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土壤微生物DNA提取方法的研究
&&DNA提取方法
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M9600 高通量全自动核酸提取仪
货　号：M9600
中文名：M9600 高通量全自动核酸提取仪
产品说明：
Maelstrom & 9600（高通量核酸蛋白纯化系统）
――快速纯化各种类型样品的核酸与蛋白
优势：高效、省时、节能、静音、无交叉污染
Maelstrom & 9600（高通量核酸蛋白纯化系统）是一种特殊的、快速的、高效率的、多试管一致的系统。它与配套的试剂盒一起使用，就能将来源(包括血液、组织、细菌、病毒、植物、大米等标本)的原始DNA、RNA和蛋白质进行提取和纯化。
技术特点：
&Maelstrom & 9600与目前已有的其它核酸提取系统相比，具有高通道、高效率、高稳定性、样本一致性好的优点。
分离纯化各种类型样品的核酸或蛋白：包括血液、组织、细菌、病毒、植物、大米等标本。
原理：磁珠提取纯化技术，转移磁珠时使用一次性独立磁套，避免交叉污染。
使用方便：Maelstrom & 9600是台湾圆点生产的最新产品,可同时处理1-96个样品。它采用独特的旋转搅拌方式，配合功能性磁珠，可以高效充分地提取各种样品。提取时，只要将样品转移到指定孔位，一次可以处理1-96个样本，选择好预设的程序后按run启动。在15-30分钟内，样品就提取完毕，而这一过程中几乎没什么噪音，方便、可靠、稳定、高效、快速地提取样品。
快速高效：高质量样品的关键在于快速、高效率的裂解。FastPrep& 系统的样品裂解在40秒内完成，最大限度的避免核酸的降解和蛋白的解离。不产生热量，几乎无对核酸和蛋白质的破坏作用。
专利设计的旋转搅拌技术：
Maelstrom & 系统的的运转部分采用专利保护的旋转搅拌技术，这种技术与现有市场上的上下搅拌或上下吹打技术相比，有以下优点：
1.&&&&& 在运行过程中不易产生生物气溶胶，避免交叉污染的产生，保证得到高稳定性的样本，为后续的实验提供最真实的实验样本
2.&&&&& 旋转搅拌技术不仅把核酸与磁珠的混匀时间减少了一半，而且提升核酸与磁珠结合效率，在等量的磁珠条件下，最终能够得到更多的核酸。
3.&&&&& 基于旋转搅拌技术生产的磁棒套体积更小，一方面单孔可处理的样本量可以从1.0ml提升到1.6ml,另一方面可以减少塑料的使用，更加环保。
4.&&&&& 旋转搅拌技术的应用把仪器运行产生的噪音控制到45分贝，给实验室人员一个安静、舒适的工作环境
配套支持系统全面灵活：
开放式系统，DNA、RNA、蛋白质的分离纯化都可以完成
可以处理各种不同类型的样品
提供技术支持与技术咨询
经济方便的选择
快速可靠的纯化方法
主要技术参数：
1.&& 用途：全自动核酸提取纯化系统，用于从各种材料，如全血、组织、咽拭子等提取DNA或RNA，无需离心或过滤操作。
2.&& 提取原理：磁珠提取纯化技术，转移磁珠时使用一次性独立磁套，避免交叉污染。
3.&& 样品处理数：1-96个。
4.&& 样品容量：50-1600 μl。
5.&& 磁珠收集效率≥95%
6.&& 磁棒运动轨迹：磁棒旋转式运动轨迹，有效避免气溶胶产生，提高混匀裂解效能，缩短核酸提取时间。
7.&& 温控模块：支持样本高温孵育和充分裂解洗脱模块，其中加热功能，孵育范围为室温下至120℃，支持样品充分洗脱。
8.&& 工业设计：超大彩屏导航式设计，可单独运行仪器程序，可直接在屏幕上看到实验运行情况和剩余时间，非常直观和易于使用。
9.&& 操作程序：专业软件，无程序锁软件，软件无限制使用，所有软件在线终身免费升级，无需额外购买程序费用，可根据不同试剂盒设定程序。提供常规的程序，以及可任意编写程序，有大量经验证的程序供直接使用，无需做测试实验，外界程序可以直接导入仪器主机，可存储100组程序。外部软件可创建和更改实验程序并免费升级。
10.& 产物纯度：A260/A280：DNA ≥1.7-2.0，RNA ≥1.8-2.1；可以满足PCR、定量PCR、测序、片段分析等实验。
11.& 试剂盒：开放性的系统，可以与国内外市场上几乎所有磁珠试剂兼容，厂家也提供完善的试剂盒种类可供选择，满足不同的实验需求。
