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第13章 柠檬酸发酵
第十三章 柠檬酸发酵柠檬酸柠檬酸(Citric acid)分子式为C6H807。外观为白色 颗粒状或白色结晶粉末，无臭，具有令人愉快的 强烈的酸味，相对密度为1.6550。 柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等 有机溶剂。商品柠檬酸主要是无水柠檬酸和一水 柠檬酸，前者在高于36.6℃的水溶液中结晶析出， 后者在低于36.6℃水溶液中结晶析出。它天然存 在于果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果 等含量较高。 柠檬酸是生物体主要代谢产物之一。柠檬酸柠檬酸1784年由 年由Scheels氏发现 柠檬酸 年由 氏发现 1893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸 年前，主要用柑橘、菠萝、 年前 1893年德国微生物学家 年德国微生物学家Wehmer发现二种青霉菌可以生成柠檬 年德国微生物学家 发现二种青霉菌可以生成柠檬 酸 1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸 年 使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸 1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的 浅盘法 柠檬 年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的浅盘法 年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的 浅盘法柠檬 酸发酵，并在比利时设厂生产。 酸发酵，并在比利时设厂生产。 1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸的深层发酵研究 年 和 年 进行了柠檬酸的深层发酵研究 1951年美国 年美国Miles公司首先以淀粉质为原料， 经水解后深层发 公司首先以淀粉质为原料， 年美国 公司首先以淀粉质为原料 酵大规模生产柠檬酸。 酵大规模生产柠檬酸。柠檬酸我国1953年采用浅盘法发酵生产柠檬酸， 1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠 檬酸成功，由于工艺简单、原料丰富、发酵 水平高，各地陆续办厂投产，至20世纪70年 20 70 代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系。我国柠檬酸行业：产量位居世界第一；从技 术上，处于世界领先水平，并远远领先于其 他国家，其优势 优势在于： 优势 1. 发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能， 当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要 将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。 简化了生产工艺，降低了生产成本。2.采用边糖化边发酵工艺，但发酵周期只有64小 时，生产周期比国外要短。 3.柠檬酸的产酸速度大大高于国外水平。平均产酸速率是国外的2倍 平均产酸速率是国外的 倍。柠檬酸的消费领域： 饮料行业占40～45％ 食品添加剂等占15～20％ 洗涤剂占20～30％ 医药占5％ 其它占10％我国有机酸行业发展的思考（2011年8月） 我国柠檬酸年产能已经达到百万吨，占世界 的70％左右；年产量达70余万吨，约占世界 的65％； 年出口量50万吨，超过世界贸易总量的一半。 我国是世界上最大的柠檬酸出口国，主要出 口到印度、美国、欧洲、日本等地。但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望我国于五十年代初期开始柠檬酸浅盘发酵研 究， 1968年轻工业部发酵研究所与黑龙江和平糖 厂合作，首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵 并投入工业化生产。 1965年，上海市工业微生物研究所筛选出 N558菌种，并与天津工业微生物研究所，南 通发酵厂等合作，使之用于工业化生产，并 在全国推广，形成我国独特的薯干直接深层 发酵法生产柠檬酸。我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望 从七十年代到九十年代，我国一直致力于柠 檬酸生产菌种的改进， 1990年，上海市工业微生物研究所完成国家 七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达 20％， 上海市工业微生物研究所开始以薯渣为主原 料，以黑曲霉为菌种，固体发酵法生产柠檬 酸钙的研究。并于1977年中试成功并投入生 产，现在全国已有四十余个工厂，采用固体 发酵法由薯渣生产柠檬酸及柠檬酸钙产品。我国以石油原料发酵柠檬酸开始于1970年， 先后在天津、上海、沈阳等地进行研究，并 一度投入小规模试验生产，是用正烷烃为原 料，以解脂假丝酵母为菌种，发酵产酸达13 ％以上，转化率140％以上，但因柠檬酸只 占总酸的50%（另一半为异柠檬酸）而且由 于成本较高及石油原料紧缺和食用安全性等 原因，未能坚持研究和生产。我国的发酵技木及生产水平，特别是菌种 及发酵工艺均为世界领先水平。 薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直 接深层发酵技术为我国所独有。 国外发酵罐容积通常在200m3，并较早实现 自动控制；我国的最大柠檬酸发酵罐为 150m3一、 柠檬酸在食品中的应用 1) 饮料与冰淇淋柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及 软饮料 柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋 于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗 氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素 等成分交融协调，形成适宜的口味和风味； 添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳 化稳定性，防止氧化作用。2) 果酱与酿造酒柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味， 并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝 胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的 柠檬酸可以满足这一要求。 当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足 时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒 口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧 化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感 和防止变色。3) 腌制品各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂 上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧 化。