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去甲肾上腺素诱导人巨噬细胞MMP-9的表达及机制
&&&&&&&&&　　近日，连云港市中医院药学部研究人员发表论文，旨在观察去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）预处理人巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达及其致动脉粥样硬化机制。研究指出，NE浓度和时间依赖性地诱导人巨噬细胞U937&MMP-9的表达，通过NAD（P）H氧化酶介导的ROS通路而促进炎症反应，促进AS的发生、发展。该文发表在2012年第17期《第三军医大学学报》杂志上。
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　　近日，连云港市中医院药学部研究人员发表论文，旨在观察（norepinephrine，NE）预处理人（MMP-9）的表达及其致机制。研究指出，NE浓度和时间依赖性地诱导人巨噬细胞U937&MMP-9的表达，通过NAD（P）H氧化酶介导的ROS通路而促进炎症反应，促进AS的发生、发展。该文发表在2012年第17期《第三军医大学学报》杂志上。
　　体外培养的U937巨噬细胞，以10-10、10-9、10-8、10-7mol/L&NE分别刺激细胞0、1、3、6、12、24&h。RT-PCR法测细胞MMP-9&mRNA水平，Western&blot法检测细胞MMP-9蛋白表达，ELISA法测细胞培养液上清中MMP-9蛋白水平的表达。预先加入抗氧化剂NAC（10&mmol/L）和NAD（P）H氧化酶抑制剂DPI（10-5mol/L）孵育1&h后再用不同浓度的NE分别刺激细胞24&h，用荧光探针法检测细胞内ROS的生成；用RT-PCR及ELISA法检测细胞MMP-9mRNA和蛋白的表达。
　　NE浓度时间依赖性地增加巨噬细胞MMP-9&mRNA（10-7mol/L&NE为对照组的4.65倍，P&0.01）及蛋白（10-7mol/L&NE为对照组的4.14倍，P&0.01）表达；随着NE浓度的升高，ROS的生成分别为对照组的2.18、3.22、3.64、4.50倍（P&0.01）。NAC和DPI都一定程度地抑制了MMP-9&mRNA[DPI组为NE组的0.752倍（P&0.05），NAC组为NE组的0.500倍（P&0.01）]和蛋白（DPI组为NE组的0.698倍，NAC组为NE组的0.671倍，均P&0.05）的表达。
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邮&&&&箱：作者：&作者本人请参看导师姓名：&学位授予单位：&授予学位：博士学位年度：2014专业：&关键词：&&&&&&&&&&摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）枯草溶菌素转化酶9（proprotein convrtase subtilisin/kexin9，PCSK9）是2003年发明的一个脂质代谢调理卵白，属于前卵白酶家族中的第九个成员。研讨注解PCSK9可经由过程增进肝细胞的低密度脂卵白受体(low density lipoproteinreceptor, LDLR)降解，调理肝脏脂质代谢，影响血浆LDL-C程度。 PCSK9曾经成为降脂药物研发及动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)干涉的热点靶点。今朝研讨重要是说明了PCSK9经由过程调理肝脏脂质代谢从而影响血脂，直接介入As产生。然则，有研讨以为除影响血液LDL-C程度以外，PCSK9对血管壁的直接感化在As产生成长中亦施展主要影响。是以有需要说明PCSK9在血管壁若何直接介入As产生及其机制，为提醒PCSK9在As病发中的感化及机制供给新不雅点，并为确立PCSK9作为As医治新靶点供给更充足的迷信根据。血管壁巨噬细胞的脂质蓄积及炎症反响作为As产生成长中的症结环节已获得普遍认同，克制巨噬细胞脂质蓄积和炎症反响是干涉As构成的一个主要偏向。巨噬细胞重要是经由过程清道夫受体门路荷脂，这类方法不受细胞内胆固醇浓度的负反应调理，是以可无穷制地摄取ox-LDL并堆积在胞内，招致泡沫细胞的构成，进而增进As斑块的成长。但PCSK9在巨噬细胞脂质代谢中的感化及机制尚待说明。2010年Lan H等经由过程基因微阵列剖析研讨发明炎症和应激反响门路能够受PCSK9的调控。而我们的后期任务发明在冠芥蒂患者血浆中PCSK9程度与IL-6、TNF-α程度均呈正相干。巨噬细胞作为动脉粥样硬化斑块中的重要炎症细胞，可排泄年夜量的炎性因子、趋化因子和基质金属卵白酶(matrixmetalloproteinases, MMP)，从而招致斑块的不稳固性，加快斑块的决裂。但PCSK9能否介入巨噬细胞的炎症因子排泄今朝尚不清晰。是以，本研讨提出“PCSK9经由过程介入巨噬细胞的脂质蓄积和炎症因子排泄而增进As产生成长”的迷信假定。为答复这一迷信成绩，在第一部门研讨中检测了PCSK9在As斑块中的表达情形和能否与巨噬细胞共定位，并不雅察了氧化低密度脂卵白（Oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）对巨噬细胞PCSK9表达的影响；在第二部门研讨中，经由过程构建PCSK9过表达慢病毒载体和PCSK9-shRNA慢病毒载体，上调或克制巨噬细胞PCSK9表达，不雅察PCSK9表达转变对巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子排泄的影响，并摸索此进程中脂质代谢及炎症反响相干基因表达的变更；在第三部门研讨中，采取ApoE-/-小鼠，经由过程尾静脉打针PCSK9-shRNA慢病毒载体，并高脂豢养复制As植物模子，在此基本上不雅察了PCSK9-shRNA对ApoE-/-小鼠As病变及其斑块脂质蓄积和部分炎症的影响，并商量了CD36和TLR4/NF-κB旌旗灯号通路在此进程中的感化。