12.& 样本设置：可以自定义抽提的板位和信息，可以控制样品的混合速度，停留时间，确保样本混合效果的同时，保证样品核酸的完整性。
13.& 紫外灯：配有紫外灯杀菌消毒，避免交叉污染，可设定具体操作时间。
14.& 具有一类医疗产品备案号，符合CE认证，提供完整进口报关单据。
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台湾圆点奈米技术股份有限公司是一家专业自动化核酸蛋白纯化操作及配套功能性磁珠制造商，公司建置有一万等级洁净室厂房，并严格遵照ISO13485与GMP管理规范进行设计和生产，使得产品质量和稳定性达到了国际水准。
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土壤DNA提取研究进展
　　摘要：DNA提取是分子生物学研究的基础，提取的DNA具备足够的纯度和结构完整性是进行PCR扩增等分子分析所必需的条件。土壤的组成和结构复杂，且类型多样，影响土壤DNA提取的因素有很多，研究土壤微生物多样性，关键是提取出足够数量、纯度、适当片段长度、具有代表性的土壤DNA。本文对土壤DNA提取的相关方面作了些论述，并探讨了DNA提取对土壤微生物多样性评估的偏差影响，最后进行了讨论和展望。 中国论文网 /8/view-5642669.htm　　关键词： DNA提取 土壤 微生物多样性 　　土壤是微生物生活的主要场所，蕴含着丰富的微生物资源并表现出高度的多样性，据估计每克土壤中含有种近109个细菌细胞，含有几千到上百万种不同的基因组信息。长期以来，对土壤微生物的研究仅限于极少部分可培养的微生物，而这种可培养的微生物还不到自然界微生物总量的1%，实际上绝大多数环境微生物都是不可或很难被培养的，利用传统的培养方法研究土壤微生物多样性，具有很强的偏好性。随着发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过培养方法来研究微生物多样性及功能这一局限，为土壤微生物研究开辟了新的道路[1]。而宏基因组学技术在研究土壤微生物方面的关键第一步是提取DNA。 　　提取高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA对土壤微生物多样性研究至关重要。然而，土壤是一个非常复杂的异质体系，其中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等，在DNA提取过程中如不能有效去除，将直接影响后续的PCR扩增、核酸杂交、内切酶消化等分子操作[2]。土壤微生物DNA的提取纯化是一个耗时、繁琐的过程，许多学者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。下面就近年来已发表的国内外DNA提取相关方面的文献，对DNA提取作了些论述。 　　一、土壤DNA 　　土壤中的DNA主要存在于细胞核内，核内DNA占整个细胞DNA量的90%以上，核外DNA主要有线粒体DNA和质粒DNA，因此，土壤DNA提取主要获得的是核内DNA[3]。 　　二、影响土壤DNA提取的主要因素 　　影响土壤DNA提取的因素主要有以下几点：1）DNA与土壤环境基质的相互作用。DNA与粘土矿物、高含量有机质等之间的吸附会降低DNA提取产量。2）DNA共提取物。土壤中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等对土壤DNA提取存在影响，限制性内切酶活性在共提取的腐植酸浓度为0.8-51.71μg/mL时就受到抑制，且Taq聚合酶对腐植酸具有高抑制敏感性[4]。3）DNA的降解、损失或损伤。土壤样品保存方法不当，会导致微生物细胞降解或DNA降解，如土壤样品储存在4℃下3周，高分子量DNA显著减少[5]；还有DNA提取过程越繁琐或步骤越多，DNA损失就越多，DNA提取过程中的剪切力也会对DNA分子会造成损伤。4）细胞不完全裂解。 　　三、土壤DNA提取方法 　　土壤样品的DNA提取，通常包括细胞裂解、细胞碎片的去除和核酸的沉淀与纯化三个步骤。