《间充质干细胞的培养》
重患者，风险虽大，但亦可试用本法。（3）并发症主要有再出血，与脑血管穿刺损伤、抽吸时附壁血栓脱落、血肿清除后血管周围压力不平衡和患者自身出现倾向有关。急性脑水肿与一次抽吸血肿量过多有关；另外还有颅内积气（额部锥时易并发）、硬膜外血肿（颞部锥时易并发）、感染、死亡等。3 讨论脑内血肿导致死亡和致残的主要原因是脑血肿对周围脑组织的压迫损伤以及随之而来的脑水肿和脑疝形成，尽早清除血肿，有效解除脑组织受压，缓解急性颅内压增高，减轻脑水肿，防止脑疝形成是治疗成败的关键。采用锥颅穿刺血肿引流术可以减轻脑组织受压的强度和时间，减轻继发性的病理生理恶性循环，有效控制血管源性及细胞源性的脑水肿（3）。从而减轻占位效应，迅速降低增高的颅内压；CT监控引导下微创锥颅血肿引流术其优点是使不可视的抽吸术在影像学的直接可视下动态观察脑内血肿被清除的情况。在手术时间的选择方面，随着CT在临床上的广泛应用，发现脑内血肿起病1小时后仍可继续出血，但多数于3-4小时内停止；有人对高血压脑出血的患者出血4小时时注射CR-51标记的红细胞，未发现血肿有明显的发射性;出血半小时后邻近脑组织出现“海绵样”改变，且范围不断扩大，6小时后出现坏死，说明继发性不可逆损害多在出血后6-7小时后产生，且后果较出血本身更严重（2）。脑内血肿向周围脑组织挤压引起脑疝，从而导致中枢性的功能衰竭是该病致死的主要原因，且死亡病例都发生在出血后早期，故宜在出血超早期（7h）介入治疗。手术的目的就是清除血肿，降低颅内压，打断其恶性循环，保护半暗带的细胞。所以我们的手术时机的选择在出血后4-7小时内进行。尿激酶是一种外源性非特异性纤溶酶原直接激活剂，已证明其是溶解血肿的一种比较安全有效的生物学制剂，对正常脑组织不产生有害作用，能将血凝块液化便于引流。锥颅引流术创伤小，能避免和减轻并发症的发生，降低死亡率，且操作简便，费用低，不失为基层医院治疗脑内血肿良好方法，值得推广。参考文献[1]　李果珍；临床CT诊断学 –北京：中国科学技术出版社，]　赵雅度，高血压脑出血的外科治疗；见：王忠诚，主编；神经　　外科手术学。北京，科学出版社，.[3]　张向华 ，高血压壳核出血的简易立体定向穿刺术的研究 中　　国医刊）：38-40.浅谈皮肤间充质干细胞的培养与鉴定杜　捷1　　张　静2　　张开明3　　刘瑞风4　　马登峰 5（太原市中心医院　山西　太原030000）【摘要】目的：从人皮肤组织中成功分离培养出皮肤间充质干细胞（SMSCs），并将其诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及血管内皮细胞。体外长期传代培养SMSCs仍保持良好的干细胞特性, 这为SMSCs的深入研究与心血管系统细胞移植提供了新的细胞来源。方法：分离、培养SMSCs，传至第5代用流式细胞仪进行表面标志鉴定；取第5代细胞分别向脂肪、成骨细胞、软骨细胞及血管内皮细胞诱导分化。结果：倒置相差显微镜下细胞呈成纤维细胞状形态，细胞表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈高表达，而CD34、CD45 和HLA-DR表达阴性。经诱导分化后，细胞均可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞。结论：从人体皮肤组织中可成功分离、培养出SMSCs并能成功定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，为细胞移植治疗心血管疾病提供新的原料来源。【关键词】皮肤间充质干细胞；血管内皮细胞【中图分类号】R813.11　　　　　　　【文献标识码】A　　　　　【文章编号】-（0-03近年来，冠心病的发病率、死亡率逐年升高，日益成为严重危害人类健康的疾病，目前治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗和手术。随着冠状动脉旁路移植术和介入治疗的深入开展，以及药物治疗日益规范化，冠心病的急诊抢救成功率明显提高。然而，常规的治疗手段并不能修复已死亡或濒临死亡的心肌，因此，越来越多的研究者把目光投向细胞移植治疗。其中干细胞移植作为一种新兴的方法，为冠心病的治疗开创了全新的领域。近年来，国内外研究发现[1]将骨髓间充质干细胞移植治疗冠心病，可使梗死心肌减小梗死面积、抑制心室重构、改善心功能，但骨髓间充质干细胞却具有取材困难，操作复杂，费用昂贵等多种问题，介于此诸多问题，最近的研究表明, 人体的骨骼肌、皮肤和脂肪、肺、肝等组织中也存在间充质干细胞[2-3], 也具有多向诱导分化能力[4]，在一定的条件下可诱导分化为心肌细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，同样可用于难治性疾病的治疗［5-7］。由于皮肤组织具有来源方便，操作简单，费用不高等优点，我们可以从皮肤组织中分离、培养出SMSCs，从而诱导分化为血管内皮细胞等应用于临床，基于这种设想, 我们进行了下面的研究。1 材料与方法1.1　主要试剂与仪器
