 硕士论文 2005）有试验表明当联入的间隔臂末端为羟基时，产生抗体的灵敏度要明显高于相同条件下间隔臂以羧酸基团为末端的人工抗原制备的抗体。这可能因为含间隔臂半抗原末端不同，所以与载体蛋白的偶联方式不同，所以含羟基的半抗原可以提高半抗原与载体的偶联比，并且能够更好的暴露半抗原的抗原决定簇。（Brun et al，2004）虽然对于含多个特异性结构的大分子化合物来说，用含苯环的间隔臂或零间隔臂同样可能制备处特异性好，灵敏度高的抗体。但现在很多试验都证明，选择简单的中长度的碳链对于半抗原合成是最佳选择，也是小分子药物半抗原合成选择间隔臂的通用方法。用作载体的有蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒，常用的有明胶、牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白、卵清白蛋白（OVA）、匙孔血蓝蛋白（KLH）等。选择载体要综合考虑分子量、活性基团、溶解度及来源，价格等因素。明胶做为载体免疫原性差，需要多次免疫。匙孔血蓝蛋白（KLH）价格昂贵，虽然免疫原性强，但它激发的B淋巴细胞克隆中针对自身抗原决定簇的多，相对减少了针对半抗原的B淋巴细胞克隆，增加阳性克隆筛选的难度和工作量（Fasciglione et al.， 1996）。一般认为，用与免疫动物亲缘关系较远的蛋白作为载体可能会更好，BSA与HSA都是良好的载体蛋白，均能刺激动物产生特异性抗体，并且BSA、HSA和OVA这几种载体分子量适中、来源容易、价格便宜、水溶性好，故常用作半抗原载体；此外BSA、HSA和OVA都具有大量的反应基团，如氨基、羧基等，且能在水相或某些有机溶剂的混合物中充分溶解，使偶联反应可在较高浓度的反应物存在条件下进行，据报道，每分子BSA有60个游离氨基，每分子OVA有20个游离氨基（NCBI蛋白质数据库）可以和合成半抗原的羧基反应形成肽键，合成免疫原。由试验表明在单克隆抗体的制备过程中，脂蛋白－Th细胞抗原决定基载体蛋白(Pam3Cys-TH)制备抗体的灵敏度高于用BSA，KLH作为载体蛋白制备的抗体，可能因为这种载体蛋白的支链更长。用BSA或KLH作为载体制备抗体的亲和力很差，因为分子在体内很快被肾脏系统消除，而新载体Pam3Cys-TH就克服了这样的问题。(Hoffmann et al.， 1997; Baier et al.，2000)。并且Pam3Cys-TH本身就可以做为佐剂使用，所以产生的免疫反应非常强，有利于产生高亲和力的抗体。 因为抗原展示细胞 (APC)表面是带负电荷的，通常认为如果载体蛋白经过离子化处理带有正电荷，就更容易结合到带负电荷的细胞表面，能引起更强的免疫反应。(Apple et al.， 1988)以上仅是个人查文献的一些总结，而且很多结果都不能从原理上解释清楚，所以抗体制备的时候最好还是多考虑几种抗原设计方案。根据初步筛选的结果确定用哪种抗原免疫的动物做融合。
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这个问题应该说通过哲学来解决因为用BSA偶连的成功的多效果也好，所以按照自然选择理论，你看到的就都是BSA的偶连抗原了
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