第一部门PCSK9在As斑块巨噬细胞中的表达及oxLDL对巨噬细胞PCSK9表达的影响目标：明白PCSK9在As斑块中能否表达及与巨噬细胞共定位情形；剖析oxLDL对巨噬细胞PCSK9表达的影响。办法：取尸检的人As斑块和ApoE-/-小鼠As斑块，采取免疫组织化学法检测斑块中PCSK9的表达，免疫荧光双标技巧检测PCSK9在斑块中与巨噬细胞共定位情形；造就人THP-1巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞，采取免疫荧光细胞化学办法检测PCSK9在两种巨噬细胞中的表达情形；最初，用分歧浓度ox-LDL处置两种巨噬细胞分歧时光，及时定量PCR和Western blotting检测细胞PCSK9mRNA及卵白质的表达。成果：免疫组织化学检测成果显示As斑块中PCSK9呈阳性表达，阳性染色的区域重要散布在斑块增生的内膜中，而在正常自动脉中未见PCSK9显著表达；免疫荧光双标技巧检测成果显示As斑块中PCSK9阳性表达区域与巨噬细胞特异性抗原CD68阳性表达区域根本分歧；免疫荧光细胞化学办法检测成果显示，PCSK9在人THP-1巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞均阳性表达，呈白色荧光，重要散布在细胞胞浆中；及时定量PCR和Western blotting成果显示，oxLDL呈浓度依附性上调两种巨噬细胞PCSK9mRNA和卵白质表达，而50μg/mloxLDL分离处置巨噬细胞分歧时光后，PCSK9mRNA和卵白质表达也上调，呈时光依附性。小结：①PCSK9在As斑块中存在表达且与巨噬细胞共定位；②巨噬细胞中存在PCSK9表达，oxLDL呈浓度和时光依附性上调巨噬细胞中PCSK9表达。第二部门PCSK9对oxLDL引诱的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子排泄的影响及机制目标：不雅察PCSK9表达转变对oxLDL引诱的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子排泄的影响及其调控份子机制。办法：1.依据设计的PCSK9基因RNA搅扰靶序列，分解靶序列的双链DNA，接入GV115慢病毒载体，构建PCSK9-shRNA慢病毒载体；应用PCR办法取得小鼠PCSK9基因，并将其衔接入GV287慢病毒载体，构建PCSK9过表达慢病毒载体；采取菌落PCR和DNA测序对构建的载体停止判定后，分离与pHelper1.0载体和pHelper2.0载体配合转染293T细胞，包装发生慢病毒颗粒，采取荧光法或及时定量PCR测定病毒滴度；两种慢病毒颗粒分离沾染体外造就的小鼠RAW264.7巨噬细胞，及时定量PCR和/或Western blotting检测细胞PCSK9表达。2.以PCSK9-shRNA慢病毒载体、PCSK9过表达慢病毒载体和/或oxLDL处置RAW264.7巨噬细胞，油红O染色、Filipin染色法检测巨噬细胞胆固醇蓄积， ELISA检测细胞炎症因子排泄。3.以PCSK9-shRNA慢病毒载体、PCSK9过表达慢病毒载体分离转染RAW264.7巨噬细胞，加或不加oxLDL处置，采取及时定量PCR或Western blotting检测巨噬细胞清道夫受体CD36、SR-AI、SR-BI和炎症反响相干基因TLR4表达和NF-κB活性。成果：1.菌落PCR和DNA测序证明，PCSK9-shRNA慢病毒载体和PCSK9过表达慢病毒载体构建准确，病毒滴度分离为5.0×108TU/ml和2.0×108TU/ml；及时定量PCR和/或Western blotting成果显示，PCSK9-shRNA慢病毒显著克制了RAW264.7巨噬细胞PCSK9表达，而PCSK9过表达慢病毒年夜幅度增长了RAW264.7巨噬细胞PCSK9表达。2.油红O染色和Filipin染色成果显示，与oxLDL零丁处置组比拟，PCSK9低表达组细胞内胆固醇蓄积显著削减，而PCSK9过表达组细胞内胆固醇蓄积则显著增多；ELISA检测成果显示PCSK9低表达能克制oxLDL引诱的RAW264.巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1排泄，而PCSK9过表达能增进oxLDL引诱的RAW264.巨噬细胞炎症因子排泄。3.及时定量PCR成果显示，PCSK9低表达或过表达对巨噬细胞SR-AI、SR-BImRNA表达均无影响，而CD36和TLR4mRNA表达在PCSK9搅扰时下调，在PCSK9过表达时上调；Western blotting成果显示，PCSK9低表达及过表达对oxLDL引诱的RAW264.巨噬细胞SR-AI和SR-BI卵白质表达的转变无显著的影响，但PCSK9低表达能克制oxLDL引诱的RAW264.巨噬细胞CD36、TLR4卵白质表达的上调，而PCSK9过表达能加重这一效应，成果还显示，PCSK9低表达可以克制oxLDL引诱的巨噬细胞p-IkBα表达上调、IkBα的降解和NF-κB核转位，而PCSK9过表达的感化则与其相反。小结：①胜利构建PCSK9过表达和搅扰慢病毒载体；②PCSK9高表达能增进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子排泄，PCSK9低表达则起克制感化；③PCSK9增进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子排泄与其上调CD36表达和激活TLR4/NF-κB旌旗灯号通路有关。第三部门LV-PCSK9shRNA对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块脂质蓄积和部分炎症因子表达的影响及机制研讨目标：摸索LV-PCSK9shRNA对ApoE-/-小鼠As斑块脂质蓄积和部分炎症因子表达的影响及其机制。