4) 罐头食品加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合 金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸， 使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植 物油中也有类似的作用。5) 豆制品及调味品用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便 于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋 白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的 调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等） 的调味。6) 其它柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定 的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬 酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装 用薄膜及无公害洗涤剂。二、 柠檬酸发酵微生物1) 黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特征 目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产 菌。 在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。 孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。 菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色 或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗， 小梗顶端产生一串串分生孢子。二、 柠檬酸发酵微生物2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理特征 黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性 淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培 养基上生长、产酸。 生长最适pH 因菌种而异，一般为pH3~7；产 酸最适pH为1.8~2.5。 生长最适温度为33~37℃，产酸最适温度在 28~37℃，温度过高易形成杂酸； 斜面培养：麦芽汁4°Be′ 的培养基。二、 柠檬酸发酵微生物黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种 活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并 且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有 一定的分解能力。二、 柠檬酸发酵微生物黑曲霉可以边长菌、边糖化、 边发酵产酸的方式生产柠檬 酸。三、柠檬酸发酵机理关于柠檬酸发酵的机制有多种理论， 目前大多数学者认为它与三羧酸循环 有密切的关系。 糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮 酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮 酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成 柠檬酸。柠檬酸的溢出代谢： 柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬 酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是 黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累 积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径 前段的运转速率大于后段的运转速率。 柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生 化机制与培养条件共同起作用的结果。 引起溢出代谢的原因 原因包括以下三个方面 三个方面： 原因 三个方面①高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。 第一：是在有高浓度草酰乙酸（OAA ）的情况 下对 AcCoA 具有高度亲和力的组成型的柠檬 酸合成酶（ CS ）的存在； 第二：是催化丙酮酸（ PYR ）固定CO2生成草 酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶 （ PC ）的存在；第三：是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或 蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠 檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。②较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。 第一：是低水平的α-酮戊二酸脱氢酶（KD） 影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半 部的中间产物积压； 第二：在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE） 和 异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而 使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、 异柠檬酸和α-酮戊二酸）更明显。③ 在柠檬酸过量合成阶段，培养基的 pH 值 显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜 输送； 柠檬酸的分泌也会影响培养基的 pH值。 锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。G 黑 曲 霉 中 柠G-6-P+(磷酸果糖激酶)柠檬酸I ,NH4 A1.6－二磷酸果糖 －丙酮酸檬 酸(丙酮酸羧化酶)+乙酰CoA 乙酰顺乌头酸酶 草酰乙酸的 代柠檬酸 (柠檬酸合成酶 )顺乌头酸谢 溢 出顺乌头酸酶 α-酮戊二酸脱氢酶 酮戊二酸脱氢酶 α-酮戊二酸 酮戊二酸 异柠檬酸脱氢酶 异柠檬酸TCA循环在柠檬酸积累中的调节1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键； 2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受 代谢调节的控制或极微弱; 3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异 柠檬酸脱氢酶和α－酮戊二酸脱氢酶活力降 低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓 度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活 力来提高自身的积累。