细胞培养瓶、24孔培养板为Corning产品， DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）为Hyclone产品，DispaseⅡ、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、胰岛素转铁蛋白亚哂酸钠、地塞米松、重组人胰岛素、吲哚美辛、胰蛋白酶、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、甲苯胺蓝、B27添加剂购自Sigma公司，丙酮酸钠和非必需氨基酸购自Gibco公司，重组人转化生长因子-β3（TGF-β3）购自R＆D Systems公司。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD29,CD44, CD73, CD90, CD105, CD34, CD45, CD31 及 HLA-DR单克隆抗体均购自BD公司，倒置相差显微镜购自OLYMPUS公司，CO2培养箱SL2300（美国），流式细胞仪BeckmanCoulter EPICS-XL 型(美国)。1.2　皮肤间充质干细胞培养的方法
SMSCs的分离、培养与鉴定：在无菌条件下将标本制成1.5mm3大小的组织块，用0.25%Dispase酶Ⅱ在37℃环境下消化2～4h后机械分离表皮、真皮，同时收集真皮部分使其尽量切碎，将切碎的真皮组织加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，经吸管反复吹后使细胞分离，并通过孔径40μm的筛网过滤，将滤过液静置于冰上20～30min后通过离心机离心弃上清液，加培养基重悬细胞。培养条件为：DMEM/F12培养基、5%胎牛血清、bFGF10ng/mL、B27添加剂10μl/mL、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL，以1×105个/cm2密度接种于T25塑料培养瓶内，静置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育。72h后，半量换液弃去悬浮细胞，同时加入新配制的上述培养基，继续培养贴壁细胞，以后每3天半量换液1次。通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况，并记录细胞生长形态，当细胞生长接近90%融合状态时用0.25％的胰酶进一步消化传代。通过上述方法将细胞传至第5代后用胰酶消化，并收获细胞，用PBS洗涤后计数，分别取2×105 个细胞与FITC标记的鼠抗人CD29, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105 和 HLA-DR单克隆抗体室温避光反应30min,用PBS洗涤后进行流式细胞术分析，对SMSCs进行鉴定。1.3　SMSCs的多向诱导分化及分化细胞的鉴定从人皮肤组织中分离培养出SMSCs并传至第5代后再培养2d的SMSCs，诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞及血管分化体系：含VEGF 50ng/ml、bFGF 10ng/ml、2%胎牛血清的DMEM/F12培养基，每3d半量换液,显微镜下观察细胞生长情况，诱导21d后流式细胞术检测CD31、CD45、HLA-DR、ICAM-1表达情况。2 结果2.1　SMSCs的形态特点在倒置相差显微镜下观察，SMSCs接种72h后，可见少量贴壁细胞，随着培养时间的延长贴壁细胞逐渐增多，细胞明显增大且分裂增殖，外观为短或长梭形，部分细胞呈三角形或多角形，形态结构上为梭形成纤维细胞状，长短不一、胞体膨大、有大小不均的胞浆突起，且互相连接，细胞互相重叠呈复层生长（如图A1、B1），至细胞接近达90%融合状态（如图C1）。传代细胞经过0.25%胰蛋白酶消化后开始变形，形态似圆形，经24h后恢复原先形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，3～4d后再次呈融合状态。