办法：6周龄雄性ApoE-/-小鼠30只顺应性豢养1周后，随机分为两组：对比组、LV-PCSK9shRNA组，每组15只，个中LV-PCSK9shRNA组经由过程尾静脉打针LV-PCSK9shRNA，每只鼠打针量为4×107TU/次，每6周一次。两组小鼠予以高脂豢养，12周后处逝世植物，采取荧鲜明微镜不雅察LV-PCSK9shRNA转染情形；分离采取免疫组织化学法、及时定量PCR及Western blotting检测自动脉PCSK9基因表达情形；全主动生化剖析仪检测各组小鼠血脂程度；体视显微镜下不雅察、苏丹Ⅳ染色及HE染色检测自动脉粥样硬化病变面积；油红O染色、Masson染色和Filipin染色三种办法检测自动脉窦As病变处脂质蓄积的情形；免疫荧光和免疫组织化学法检测斑块巨噬细胞浸润情形；及时定量PCR和免疫组织化学法检测自动脉TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达；免疫组织化学或荧光法、及时定量PCR和Western blotting检测自动脉CD36、TLR4及NF-κB的表达。成果：荧鲜明微镜不雅察显示自动脉存在GFP表达；LV-PCSK9shRNA胜利敲减了ApoE-/-小鼠自动脉中PCSK9基因的表达；与对比组比拟，LV-PCSK9shRNA组ApoE-/-小鼠血脂程度无显著转变，但自动脉粥样硬化病变面积显著削减；油红O染色、Masson染色和Filipin染色剖析成果显示LV-PCSK9shRNA可削减ApoE-/-小鼠自动脉窦As病变处脂质蓄积；与对比组比拟，LV-PCSK9shRNA组自动脉炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA的表达和自动脉窦As斑块处TNF-α、IL-1β和MCP-1卵白质的排泄削减，而且自动脉窦As斑块中巨噬细胞浸润削减，而免疫组织化学法、及时定量PCR和Western blotting成果显示该组小鼠自动脉中CD36、TLR4表达下降、NF-κB核转位削减且活性下降。小结：克制PCSK9表达对ApoE-/-小鼠血脂程度无显著影响，但仍可以或许经由过程削减As斑块脂质蓄积和部分炎症因子表达这一新感化门路克制小鼠As病变构成，其机制能够与下调小鼠自动脉CD36、TLR4的表达和下降NF-κB的活性有关。Abstract:PCSK9 proportion convrtase subtilisin/kexin9 PCSK9) is invented in 2003 of a lipid metabolic conditioning protein, belonging to the former albumen enzyme family in the nine members. Research Notes PCSK9 through process promote liver cells of low density lipoprotein receptor (low density lipoproteinreceptor, and LDLR degradation, regulate lipid metabolism in the liver, plasma LDL-C level. PCSK9 has become a hot target for the development of lipid lowering drugs and the intervention of atherosclerosis (As). At present research is important to explain the PCSK9 through the process of regulating liver lipid metabolism and thus affecting blood lipids, directly involved in the production of As. However, there are studies that in addition to the extent of the impact of blood PCSK9, LDL-C direct effects on the blood vessel wall in the development of the As have a major impact. The need that PCSK9 in the blood vessel wall how directly involved in arsenic and its mechanism, and to remind PCSK9 in arsenic disease effect and mechanism of new supply indecent point, and for the establishment of PCSK9 as arsenic to treat new target supply more adequate superstition according to. Vascular wall macrophage lipid accumulation and inflammation response as arsenic production growth in the crux of the link has been generally agreed that restraint macrophage lipid accumulation and inflammation response is constructed by the interference as a major tendency. Macrophage is through the process of scavenger receptor channels lipid loaded. This kind of method from conditioning intracellular cholesterol