回补途径循环重要功能除产能外， ☆TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸 循环重要功能除产能外 和其它化合物的合成提供了中间产物； 和其它化合物的合成提供了中间产物； ☆生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充， 生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充， 循环就会中断； 循环就会中断； ☆回补方式：①通过某些化合物的CO2固定作 回补方式： 通过某些化合物的 用， ②一些转氨基酶所催化的反应也 能合成草酰乙酸和α 酮戊二酸 酮戊二酸， 能合成草酰乙酸和α-酮戊二酸， ③通过乙醛酸循环① CO2固定作用补充TCA环的中间产物★通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中 通过某些化合物的 间产物得到回补： 间产物得到回补： 丙酮酸羧化酶： 丙酮酸羧化酶： CO2+丙酮酸 丙酮酸+ATP+H2O 丙酮酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 CO2 +PEP+ H2O 苹果酸酶: 苹果酸酶 CO2 +丙酮酸 丙酮酸+NADPH+H+ 丙酮酸 苹果酸+ 苹果酸 NADP+ 草酰乙酸+H 草酰乙酸 3PO4Mg++草酰乙酸+ADP+Pi 草酰乙酸为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长， 为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长， 异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶 至少要具备上述几种酶之种的一个酶。 异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。
②转氨基作用R1 | CHNH2 + | COOH R2 | C=O | COOH 转氨酶 R1 | C=O + | COOH R2 | CHNH2 | COOH定义： 定义： α-氨基酸的氨基通过酶的催化， 转移到α-酮酸 的酮基上，生成相应的 氨基酸；原来的α-氨基酸则转变成相 应的α-酮酸 。转氨基作用几点说明： 转氨基作用几点说明：可逆反应， （1）可逆反应， （2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆 胺 重要的转氨酶： （3）重要的转氨酶： 丙氨酸转移酶（ALT） 谷丙转氨酶（GPT） 丙氨酸转移酶（ALT）/谷丙转氨酶（GPT） 天冬氨酸转移酶（AST） 天冬氨酸转移酶（AST）/谷草转氨酶 (GOT) ALT常用于肝疾患 肝炎等）辅助诊断、 常用于肝疾患（ ALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、 用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断） AST 用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）COOH CH3| | | |COOH CH3 ALT| | | |（CH2）2 + C=O COOH α-酮戊二酸（CH2）2 + H- C-NH2 COOH 谷氨酸H-C-NH2|C=O|COOH丙氨酸COOH 丙酮酸ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清 ：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT 活性显著增高。 活性显著增高。COOH|COOH| |COOH|COOH| |CH2|（CH2）2 + C=O|ASTCH2|+（CH2）2 H-C-NH2|H-C-NH2|C=O|COOH 天冬氨酸COOH α-酮戊二酸COOH 草酰乙酸COOH 谷氨酸AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高 ：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.③乙醛酸循环乙酰CoA 乙酰 草酰乙酸 乙酸苹果酸 柠檬酸乙酰CoA 乙酰 乙醛酸 乙酸 异柠檬酸 延胡索酸琥珀酸乙醛酸循环能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶， 它使乙酸转变为乙酰CoA； 然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作 用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应： 乙醛酸循环的主要反应： 异柠檬酸 乙醛酸 + 乙酸 琥珀酸 +乙醛酸 乙醛酸 苹果酸乙酸→ 琥珀酸 + 乙酸 → → 异柠檬酸 净反应： 乙酸 净反应：2乙酸 苹果酸柠檬酸发酵机理大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖 酵解途径的代谢得到加强。葡萄糖经EMP通 路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙 酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA 及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙 酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、 乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。葡萄糖柠檬酸发酵机理丙酮酸 + 丙酮酸 CO2固定反应 草酰乙酸 乙酰辅酶A(CH3CO-CoA) 乙酰辅酶+（柠檬酸合成酶） 柠檬酸合成酶）按照正常的微生物菌体的代谢规律， 按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途 径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环， 循环， 径并不能够积累柠檬酸，而是进入 循环 柠檬酸 顺乌头酸酶 被彻底氧化， 被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量 积累柠檬酸， 积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的 异柠檬酸 内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶， 内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶， 异柠檬酸脱氢酶 主要是，顺乌头酸酶、 主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的 α―KGA 活性丧失或非常微弱，否则， 活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸 迅速被降解成其他物质。 迅速被降解成其他物质。