内皮细胞（VECs）。A.脂肪分化体系：含1μM地塞米松、0.2mM的吲哚美辛、5 mg/L胰岛素、0.5 mM IBMX和10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，每3天换一次培养基，通过显微镜观察细胞生长情况，10天后，细胞用10%福尔马林固定10分钟，用60%异丙醇洗涤，油红O染色10分钟，然后，观察细胞中的脂滴；B.成骨细胞分化体系：含0.1μM地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mM甘油磷酸的DMEM/F12培养基，每周换两次培养基，连续换3周，细胞经10%福尔马林固定20 min，用2%茜素红溶液染色1小时后通过显微镜观察细胞生长情况；C.软骨细胞分化体系：含2mM的L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%胰岛素转铁蛋白亚哂酸钠培养基添加剂、1%丙酮酸钠、50μg/mL的抗坏血酸、0.1μM的地塞米松、10ng/mL的TGF-β3、DMEM/F-12培养基，培养21天后，SMSCs丧失其成纤维样形态而开始表达大量软骨特异性胞外成分，细胞形态明显改变，用4%多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5μm的薄片，用甲苯胺蓝染色，并进行分析；D.VECs图1 SMSCs形态特点（×200） A:SMSCs培养5d，细胞为梭形成纤维细胞状形态; B:SMSCs培养15d，细胞数量增多; C:SMSCs培养25d,细胞达融合状态2.2 　SMSCs表型鉴定结果将SMSCs传至第5代后经流式细胞仪检测，表面抗原CD29，CD44，CD73，CD90，CD105呈高表达，分别为94.52%，98.73%，73.45%，75.36%，76.8%，而CD34，CD45及HLA-DR表面抗原表达阴性，分别为1.73%，2.16%，和1.38%，说明分离、培养后获得的细胞符合SMSCs的特点。VECs表面抗原CD31、CD34、CD45、ICAM-1均呈高表达，分别为68.84%，64.37%，67.24%，73.46%，均与以往相关文献报道结果一致。2.3　SMSCs的诱导分化结果倒置显微镜下观察，SMSCs在脂肪诱导体系中，细胞经油红O染色后70％的细胞富含脂滴（图a）；在成骨细胞分化体系中，细胞经2%茜素红溶液染色1小时后通过显微镜观察细胞生长情况（图b）；在软骨细胞分化体系中培养21天后，SMSCs丧失其成纤维样形态而开始表达大量软骨特异性胞外成分，经甲苯胺蓝染色后通过显微镜观察细胞生长情况（图c）；在VECs诱导体系中，间充质干细胞逐渐成为短纺锤形，部分区域形成单层“铺路石”样（图d）。图a、b、c、d分别为正常SMSCs诱导的脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞及血管内皮细胞形态特点（×200） a.脂肪细胞经油红O染色后；b.成骨细胞经2%茜素红溶液染色后；c.软骨细胞经甲苯胺蓝染色后； d.内皮细胞呈铺路石样3 讨论近年来，国内外研究发现将骨髓间充质干细胞移植治疗冠心病，可使梗死心肌减小梗死面积、抑制心室重构、改善心功能，但骨髓间充质干细胞却具有取材困难，操作复杂，费用昂贵等多种问题，介于此诸多问题，最近的研究表明, 人体的骨骼肌、皮肤和脂肪组织中也存在间充质干细胞, 也具有多向诱导分化能力，在一定的条件下可诱导分化为心肌细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。由于皮肤组织具有来源方便、取材容易、操作简单、费用不高且无害于健康，加之皮肤生长速度快，所诱导的组织不受主要组织相容性复合物的限制等优点，我们可以从皮肤组织中提取间充质干细胞，从而诱导分化为血管内皮细胞等应用于临床，基于这种设想, 我们进行了研究。从正常人皮肤组织中成功提取出SMSCs，在不同培养基及不同培养方式下进行培养、传代，通过相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记CD29, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105 和 HLA-DR。