根据微生物细胞是否需要从他们的环境基质中分离出来，可将DNA提取方法分为直接法和间接法，直接法耗时短且具有更好的DNA恢复率，可以获得更好体现样品微生物多样性的代表性DNA，从而直接法得到更为普遍的应用[6]。 　　已经出现了很多被接纳并广泛使用的土壤DNA提取方法，可以说这些方法被当作了标准。其中，Zhou 等[7]于1996年提出了一种多元组成土壤DNA恢复方法，该研究为应对某一具体的土样提供了指导便于选择适当的DNA提取和纯化方法。有人在此基础上，改进了方案，来提取几种性质不同的土壤样品DNA，并得到了较好的结果[8]。而有些土壤样品来自于极端环境或由于本身特性，提取出满足用于分子分析的DNA比较困难。这时结合使用不同的细胞裂解方法就显得特别重要（常见的细胞裂解方法见表1）。例如引进土壤预洗涤程序用于提取一般有机质（腐植酸）和金属离子含量比较高的森林土样DNA，DNA提取产量和质量可以得到改善[9]。风沙土壤本身微生物数量较低，需要采取特殊的土壤处理方法，以获得足够产量的DNA，张颖等人也报道了一种风沙土壤微生物总DNA提取方法，获得的DNA可直接用于PCR分析[10]。还有，一些极端环境如火山土壤样品DNA提取面临着粘土和其他矿物含量高的难题，Ruth M.Henneberger等[11]尝试了各种提取方法，最终成功地提取到了效果较好的DNA，这都证明了结合使用不同提取处理的重要性。 　　DNA提取技术除了在土壤样品上的应用外，还有很多其他的环境样品如沉积物、堆肥、植物组织、动物标本、消化物或粪便、骨骼牙齿、化石冰与冻土、碳酸盐岩石、唾液等。另一方面，DNA提取技术的不断发展与成熟也促进了市场上出现了许多各种各样的商业化DNA提取试剂盒。S.M. Dineen等[12]比较了6种商业DNA提取试剂盒用于三种土样细菌孢子的DNA提取，结果表明FastDNA？?SPIN kit提取DNA产率最高，而E.Z.N.A.？?Soil DNA和PowerSoil？?DNA Isolation kits在去除壤土提取物中PCR抑制物方面表现出最高的效率。 　　以上所诉的大多属于直接法，直接法虽然产量高，但是纯度一般较低，有时需要进一步的纯化，获得的DNA片段也较小；相对而言，间接法虽然需要另外的特殊处理材料和足够的土壤数量，耗时长，但获得的DNA纯度高、长片段多，且含有更少的真核基因序列，在进行深入的微生物群落测序和克隆构建福斯质粒文库方面，间接法是一个有用的方法[13]。 　　四、土壤DNA提取方法对土壤微生物多样性分析的偏差影响 　　已报道的从土壤中提取DNA的方法有很多种，但大多数只适用于有限的土壤类型，这些核酸提取方法也会有复杂的低效性，不可避免地会引进各自的偏差[14]。Jan Dirk van Elsas等[15]比较分析了四种提取方法获得的DNA多样性，发现方法对表观丰度和群落结构有明显的影响，其中，通过两种方法获取土壤DNA得到了一种迄今未描述的放线菌组。为了改善宏基因组方法，研究DNA提取偏差以及提供一些工具便于评价不同组的丰度，Tom O.Delmont等[16]人也设计并开展了实验，他们的工作强调了提取的DNA库与目前无法获取的完整土壤宏基因组之间的不同。
　　目前，绝大多数土壤微生物基因组总DNA提取时采用的是一次裂解，而一次裂解并不能得到较为完全的土壤宏基因组，因此一般基于提取的DNA分析获得的土壤微生物多样性可称为表观土壤微生物多样性。为了尽量获取完整的土壤样品DNA，Larry M.Feinstein等[17]在评估了一个常用土壤DNA提取试剂盒时，改变了细胞裂解方案，对粘土、砂土和有机质土壤子样品进行多次连续DNA提取，得出大部分DNA能够通过前几次提取获得，并且通过集中三次连续提取，DNA提取的偏差可以得到很大程度降低。同样，郭?等的实验结果也证实了这点，土壤DNA的3次连续提取最低回收率占5次连续提取的76%以上，而且与新鲜土壤相比，风干过程显著降低了土壤微生物丰度，但利用风干土壤中微生物丰度的变化趋势反映新鲜土壤中微生物数量变化规律具有一定的可行性，这也为使用风干土壤进行土壤微生物多样性研究提供了一定的依据[18]。 　　五、讨论与展望 　　对于同一份土壤样品，不同的DNA提取方法获得的DNA往往具有差异而表现出方法特异性。