单克隆抗体制备过程中，如何筛选杂交瘤细胞？
细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需细筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30％的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株。
酶联免疫吸附剂测定
enzyme linked immunosorbent
assay，ELISA
指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法
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对于下面制备单克隆抗体过程示意图，不正确的叙述是
A．①表示B淋巴细胞和骨髓瘤细胞均是从小鼠的脾脏中提取的B．④中的筛选是通过抗原、抗体反应进行的C．②促进细胞融合的方法可以利用聚乙二醇作介导D．⑤可以无限增殖
题型：单选题难度：中档来源：北京模拟题
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据魔方格专家权威分析，试题“对于下面制备单克隆抗体过程示意图，不正确的叙述是[]A．①表示B淋..”主要考查你对&&单克隆抗体&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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单克隆抗体
单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞 （2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取 3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于治疗疾病和运载药物。 血清抗体与单克隆抗体的比较：
知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
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731367253697263981438397579477制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？_百度知道专业文档和设计素材分享社区
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杂交瘤技术制备单克隆抗体来源975年现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（特性和常规血清抗体的特性比较见2表23单克隆抗体（常规免疫血清抗体的特性比较项目常规免疫血清抗体体产生细胞多克隆性单克隆性抗体的结合力特异性识别多种抗原决定簇特异性识别单一抗原决定簇免疫球蛋白类别及亚类不均一性，质地混杂同一类属，质地纯一特异性与亲合力批与批之间不同特异性高，抗体均一有效抗体含量鼠腹水）鼠腹水养物上清液）用于常规免疫学实验可用单抗组合应用抗原抗体形成格子结构（沉淀反应）容易形成一般难形成抗原抗体反应抗体混杂，形成2分子反应困难，不可逆可形成2分子反应，可逆单克隆抗体制备的一般流程如下时间（天）制备步骤说明1初次免疫每种抗原免疫5只c小鼠，抗原与弗氏完全佐剂22第二次免疫抗原与弗氏不完全佐剂43第三次免疫抗原与弗氏不完全佐剂免疫一周后取血测效价57加强免疫单独抗原三天后采血（血清做阳性对照），取脾60细胞融合骨髓瘤细胞与一只小鼠（价较高）的脾细胞融合70择杂交瘤细胞价检测筛选阳性细胞克隆杂交瘤细胞的亚克隆进行2杂交瘤细胞的亚克隆，直至细胞上清的果阳性率达到100，将完成细胞建株115类鉴定对杂交瘤细胞株所分泌的抗体进行亚类测定120冻存细胞株每种抗原制备至少2株杂交瘤细胞121备腹水并纯化接种细胞制备腹水、。（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种小鼠。2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般1）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或腔内注射）（量不宜超过↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2107个细胞。初次免疫周后第二次免疫1107/3周后加强免疫（融合前三天）1107/取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量用的骨髓瘤细胞系见表2表2于融合试验的主要骨髓瘤细胞系名称来源耐受药物HL6363骨髓瘤63－63K（不分泌型）3（脾细胞）杂交瘤8－（脾细胞）杂交瘤8－骨髓瘤8－3/－骨髓瘤鼠骨髓瘤K骨髓瘤骨髓瘤λ骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如养基。小牛血清的浓度一般在10～20，细胞浓度以104～5105/宜，最大浓度不得超过106/细胞处于对数生长的中期时，可按13～110的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8生存的细胞对均一的敏感性。（2）饲养细胞在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为细胞/孔。2．细胞融合的步骤（1）制备饲养细胞层一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用小鼠，6～10周↓拉颈处死，浸泡在75酒精内，3～5用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓用无菌注射器注入5～6冷的培养液（严禁刺破肠管）↓反复冲洗，吸出冲洗液↓冲洗液放入10心管，用20小牛血清（胎牛血清（培养液混悬，调整细胞数至1105/加入96孔板，100μl/孔↓放入37℃，箱培养（2）制备免疫脾细胞最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死↓无菌取脾脏，培养液洗一次↓脾脏研碎，过不锈钢筛网↓离心，细胞用培养液洗2次↓计数↓取108脾淋巴细胞悬液备用（3）制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心↓用无血清培养液洗2次↓计数，取得107细胞备用（4）融合①将骨髓瘤细胞与脾细胞按110或15的比例混合在一起，在50心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。②90s内加入37℃预温的15子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。③加37℃预温的不完全培养液以终止用，每隔2别加入123456④离心，8006⑤充上清，用含20小牛血清择培养液重悬。⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。⑦将培养板置37℃、5养箱中培养。（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测1．择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在择培养液可以生长繁殖。在用择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，择培养液维持7～10天后应换用养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。2．抗体的检测检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有（1）放射免疫测定（用于可溶性抗原、细胞检测。（2）酶联免疫吸附试验（用于可溶性抗原、细胞和病毒等检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。（四）杂交瘤的克隆化杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。1．有限稀释法克隆（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。（3）调整细胞为3～10个细胞/（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5箱中。（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。（6）8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。（8）每个克隆应尽快冻存。2．软琼脂培养法克隆（1）软琼脂的配制含有20牛血清）的2倍浓缩的①1琼脂水溶液高压灭菌，42℃预热。②脂由1份1琼脂加1份含20小牛血清的2倍浓缩的制而成。置42℃保温。（2）用上述脂液（含有饲养细胞）15注于直径为9平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。（3）按100/500/5000/浓度配制需克隆的细胞悬液。（4）1脂液（42℃预热）在室温中分别与1同浓度的细胞悬液相混合。（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10其凝固，孵育于37℃、5箱中。（6）4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏1．杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。细胞冻存液50小牛血清40不完全培养液10甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。2．细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。（六）单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/果大量生产，费用较高。（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3107/种于小鼠背部皮下，每处注射2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/采血量有限。②腹水的制备常规是先腹腔注射降植烷或液体石蜡于鼠，1～2周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。（七）单克隆抗体的鉴定对制备的行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定1．抗体特异性的鉴定除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用。例如①制备抗黑色素瘤细胞的用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。2．与亚类的鉴定一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠检测出来的抗体一般是或。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心确定。在作双扩试验时，如加入适量的3），更有利于沉淀线的形成。3．和活性的鉴定用动物或细胞的保护实验来确定生物学活性。例如，如果确定抗病毒中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。4．别抗原表位的鉴定用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定识别抗原位点，来确定识别的表位是否相同。5．合力的鉴定用争结合试验来确定相应抗原结合的亲合力。
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