在含有地塞米松、胰岛素和胎牛血清的DMEM/F12培养基中向脂肪细胞诱导分化；在含有FBS、DMEM/F12、地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C的培养基中向成骨细胞诱导分化；在含有DMEM/F-12、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必须氨基酸、胰岛素转铁蛋白亚哂酸钠培养基添加剂、抗坏血酸-2-磷酸、地塞米松、TGFβ3培养基中向软骨细胞诱导分化；在含有VEGF、bFGF、胎牛血清、DMEM/F12培养基中诱导分化为血管内皮细胞。SMSCs在镜下外观均呈梭形，生长增殖能力良好。细胞表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈高表达，CD34、CD45 和HLA-DR呈阴性。经定向诱导分化后，SMSCs可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞。然而通过利用SMSCs生物学特性向血管内皮细胞、心肌细胞诱导分化后应用于临床的相关研究报道资料很少，该领域的研究尚处于探索阶段，目前的临床应用只是一个初步的探索和尝试，尚没有大样本、随机的临床试验，其中还存在诸多问题亟待解决。参考文献[1]　Guo YT．Li XY，Wu D，et a1．Bone mal'lT’w mesenchymal 　　eell trans—plantation rPdut·Ps left ventrieular remo　　deling in Ilearl fallure f01.10win gacutemy,wardiMinfan·　　tion[川．ZhonghHa Xin Xue(；nanBing Za Zhi，)　　：784—788．[2]　Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. 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J Gas　　troen Hepatol. ):.非显性因素所致慢性阻塞性肺疾病急性加重合并肺栓塞的临床特征与相关因素分析梁　兴（广西壮族自治区龙潭医院　广西　柳州　545005）【摘要】目的：探讨非显性因素所致慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）合并肺栓塞的临床特征以及相关因素。方法：选取我院2011年1月--2013年1月间收治的100例非显性因素所致的AECOPD患者作为研究对象。按照是否发生了肺栓塞将这些患者分为A组（发生了肺栓塞）和B组（未发生肺栓塞）。在试验中为这两组患者进行体格检查、心电图检查、双下肢静脉彩超检查、CT肺动脉造影检查、动脉血气分析、血浆D-二聚体检测和内皮素-1检测。最后，观察、比较这两组患者的检查结果和临床特征。结果：①在卧床时间、是否发生晕厥、是否形成深静脉血栓、双侧下肢是否等粗、心电图I导联的S波T波是否倒置、心电图Ⅲ导联的Q波是否显著、PaCO2是否低于基线值、D-聚体的水平是否升高等方面，两组患者具有显著性差异（x2=4.29--6.83，P＜0.05）。②A组患者的D-二聚体平均水平、内皮素-1中位数均高于B组患者，且两组间的差异具有显著性（P＜0.05）。③双侧下肢不等粗差距大于1cm、卧床超过7d、深静脉血栓形成是AECOPD合并肺栓塞的危险因素。结论：非显性因素所致的AECOPD其患者合并肺栓塞的可能性高。而这一现象与患者长期卧床、深静脉血栓形成和双下肢不等粗等因素存在关联。 【关键词】非显性因素；慢性阻塞性肺疾病急性加重合并肺栓塞；特征【中图分类号】R563 　　　　　　　【 文献标识码】B　　　　　【文章编号】-（3-02 　　　近几年，尽管临床诊断肺栓塞的技术有了很大的进步，但要鉴别诊断非显性因素所致慢性阻塞性肺疾病急性加重（以下简称为AECOPD）与合并肺栓塞的AECOPD仍然具有不小的难度[1]。区分单纯AECOPD与合并肺栓塞的AECOPD临床特点、明确AECOPD合并肺栓塞的相关因素是准确诊断AECOPD合并肺栓塞并积极开展治疗的关键[2]。为了探讨AECOPD合并肺栓塞的临床特征及相关因素，笔者对我院2011年1月--2013年1月间收治的100例非显性因素所致的AECOPD患者进行了相关试验，现报告如下。1 资料与方法1.1 　一般资料选取我院2011年1月--2013年1月间收治的100例非显性因素所致的AECOPD患者作为研究对象。按照是否发生了肺栓塞将这些患者分为A组（发生了肺栓塞）和B组（未发生肺栓塞）。A组患者有30例。