DNA提取也会有复杂的低效性，土壤宏基因组DNA的不完全提取，土壤中的腐植酸、蛋白质等物质对PCR的抑制，这些都会对土壤微生物多样性造成偏低的评估，提取的土壤DNA质量将直接影响到后续的分子生物学分析的真实性。目前，没有一种DNA提取方法适用于所有类型的土壤样品，在面对一些棘手的土壤样品DNA提取时，可采取一些不同的提取方法。 　　土壤DNA提取是进行土壤分子生物学分析的关键步骤，也是一个限制步骤。随着PCR芯片和高通量测序技术的不断发展和应用，对大批量土壤样品DNA的快速获取也变得迫切需求。虽然市场上出现的商业DNA提取试剂盒已为土壤DNA的获取提供了不少方便，但在应对较多的土壤样品量，还是需要消耗较多时间来手工操作，缺乏自动高效性。 因此，必须寻求更加高效的DNA提取方法。■ 　　参考文献 　　[1] 钮旭光，韩梅，韩晓日. 微生物学通报，2007， 34（3）：576-579. 　　[2] 宋培勇，马莉莉. 安徽农业科学，）：. 　　[3] 郑璐，高乃云. 科技信息综述，）：175-178. 　　[4] C C Tebbe and W Vahjen. Appl. Environ. Microbiol， 1993， 59（8）：2657. 　　[5] C.C. Tien， C.C. Chao， and W.L. Chao， Jounal of Applied Microbiology， 7-943. 　　[6] C.L. Roose-Amsaleg， E. Garnier-Sillam， M. Harry. Applied Soil Ecology， 2001， 18：47?60. 　　[7] Jizhong Zhou， Mary Ann Bruns， and James M. Tiedje. Appliedand Environmental Microbiology， 1996， 62（2）：316?322. 　　[8] 张海燕，王彩虹，龚明福，等. 生物技术通报，2009，（8）：151-155. 　　[9] Jizheng He， Zhihong Xu， Jane Hughes. Soil Biology & Biochemistry， 2005， 37：. 　　[10] 张颖， 曹成. 东北大学学报，）：. 　　[11] S.M. Dineen， R. Aranda IV， D.L. Anders， and J.M. Robertson. Journal of Applied Microbiology， 2010， 109：. 　　[12] Tom O. Delmont et al. Journal of Microbiological Methods， 2011， 86：397-400. 　　[13] ？?zgül Inceoglu et al. Appl. Environ. Microbiol， 2010， 76（10）：3378. 　　[14] Tom O. Delmont et al. Appl. Environ. Microbiol， 2011， 77（4）：1315. 　　[15] Larry M. Feinstein， Woo Jun Sul and Christopher B. Blackwood. Appl. Environ. Microbiol， ）：5428. 　　[16] 郭?，吴宇澄，林先贵，等. 微生物学报，2012， 52（7）：894-901. 　　作者简介：韩朋（1988-），男，汉，湖北襄阳，硕士，学生，研究方向：地址工程。
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摘要 : 从全血中提取DNA和RNA应该说是最基本的工作了，提取的DNA和RNA质量的好坏直接影响了下游的实验和分析，可供选择的方法非常多，乱花渐欲迷人眼，如何选择最适合的方法，成了很多人实验开始前最难以抉择的事情。我们从两个方面，层层剥茧，分析最佳的实验方法。
从全血中提取DNA和RNA应该说是最基本的工作了，提取的DNA和RNA质量的好坏直接影响了下游的实验和分析，可供选择的方法非常多，乱花渐欲迷人眼，如何选择最适合的方法，成了很多人实验开始前最难以抉择的事情。我们从两个方面，层层剥茧，分析最佳的。
1、 全血的采集保存和