琥珀酸柠檬酸生物合成中的代谢调节与 控制――追求柠檬酸的高产率柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个 中间性产物，在正常的微生物体内不能 够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸 合成有关的各种酶的活性，则会受到抑 制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中， 这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节从葡萄糖→→柠檬酸的合成过程中，PFK 是 一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受 在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激 到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除， 酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶 否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性 则有激活作用，特别是 还能解除柠檬酸、ATP 的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，…… 对磷酸果糖激酶的抑制作用。 研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系， 檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的 正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖 NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸， 激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。 那么NH4+ 浓度是如何升高的呢？1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节研究表明，柠檬酸产生菌――黑曲霉如 果生长在Mn+ 缺乏的培养基中，NH4+ 浓度异常的高，可达到25mmol/L，显 然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内 NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对 PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源 不断的合成大量的柠檬酸。Mn+ 缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？当培养基中Mn+ 缺乏时，NH4+浓度升高， 同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、 Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累， 氨基酸 合成 蛋白质 分解 氨基酸 意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋 白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+ 氨基化合成氨基酸 + 的消耗下降，NH4 浓度就会升高，微生物 体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用 下图示之：2.顺乌头酸酶活性的控制该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成 柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该 酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍 需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+ 的影响，控制培养基中的Fe2+ 的浓度，可以使 随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺 该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢 乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、 反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。 异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸 的积累及排出细胞外。 但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的 浓度又要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚 没有搞清楚。顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶 失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。 许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累 积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力 例如，比非产酸菌株低，产酸期比生长期低， 比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸 培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养 基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。 铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁， 可以握高柠檬酸产率。那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几 个问题：……，是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？提问：根据微生物代谢调节的基本理论， 还需要解决什么问题？3.能荷 能荷调节对柠檬酸发酵的影响 能荷菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP 到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过 程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产 生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分 NADH 子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧 化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体 内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键 酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢 停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？