其中，男性患者有21例，女性患者有9例，其年龄为48--83岁，平均年龄为63.4±0.7岁。B组患者70例。其中，男性患者有42例，女性患者有28例，其年龄为47--83岁，平均年龄为62.8±0.9岁。1.2　方法在试验中为这两组患者进行体格检查、心电图检查、双下肢静脉彩超检查、CT肺动脉造影检查（CTPA检查）、动脉血气分析、血浆D-二聚体检测和内皮素-1检测（病情稳定者可接受肺功能检查）[3]。1.2.1　CTPA检查　CTPA检查的范围为主动脉弓至横膈水平，检查重点为是否存在管壁增厚、充盈缺损的情况、是否存在肺动脉闭塞的情况、肺门处是否存在磨玻璃致密影、在增强扫描时有无供血区肺动脉分支纤细的现象。1.2.2　下肢静脉超声检查　下肢静脉超声检查的部位为下肢髌骨下沿10cm处，检查重点为寻找存在于静脉腔中的实性回声、寻找探头加压时未压陷的管腔、观察挤压远端肢体时血流信号的变化情况[4]。1.2.3　内皮素-1检测　采集患者的外周静脉血标本为其测定内皮素-1的含量。在检测过程中个，将患者的血液标本加入到含有抑肽酶、乙二胺乙酸二钠抗凝剂的试管内，之后做离心处理并采用酶联免疫吸附法测定血液标本中的内皮素-1含量。1.2.4　血浆D-二聚体检测　采用快速酶联免疫吸附试验为患者检测血浆D-二聚体水平。1.3　 数据处理本次研究的所有数据均应用SPSS16.0统计学软件进行分析，正态分布计量以t检验，非正态分布数据以Mann-Whitney u检验，计数资料的对比应用卡方检验， P＜0.05时，差异具有统计学意义。2 结果2.1　两组患者的临床特征在卧床时间、是否发生晕厥、是否形成深静脉血栓、双侧下肢是否等粗、心电图I导联的S波T波是否倒置、心电图Ⅲ导联的Q波是否显著、PaCO2是否低于基线值、D-聚体的水平是否升，高等方面，两组患者具有显著性差异（x2=4.29--6.83，P＜0.05）详见表1。2.2　两组患者的 D-二聚体水平和内皮素-1水平A组患者的D-二聚体平均水平为（763±108）μg/L， B组患者的D-二聚体平均水平为（247±34）μg/L。A组患者的内皮素-1中位数（四分位间距）为5.6ng/L（1.5--7.1ng/L），B组患者的内皮素-1中位数为1.7ng/L（1.2--4.4ng/L）。A组患者的D-二聚体平均水平、内皮素-1中位数均高于B组患者，且两组间的差异具有显著性（P＜0.05）。2.3　回归分析结果双侧下肢不等粗大于1cm、卧床超过7d、深静脉血栓形成为AECOPD合并肺栓塞的危险因素，详见表2。浅谈皮肤间充质干细胞的培养与鉴定作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：杜捷， 张静， 张开明， 刘瑞风， 马登峰太原市中心医院 山西 太原030000当代医药论丛Contemporary Medicine Forum2014(11)引用本文格式：杜捷.张静.张开明.刘瑞风.马登峰 浅谈皮肤间充质干细胞的培养与鉴定[期刊论文]-当代医药论丛 2014(11)
生物医学工程学杂志)∶514～517　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　JBiomedEng皮肤间充质干细胞的体外培养和分化杨立业　刘相名　惠国桢　费　俭　郭礼和1(苏州大学附属第一医院神经外科,苏州　215007)2(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海　200031)1△1122*摘要　从小鼠的皮肤组织中原代分离间充质干细胞,采用无血清培养基培养,经过2次传代后改为有血清培养,多次传代的细胞进行免疫细胞化学鉴定和诱导分化实验。结果表明:小鼠皮肤组织中的间充质干细胞体外可以长期培养,多次传代的细胞仍具有干细胞的特征,形态均一,体外增殖迅速,保持了向成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞分化的潜能。体外长期传代培养小鼠皮肤间充质干细胞仍保持良好的干细胞特性,这为皮肤间充质干细胞的深入研究与中枢神经系统细胞移植提供了新的细胞来源。