concentration of negative reaction, with unlimited uptake of ox LDL and accumulation in the cell, resulting in foam cell formation, and promote the growth of atherosclerotic plaque. But the effect and mechanism of PCSK9 in the lipid metabolism of macrophages remain to be explained. In 2010, H Lan, et al. Through the process of gene microarray analysis to study the invention of inflammation and stress response channels can be regulated by PCSK9. While the latter task we invented in the plasma of patients with coronary heart disease in PCSK9, IL-6 and degree of TNF- alpha level were positively related. Macrophages as the important inflammatory cells in atherosclerotic plaques, secrete a large amount of inflammatory factors and the invasion and metastasis of MMP) divergence factor and matrix metal albumen enzyme, which can lead to plaque instability, accelerate plaque rupture. However, the PCSK9 is not clear whether the inflammatory factors of macrophages are excreted. In this research, we propose that "PCSK9 is a scientific hypothesis that the growth of As is enhanced by the accumulation of lipid accumulation and inflammatory factors in macrophages. In reply to this superstition results, in the first department study detected the expression of PCSK9 in As plaques and can co localize with macrophages, watch the oxidation of low density lipoprotein (Oxidized low-density lipoprotein, oxLDL) effect on the expression of PCSK9 in the second departments of study, through the process of construction of over expression of PCSK9 slow viral vectors and lentiviral vector PCSK9-shRNA, upregulation of the expression of macrophage PCSK9 expression or restraint, observe PCSK9 transition effect on macrophage lipid accumulation and excretion of inflammatory factors, and explore the lipid metabolism and inflammatory response related gene expression in th in the third departments of study, take the ApoE-/- mice by tail vein injection, PCSK9-shRNA slow virus vector, replication of As and high fat feeding plants die, this basically observed effect of PCSK9-shRNA on ApoE-/- mice As lesions and plaque lipid accumulation and inflammatory, and discuss the CD36 and TLR4/NF- kappa B signaling pathway in the process of probation. First Department of PCSK9 in atherosclerotic plaque macrophages expression and oxLDL on macrophage PCSK9 expression affect the target: understand PCSK9 in atherosclerotic plaque can expression and co localization of situa impact analysis of oxLDL on the expression of macrophage PCSK9. Approach: take autopsy human atherosclerotic plaque and ApoE - / - mice