如果NADH（还原型）不能够快速 的被氧化转变成NAD（氧化型）， 则整个反应就会因为缺乏作为推动 力的氧化型的NAD而停止，仍然不 能够合成柠檬酸。柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠 檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没 有产生ATP。 为了解释这种现象，有人提出了一种假设： 该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经 过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化 为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP， 能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸 链。解偶联剂（ 解偶联剂（uncoupler）? ）使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行， 使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能 进行，解偶联剂为离子载体或通道， 进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对 H+的通透性，消除 +梯度，因而无 的通透性，消除H 梯度，因而无ATP生成，使氧化释放 生成， 生成 出来的能量全部以热的形式散发。 出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌 肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncoupling proteins， 肉线粒体中有独特的解偶联蛋白 ， UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有： ，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有： 质子载体： ， 二硝基酚 二硝基酚(DNP，图)，羰基 氰-对-三氟甲 质子载体： 2，4-二硝基酚 ， ，羰基-氰 对 三氟甲 氧基苯肼(FCCP)。 氧基苯肼 。 质子通道：增温素（ 质子通道：增温素（thermogenin）。 ）。 其它离子载体：如缬氨霉素。 其它离子载体：如缬氨霉素。 某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联， 某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联， 从而使体温升高。 从而使体温升高。实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸 链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬 酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持 一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则 这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不 再产酸，而是产生了大量的菌体。 标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了 大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象， 在生产上通常称之为：只长菌不产酸 ，大量的 葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种 失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发 电系统）。理论可以指导实践，反过来， 理论可以指导实践，反过来，通过实践 可以推动理论研究，丰富理论研究成果。 可以推动理论研究，丰富理论研究成果。 科学研究过程中的许多基本规律是相同 今天，我们在大学的学习， 的，今天，我们在大学的学习，更多的 是学习一种方法或者说一种思维。 是学习一种方法或者说一种思维。通过 这个例子， 这个例子，我们可以学习到许多专业以 外的知识……首先为了解释一种客观想 外的知识 首先为了解释一种客观想 提出一种假设， 象，提出一种假设，然后通过实验来证 明这种假设…… 明这种假设CO2固定反应通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 （1）磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 == 草酰乙 酸（C4二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 （2）丙酮酸 + CO2 === 草酰乙酸（C4二 羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是 生物素。柠檬酸发酵中， 柠檬酸发酵中，三个控制点C6H12O6 控制Mn+ NH4+浓度，解 除柠檬酸对PFK的抑制 （1）点：EMP畅通无阻 控制溶氧，防止侧系 呼吸链失活 丙酮酸 + 丙酮酸 （2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A + C4二羧酸柠檬酸发酵中， 柠檬酸发酵中，三个控制点柠檬酸 （3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低， 控制培养基中的Fe2+ 的浓度第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）Δ 柠檬酸和ATP对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用 AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用 NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶 有抑制 ，故生产上通过添加铵盐 来提高柠檬酸产量Δ Mn2+的影响：Mn2+缺乏 Mn2+缺乏 菌体的TCA酶活下降 可能干扰蛋白质合成， 导致蛋白质分解 NH4+水平升高减少柠檬酸对 该酶的抑制第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应 第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶：许多细胞中该酶是TCA的调节酶， 但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸 理论上此酶失活 水合酶：TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸柠檬酸生物合成途径①. C6H12O6 ?EMP 2C3H4O3 + 2ATP+ 2(NADH H＋) ?→ ? + ②. C3H4O3 + CoA- SH ?丙酮酸脱氢酶 CH3CO- SCoA+ CO2 + (NADH+ H＋) ??? → ? ③.C3H4O3 + CO2 + ATP?丙酮酸羧化酶 HOOCCOCHCOOH ??? → ? 2 ④.CH3CO- SCoA+ HOOCCOCHCOOH+ H2O ?柠檬酸合成酶 C6H8O7 + CoA- SH ??? → ? 