关键词　皮肤　间充质干细胞　神经元Long-termCultureandDifferentiationofSkin-derivedMesenchymalStemCells1△1122YangLiye　LiuXiangming　HuiGuozhen　FeiJian　GuoLihe1(DepartmentofNeurosurgery,TheFirstHospitalofSuzhouUniversity,Suzhou　215007,China)2(InstituteofBiochemistryandCellBiology,ShanghaiInstituteforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai　200031,China)Abstract　Theaimofthisstudywastoinvestigatethecultureconditionsofskin-derivedmesenchymalstemcell(sMSCs)andtoexploreanewcellsourceforcentralnervoussystemcelltransplantation.Thecellsfromskinsofmicewereprimarilyisolatedandculturedinserum-freemedium,andtheyweretransferredintoserum-containingmediumafterpassaged2,andthepassagedcellswereidentifiedbyimmunocytochemistryandinducedtodifferentiateintomultiplelineages.TheresultsindicatedthatapopulationofsMSCscouldbeisolatedfromskins,theycouldbemaintainedinvitroforextendedperiodswithstablepopulationdoubling,andtheywereexpandedasundifferentiatedcellsincultureformorethan10passages,indicatingtheirproliferativecapacity.About60%ofsMSCsexpressedvimentinandthemajoritiesofthesecellsexpressedfibronectin.Theycoulddifferentiateintoadipocytes,osteogeniccellsandfibroblast-likecells,theycoulddifferentiateintoneuronswithasimpleprotocol,andalmost50-60%ofthesecellsexpressedneuronspecificenolase(NSE)andneurofilament(NF);andthedifferentiatedneuronsshowedtypicalcomplicatedmorphologyofneurons.Inconclusion,skincontainsstemcellsthatarecapableofmultheycouldbeculturedinvitroforlongtimeandcouldmaintaintheircharacteristicsofstemcells,andtheymayrepresentanalternativeautologousstemcellsourceforCNScelltransplantation.Keywords　Skin　　Mesenchymalstemcell　　Neuron1　前　言间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)最早是从骨髓分离出的成体干细胞,在体外可以扩增,在一定的条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞和神经细胞[1,2]。对于骨髓来源的间充质干细胞目前研究较为广泛,但其它组织来源的间充质干细胞的研究较少。最近的研究表明,人体的骨骼肌、皮肤和脂肪组织中也存在间*国家自然科学基金资助项目()和国家自然科学基金重点项目()通位广东省潮州市中神经外科,充质干细胞,也具有向多种方向分化的能力[3,4]。脂[5]肪组织来源的干细胞可以表达神经元细胞表型,皮肤组织中也存在间充质干细胞,可以向脂肪细胞和成骨细胞分化[6],但向神经细胞的诱导分化研究目前还未见报告,脂肪来源的干细胞可以分化为神经元样细胞,皮肤组织来源的间充质干细胞(Skin-derivedmesenchymalstemcell,sMSCs)也应具有向神经细胞分化的可能性。基于这种设想,我们进行了研究。2　材料和方法2.1　材料第3期　　　　　　　　　　　　　　　　　杨立业等。　