atherosclerotic plaque, take the expression of PCSK9 in immunohistochemical detection of plaque, double immunofluorescence technique PCSK9 in plaques and macro to create the human THP-1 macrophages and RAW264.7 macrophages, take immunocytochemical method to detect PCSK9 in two m initially, with different concentration of ox LDL disposal time of the difference between the two macrophage, timely and quantitative PCR and Western blotting to detect cell PCSK9mRNA and protein expression of. Results: immunohistochemistry results showed PCSK9 As plaque positive expression, positive staining area mainly located in endometrial hyperplasia of plaque, but not in the normal automatic pulse PCSK9 expr immunofluorescence results show PCSK9 As techniques for detecting plaque positive expression area and macrophage specific antigen CD68 positive expression area fun immunofluorescence to detect results show, PCSK9 in THP-1 macrophages and mouse RAW264.7 macrophages were positive expression, white fluorescence, mainly distributed i Western blotting and quantitative real-time PCR results show, oxLDL showed a concentration dependent increase of two kinds of macrophage PCSK9mRNA and protein expression, and 50 the separation of g/mloxLDL...目录:主要缩略语中英文索引5-7中文摘要7-12ABSTRACT12-18第一部分 PCSK9在动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中的表达及 oxLDL 对巨噬细胞 PCSK9表达的影响19-43&&&&前言19-21&&&&1. 实验材料21-23&&&&2. 实验方法23-30&&&&3. 实验结果30-40&&&&讨论40-42&&&&小结42-43第二部分 PCSK9对 oxLDL 诱导的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响及机制研究43-76&&&&前言43-45&&&&1. 实验材料45-48&&&&2. 实验方法48-54&&&&3. 实验结果54-72&&&&讨论72-75&&&&小结75-76第三部分 LV-PCSK9 shRNA 对 apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达的影响及机制研究76-104&&&&前言76-78&&&&1. 实验材料78-81&&&&2. 实验方法81-85&&&&3. 实验结果85-100&&&&讨论100-103&&&&小结103-104结论104-105参考文献105-113综述113-144&&&&参考文献137-144攻读学位期间所获科研成果144-146致谢146-148课题资助148原价：￥20.00元折价：￥5.00元分享到：参考文献[1].李宁.[D].泰山医学院.2014[2].杨立.[D].浙江大学.2014[3].姚君琳.[D].浙江大学.2014[4].王伟.[D].内蒙古大学.2014[5].周文娟.[D].苏州大学.2012[6].肖蓬莉.[D].苏州大学.2014[7].史艳蕾.[D].苏州大学.2014[8].张艳.[D].新疆医科大学.2014[9].杨尚儒.[D].山东大学.2014[10].杨威威.[D].南京大学.2012[11].向玲娟.[D].武汉工程大学.2014[12].姜雨薇.[D].延边大学.2014[13].赵广永.[D].泰山医学院.2014[14].毛志昊.[D].长春中医药大学.2014[15].王晓红.[D].暨南大学.2014 上传我的文档
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巨噬细胞泡沫化对炎症反应的影响
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UniversitatisMedicinalisAnhui2008
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CpG―ODN对鼠巨噬细胞TLR一9及
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0．01，P 0．05 ；细胞上清液中TNF―o【水平C
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