I. 用 含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应，如果没有采血管，也可以自己添加抗凝剂EDTA，提前准 备0.04M的，每5ml的血液中加入0.4ml配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。保存于-20℃至-80℃，一般2-3年内均可以提取，保存时间越短，提取的质量越高，最好在2个月内提取。
II. DNA提取方法的选择：全血提取试剂盒一般有离心柱和溶液型两种(比如Qiagen、 Promega、B摒弃酚氯仿手提的方法，时间长毒性大)，原理及步骤基本相同。虽然各公司推出了N多型号，让人不知如何去选择，但从原理 和操作步骤看，基本就是离心柱和溶液型两种。一般来说，离心柱(DP1801)的提取纯度高一些，但是处理量小(0.1-1ml)、得率略低;溶液型 (DP2101或DP2201)的提取量大(1-10ml)得率也高于离心柱。医院的血液标本一般在2ml以上，一般选择溶液型的方法提取.在说到国产和 进口差别的时候，很多人以为进口一定比国产的好，我们觉得没有最好，只有更好!在不断的进行试验优化之后，全血试剂盒DP2101或 DP2201开创了第三代技术，不需要蛋白酶K消化，进口的都是要借助蛋白酶K的啊!DP2101或DP2201减少了蛋白酶K现配现用的麻烦和消化的时 间，而且提取量和稳定性更好。
III. 非抗凝血(凝固血)能否提取?答案是肯定的，而且一点都不麻烦，提取效果和抗凝血没有差别!在你找遍了进口的所有品牌都找不到后，回过头来您才发现原来他就在身边，百泰克的凝固血基因组已经有很多忠实的用户。
2、 全血如何提取
I. 全血过程哪些是RNA降解的因素?
全血中RNA酶是非常丰富的，RNA在没有保护的状态下很 容易降解!哪些是状态RNA不受保护呢，比如红细胞裂解液裂解红细胞的过程，红细胞裂解液是低浓度的平衡盐溶液，没有抑制RNase的成份，这时候RNA 不受保护;DNA酶消化的时候RNA也不受保护，这个时候也没有抑制RNase的成份。
II. 什么样的提取方法更好?
我们在选择方法的时候要倾向于对RNA全程有保护的方法!一般的方法都是先用红细胞裂解液裂解红细胞，然后从白细胞提取核酸，还要经过DNA酶的消化去除DNA，这种并不是最好的方法，过程中有很多RNA降解的因素。所以直接裂解法是最好的方法，将采集的血液迅速加入3倍体积的裂解液RLS&&血液(液体样本)总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)的裂解液，迅速颠倒混匀。裂解液RLS含有强烈的蛋白变性剂，能迅速变性蛋白，是RNase变性，不能对RNA降解。裂解后的混合液还可以用来运输，以避免RNA降解，这个方法成为博奥生物制作表达谱芯片RNA运输和提取的推荐方法/newsf/8.htm
农药、除草剂、各种污染物、人工合成物等异生物质，对环境和土壤微生物的多样性、种群变化产生明显影响;转基因作物是否发生土壤基因转移的检测，转基因作物的安全性评价等
方面的研究，都需要准确的提取高质量的DNA进行检测!
土壤中可培养的微生物可能不及所有微生物总数的0.3%，常规提取DNA的方法很难提取到DNA，很难把土壤中的腐殖酸去除干净，而微量的腐殖酸就可能导致PCR失败。
目前国际上商用的试剂盒虽然能提取到土壤中微生物的DNA，但由于破碎方法采用玻璃珠或者钢珠破碎，导致基因组断裂严重，影响DNA质量;第二，由于必须购买破碎专用的破碎机或振荡器，增加其使用成本;第三，其试剂盒为了保证DNA纯度，采用了包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致了DNA大量的损失，得率很低，很难真正反映出土壤中微生物的多样性。
百克推出的土壤基因组DNA快速提取试剂盒(DP4001)采用创新技术，摒弃了机械破碎细胞的方法，采用酶法破碎，保证了基因组的完整性，摒弃了玻璃奶、离心吸附柱串联纯化DNA的方式，极大的提高了DNA的得率，几乎土壤中所有的微生物DNA都能提取出来，能真正反映土壤中微生物的多样性!
作者：青岚 点击：次
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