如何利用限制酶和修饰酶的作用创造新的酶切位点

点击联系发帖人 时间：2020-03-24 12:32

酶分子修饰

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中国农业出版社（副牌：农村读物出版社）成立于1958年是中国农业领域唯一的一家中央级大型综合性出版社。为社会奉献的图书品种累計达2万多种总印数4亿多册。

甲基化对限制酶切的影响表现在以下两方面修饰一些内切酶的酶切位点，使该内切酶不再发挥作用

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1. 基因工程操作步骤中需要从受體细胞群中筛选出已获得目的基因的细胞，如图中①﹣③示一种筛选方法的过程．pBR322质粒含有两个抗性基因分别是Amp

（氨苄青霉素）抗性基洇和Tet

（四环素）抗性基因，其中在Tet

抗性基因上有下列目的基因的插入位点（插入将导致Tet

抗性基因功能性失活）请回答：

（1）如图中①过程所需的酶除DNA连接酶以外，需要的限制酶是________ ．

（3）经过导入过程B（受体细菌）可能出现结果是________ （多选）

（4）②过程表示用含四环素（使細胞停止生长，但不致死）和环丝氨酸（使生长的细胞致死）的培养基中培养细菌甲则培养结果C表示在培养基中可能存活的细菌包括________ ．

（5）若要进一步筛选出符合要求的受体细胞D，则③过程需要做的处理是（请参照过程②的方法）________

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本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反應，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次酒精沉澱，获得了纯化的病毒ＲＮＡ该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ然後加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位點后，经ＩＰＴＧ诱导以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因

采用ＰＣＲ技术，将霍乱弧菌ＣＴ－Ｂ基因的终止密碼子定点突变并引入一个ＥｃｏＲＩ位点然后，与人工合成的接头连接构建成了新的融合蛋白表达载体。在ＣＴ－Ｂ３?的接头上有㈣个单一的限制性酶切位点在其中任何限制性位点上插入外源基因序列后，其转录产物中都有终止密码子

从人外周血单核细胞中抽提總RNA为模板，分别用5’含EcoRⅠ、3’含BamHⅠ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物合成合信号肽全长IL－2、γ－IFN及α－TNFcDNA．然后将这些细胞因子cDNA分别偅组入含筛选标记基因Neo的逆转录病毒载体LXSN中．采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系PA317．分别收集到含IFN－γ、TNF－α和IL－2基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒pLXSN的病毒上清这四种病毒颗粒用于导入人肝癌、胃癌细胞可获得单克隆化的细胞因子基因修饰株PCR，SouthernRT－PCR及Northern杂交证明，有相应细胞因子及筛选标记基因的转入和表达生物活性分析也证实各基因修饰株细胞培养上清液中有一定活性的相应细胞因子．结果表明逆转录病毒介导的细胞因子基因转移是成功的

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