2 3 电子传递链 + ? ⑤.3(NADH H＋) + O2 ??? →3H2O + 9ATP 2 总反应式： 3 C6H12O6 + O2 → C6H8O7 + 2H2O +10ATP 2柠檬酸的积累机制总结1)由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细 胞内NH4＋浓度升高和有一条呼吸活力强的不 产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别 解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进 了EMP途径的畅通； 2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控 制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。 丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个 反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增 强了合成柠檬酸能力。柠檬酸的积累机制总结3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠 檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸＝90∶3∶7； 4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬 酸积累； 5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠 檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自 身积累； 6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺 乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于 柠檬酸的积累并排出体外。柠檬酸积累的理想条件： 柠檬酸积累的理想条件： 1、提高磷酸果糖激酶的活性 2、提高丙酮酸羧化酶的活性 3、提高柠檬酸合成酶的活性 4、抑制顺乌头酸酶的活性 5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性 6、抑制α-酮戊二酸脱氢酶的活性 抑制α 7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性柠檬酸发酵需要下述环境条件 柠檬酸发酵需要下述环境条件(1)磷酸盐浓度低； (2)氮源用NH4+盐； (3)pH值低（&3.0）； (4)溶氧量高； (5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。柠檬酸发酵的产率1.无CO2固定反应的产率 192 /( 180×1.5) == 71.1% 2.通过 CO2固定反应提供C4二羧酸（无碳原子损失）192 / 180 == 106.6% C6H12O6 C6H8O7 (C没有增加) 可见，CO2固定反应与柠檬酸发酵的重要性 C6H8O7 H2O理论转化率：116.7%柠檬酸发酵实验柠檬酸发酵一、菌种：产生柠檬酸的菌种很多，以霉菌为 菌种：产生柠檬酸的菌种很多， 霉菌为 又以黑曲霉产生柠檬酸的能力较强， 黑曲霉产生柠檬酸的能力较强 主，又以黑曲霉产生柠檬酸的能力较强，并能 利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。 利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。 二、发酵机理：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸 发酵机理： 机理 循环；柠檬酸合成酶活力较高， 循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或 异柠檬酸脱氢酶可被某些因素， 异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的 缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。 缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。柠檬酸发酵三、工艺流程： 工艺流程：①发酵液的pH值对柠檬酸生成影响很大； 发酵液的pH值对柠檬酸生成影响很大； pH pH2~3时 发酵产物主要是柠檬酸； pH值中性 pH2~3时，发酵产物主要是柠檬酸； pH值中性 或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸； 或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸； 可往培养基中加入亚铁氰化钾或采取育种 亚铁氰化钾或采取 ② 可往培养基中加入亚铁氰化钾或采取育种 手段改造菌种 改造菌种， 乌头酸酶或 手段改造菌种，使乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶 缺失或尽量降低活性， 阻碍TCA循环的正常 TCA循环 缺失或尽量降低活性，以阻碍TCA循环的正常 进行，从而增加柠檬酸的积累。 进行，从而增加柠檬酸的积累。四、柠檬酸发酵用原料柠檬酸发酵的原料有三大类1. 2.糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、 淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木 薯等) 正烷烃类原料。3.营养物浓度对发酵的影响对生成量和组成都有影响 黑曲霉柠檬酸发酵 蔗糖浓度15%~18%，蔗糖同化率97% 蔗糖浓度20%，只同化92% 蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累 草酸 蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸五、柠檬酸发酵工艺 1) 试管斜面菌种培养察氏琼脂培养基：NaNO3 3g， 蔗糖 20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自 然。 察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g， NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0. 5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分绿0.4g，琼脂 20g， 蒸馏水1000ml， pH自然。1) 试管斜面菌种培养蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgSO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g ， MnSO4.4H2O 0.02g， 麦芽汁20ml， 琼脂20g， 用 水定溶至1000ml。 米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水， 于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度 至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂 2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉 孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。2) 种子扩大培养 ① 二级扩大培养a 培养基 有琼脂固体培养和液体表面培养两种方 法，前者的培养基组成与斜面培养基相同， 后者的组成如下：麦芽汁7?BX，氯化铵2%， 尿素0.1%，2) 种子扩大培养 ① 二级扩大培养b 培养 固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基， 250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成 斜面，凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认 无杂菌污染即可使用。 液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中， 使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌 15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液 体表面需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。② 三级扩大培养可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂 固体培养。 所用培养基如下： a 麸曲培养基： 新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培 养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相 同。 b琼脂固体培养基： 与斜面培养基相同。现代工业化大生产主要采用深层通风发酵 法。 日本约1／5的柠檬酸产品是利用固态发酵 法生产的， 浅盘发酵法在前苏联、印度、捷克．波兰、 保加利亚、阿根廷等国家主要使用， 我国、美国及西欧共同体国家则主要采用 液体深层发酵法进行生产3） 发酵生产 ） ① 工艺流程3） 发酵生产 ） ① 工艺流程以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程： 以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程： 斜面菌种→麸曲瓶 种子 斜面菌种 麸曲瓶→种子 麸曲瓶 ↓ 薯干粉→调浆 灭菌(间歇或连续式 冷却→发酵 发酵液→提取 调浆→灭菌 间歇或连续式)→冷却 发酵→发酵液 提取→ 薯干粉 调浆 灭菌 间歇或连续式 冷却 发酵 发酵液 提取 成品 ↑ 无菌空气 薯渣为原料的固体发酵工艺流程： 薯渣为原料的固体发酵工艺流程： 试管斜面→三角瓶菌种 种曲 试管斜面 三角瓶菌种→种曲 三角瓶菌种 ↓ 薯渣→粉碎 蒸煮→摊凉接种 装盘→发酵 出曲→提取 粉碎→蒸煮 摊凉接种→装盘 发酵→出曲 提取→成品 薯渣 粉碎 蒸煮 摊凉接种 装盘 发酵 出曲 提取 成品 ↑ 米糠② 柠檬酸的深层液体发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面 （或10～20°麦芽汁 10～20° ＋0.1%KH2PO4） 种子罐菌丝培养（也可以孢子接种） 种子罐菌丝培养（也可以孢子接种） 茄子瓶16％的薯干粉， 16％的薯干粉， α-淀粉酶液化发酵培养（32℃， 发酵培养（32℃，5～5.5天） 5.5天成熟的发酵液② 液体发酵 a 不置换法培养液一次加入，发酵结束后弃去菌盖， 发酵液用来提取柠檬酸。具体操作：接种后，培养温度维持在35℃， 这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右， 以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下 降时，必须通人约50℃的空气以维持35℃的 培养温度，通风量为3~5m3/m2.h。接种后20h 左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜 已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。 48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管 向盘层之间通汽，进汽温度为40℃左右，风 量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培 养液水分蒸发过快。接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速 率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释 放出大量热，最高时可达1000kJ/(m2.h)，此 时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在 26~28℃，以利柠檬酸的形成。 因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风 量至15~18m3/m2.h，且降低进汽温度在25℃ 以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结 束。b 置换法置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富 的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再 更换发酵培养基。可更换1次也可数次， 发酵液用来提取柠檬酸。培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量 再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢 子后，室温保持在34~36℃，培养液品温为 32~34℃，使孢子发芽，正常情况下40h即可形 成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基， 更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降 至30~32℃，待发酵48~60h后再放掉发酵液， 加入新培养液即进行第2次置换。如此重复， 一般可置换培养基8~10次，总发酵周期为 14~20d， 收集起来的发酵液，用来提取柠檬酸。置换法的优点是节省了大量培菌时间，发 酵速度快，而且原本不适宜长菌的原料都 可用作发酵培养基。 但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液 残糖控制得很低，这样一来就造成替换出 来的发酵液其残糖量较高，给后道提取柠 檬酸带来困难。c 不置换法影响表面发酵的因素a) 培养液层厚度 培养基液层厚度大，发酵产物总的生成量就 大。如果原料质量好，预处理方法得当，曲 霉菌丝体活力强，那末可适当增加液层厚度; 相反，就应减少液层厚度。c 不置换法影响表面发酵的因素b) 糖浓度 用于表面发酵的糖蜜浓度，质优的糖蜜浓度 (以蔗糖浓度计)为18%~22%较适宜，而质劣 的糖蜜一般采用14%。 在表面发酵中，大约80%的糖被用于合成柠 檬酸，菌体生长增殖耗糖8%左右，菌体进行 呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖 用于合成副产物。c) 温度 黑曲霉生长最适温度33-37℃，积累柠檬酸 的最适温度在32℃黑曲霉适宜产酸温度是26~28℃。温度高， 容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老；温度 低，发酵周期被延长。d) pH值 黑曲霉长菌的最适pH为中性，而产酸的最适 pH在2.5~2.0。因此，应该注意的是：菌盖形 成之后，只是在菌盖下面有一个低pH区域， 菌体合成柠檬酸的活动都是在这低pH区域内 进行的，所以不应该搅动发酵液，避免低值 区域的pH值上升而长菌不产酸。黑曲霉发酵柠檬酸， pH 3.0以下积累柠檬酸， pH 3.0以上积累草酸， pH5.0容易积累葡萄糖酸 与不同碳源有关，黑曲霉在合成培养基 上产柠檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯 干粉4.5e) 通风 表面发酵是气相传氧，因此传氧效率较高， 所以只要保持发酵室内有适当空气流通就可 以满足霉菌对氧的需要。较高度的CO2会影 响菌体的生长和降低产酸能力。一般将CO2 控制在3%以下。
② 固体发酵 a 浅盘发酵② 固体发酵 a 浅盘发酵将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。 在孢子发芽和菌丝生长期，由于产生的热量 少，品温会逐渐下降，在入室后自18h内，应 维持品温在27~31℃。培养18~48h期间，由于 发酵热的大量释放，品温上升很快，应采取 措施，不得让品温超过43℃ 菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维 持在35℃左右，直至发酵结束。为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右 时应将曲盘上下对调。整个发酵期间不必翻 曲。曲室相对湿度在85%~90%。 发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸 度，以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔 4h测定1次，在酸度达到最高时即出料，否则 时间延长，柠檬酸反而被菌体消化。b 厚层通风发酵b 厚层通风发酵与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度 上，厚层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅 盘发酵的15~20cm要大出许多。 为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进 行机械通风。培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管 理相似，但最高品温不能超过40℃。温度和 湿度主要靠通风来调节，因为物料厚度大， 所以培养过程中需要翻料。 厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面 积少，污染杂菌可能性小，机械化程度高。六、固定化黑曲霉发酵玉米生产 柠檬酸用固定化黑曲霉细胞发酵玉米生产柠檬 酸的最适温度是35℃,玉米糖液浓度 10Bx。在最适条件下柠檬酸产量可达 到96g/L,一般稳定在89g/L。六、固定化黑曲霉发酵玉米生产 柠檬酸固定化黑曲霉可连续使用24d(约8批次)。黑曲霉细胞固 定化后,产酸活力与降糖能力均与游离细胞水平相近。 但在连续分批发酵中,固定化黑曲霉细胞显示出明显的 优势,即:游离细胞连续使用2批次后,柠檬酸产量迅速下 降,而固定化黑曲霉使用8批次后,柠檬酸产量仍可达到 89g/L的水平。 黑曲霉细胞固定后柠檬酸产量逐步提高并超过游离细 胞最高水平,固定化黑曲霉菌体可连续使用20d以上,能 保证柠檬酸连续发酵的菌种活性时间,从而保证连续发 酵的成功。七、柠檬酸提取方法柠檬酸发酵液成分复杂，并且因原料和发酵 我国独创的薯粉直接深层发酵法工艺处于 工艺不同而各不相同．除柠檬酸外，还包括 世界先进水平，且自行开发的黑曲霉菌产 菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂 酸效率与国外接近，但在提取率、机械化 酸、无机盐等多种杂质，总的来说，它们来 程度和劳动生产率等方面比较落后， 源于原材料、未消耗的营养盐或发酵的中间 因而在国内研究从发酵液中高效、低能耗 副产物．所以从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸 是比较困难的． 地提取柠檬酸是一个极有意义的课题． 从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有 以下几种：钙盐法、萃取法、离子交换吸附 法、电渗析法、超滤膜法．1 钙盐法钙盐法是一种传统的从发酵液中提取有机酸的 方法，在中国用得最为普遍．它是利用柠檬酸 钙不溶于水，但能溶于酸的特点，在含柠檬酸 的上清液中加人CaCO3或Ca(OH)2中和，使柠 檬酸生成柠檬酸钙沉淀，固液分离后，柠檬酸 钙经过洗涤再用硫酸酸解，生成柠檬酸水溶液， 再经过脱色、去除阴、阳杂离子后得到提取液 进入浓缩、结晶工序得到纯柠檬酸固体产品．柠檬酸的提取常采用钙盐法，工艺过程 如下： ：发酵液预处理、 发酵液预处理、过滤清液洗涤菌丝碳酸钙中和洗涤水菌丝见下页碳酸钙中和废液柠檬酸钙 酸解、脱色（浓硫酸、活性炭） 酸解、脱色（浓硫酸、活性炭）硫酸钙、 硫酸钙、活性炭柠檬酸液 离子交换洗涤水洗涤 真空浓缩 硫酸钙、 硫酸钙、活性炭 母液 干燥、 干燥、成品 结晶钙盐法因为工艺成熟、设备简单、原材料易 得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛 使用。 缺陷日益显露: 一是得到的提取液中柠檬酸质量分数较低， 一般低于20%，增大了后续浓缩段的负荷; 二是单元操作损失多，总收率低，国内厂家 一般在60%~ 75%.超过70%的很少，对以薯 干为原料的生产工艺收率更低(我国主要以 薯干为原料);三是在提取过程中柠檬酸经历了多次相变， 消耗化工原料多，固液分离量大，能耗高; 四是环境污染严重，产生大量的固体废弃物， 其排放量1.0~ 2.5 t废物/t柠檬酸，在环境问 题日益突出的今天，这种方法越来越不适应 环保的要求. 另外还有提取工艺长、工人劳动强度大、工 作环境恶劣、提取设备腐蚀严重等缺点.2 萃取法目前研究的萃取剂包括:丁醇、丙酮、磷酸三 丁醋、TOA, N,N-二烷基酰胺、三烷基氧磷、 N-烷基酰胺和石油亚矾等，但研究得更多的 是有机胺. 反萃取剂大多是热水，但因为热水反萃效率 较低，为了提高反萃效率，有人还研究了醋 酸水溶液、盐酸的反萃效果.3 离子交换吸附法离子交换吸附法是利用特定的有机高分子树 脂对柠檬酸或柠檬酸盐的高选择性，将柠檬 酸或柠檬酸盐从发酵液中提取出来的方法.20 世纪80年代以来，国内外对离子交换吸附法 提取柠檬酸的研究很多， 国内一般的流程是发酵液过滤后用离子交换 柱提取，氨水洗脱后用阳离子交换柱转型， 经脱色和除杂质后进人浓缩和结晶.4 电渗析法70年代国内开始研究用电渗析的方法从发酵 液中提取柠檬酸，并取得了一定的进展。 电渗析法提取葡萄糖糖蜜发酵液的工艺流程 如图4所示．发酵液（pH=1.5～3.0）经过滤 预处理后，用电渗析器分离，并浓缩2倍，这 种粗提取液再利用活性炭和离子交换除去色 素和杂质离子，得到淡黄色、高纯度柠檬酸 水溶液5 超滤膜法在柠檬酸提取中使用超滤、纳滤和 微滤思考题1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点， 如何控制？ 2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3.简述二氧化碳固定反应对于提高柠檬 酸产率的意义。
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