皮肤间充质干细胞的体外培养和分化515因子(EGF)为Sigma公司产品;DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、谷氨酰胺、?-巯基乙醇(BME)、N2和B27添加剂均为GIBCO-BRL公司产品;鼠抗波形蛋白单克隆抗体(1∶100,Chemicon);兔抗纤维黏连蛋白多克隆抗体(1∶100,华美公司);鼠抗NSE单克隆抗体和鼠抗神经微丝(NF-M)单克隆抗体(1∶100,AntibodyDiagnostics,CA);鼠抗Ⅱ型胶原单克隆抗体、鼠抗Ⅰ型胶原单克隆抗体和鼠抗肌源性决定因子(MyoD1)单克隆抗体(1∶200,NeoMarkerCA);第二抗体为FITC标记的抗鼠或抗兔的IgG;ABC试剂盒为华美公司产品。C57BL/6小鼠由上海市实验动物中心提供。2.2　细胞培养C57BL/6小鼠腹部和背部脱毛后(鼠龄为3d到1个月)断头处死,70%医用酒精消毒,剪取腹部和背部的皮肤组织,PBS洗3次,无菌条件下将组织剪成1mm的小组织块,D-Hanks缓冲液冲洗3次,0.1%的胰蛋白酶37℃消化40min,加入含有10%FBS的培养基终止消化,离心弃上清,D-Hanks缓冲液洗2次,离心,沉淀中加入含有10%FBS的培养基,用吸管反复吹打(约30～40次)组织块使细胞分离,通过孔径为40?m的筛网过滤,收集的细胞离心弃上清,培养基重悬细胞,种植在培养瓶中培养。原代培养基的成分为DMEM/F12(1∶1)加入2mML-谷氨酰胺,100U/ml的青霉素,100mg/ml的链霉素,20ng/mlEGF,40ng/mlbFGF和B27添加剂。细胞的种植密度约为5000个/cm2,原代培养的细胞形成悬浮细胞球和贴壁生长两种状态,传代时只将悬浮的细胞传代,而贴壁的细胞丢弃,经过两次传代后细胞的形态较均一。以后改为有血清培养基培养,培养基成分为DMEM/10%FBS,不加生长因子,以后细胞贴壁生长,至融合时传代,传代时先用0.25%的胰蛋白酶37℃消化5min,使细胞分离,离心,细胞稀释2～3倍传至培养瓶中培养。2.3　向成骨细胞诱导分化MSCs(6,9代)在向成骨细胞诱导的条件培养基中可以向成骨细胞分化,成骨的诱导培养基为DMEM/10%FBS,培养基中加入0.1?mol地塞米松、50?mol抗坏血酸、10mmol?-甘油磷酸钠。诱导分化2周,细胞固定进行碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原单克隆抗体免疫细胞化学检查。2.4　向神经元样细胞诱导分化)3达到50%～70%的融合时,加入预诱导的培养基,既DMEM/10%FBS/1mmolBME,24h后,吸去培养基,PBS洗2次,换成DMEM/1mmolBME,处理1～5h,吸去培养基,换成N2培养基/20ngbFGF,N2培养基的组成为DMEM/F12(DMEM∶F12为1∶1)和N2添加剂。对照组中的细胞培养和预诱导的条件与实验组相同,仅在用BME诱导分化的步骤改为DMEM培养基,无BME,细胞的后期处理与实验组相同。2.5　免疫细胞化学检查种植在培养皿上的MSCs和诱导分化后的细胞直接进行免疫细胞化学检查,免疫荧光染色方法见文献[7]。ABC染色按说明书进行,3,3二氨基联苯胺显色。每次实验同时设立阴性对照,每种标志物阳性细胞的计数在显微镜下进行,一般每个视野可计数50～80个细胞,每种标志物计数500～800个细胞,至少计数10个视野,实验至少重复3次。3　结　果3.1　sMSCs培养和鉴定原代分离培养的细胞大部分为小圆形细胞,培养24h后可见少量的细胞存活,大部分细胞死亡。培养4～7d培养皿中出现悬浮生长的细胞球(图1),少量的细胞贴壁生长。原代培养8～10d将悬浮培养的细胞分离成小的细胞球或单细胞,传至新的培养皿中培养,经4～5d的培养后,又形成新的细胞球,部分细胞贴壁。再次分散细胞传至新的培养皿中培养,此时将培养基换成DMEM/10%FBS,悬浮生长的细胞贴壁,伸出突起,细胞的形态发生变化,表现为胞体增大,长度增加。细胞的分裂速度也明显加快,2～3d就可增殖3倍以上,细胞生长趋于融合时传代,0.25%胰蛋白酶37℃消化5min,吸管吹打将贴壁的细胞与培养皿底面分离,离心,加入新的培养基DMEM/10%FBS继续培养,细胞可以持续分裂增殖,体外培养达13代以上,细胞的分裂速度没有明显减慢,传代稳定增殖的细胞我们称之为sMSCs。稳定培养和传代的细胞分离成单细胞悬液,种植在培养皿中,加入DMEM/10%FBS培养基培养12h后行免疫细胞化学检查,大部分细胞表达纤维黏连蛋白,阳性细胞均为成纤维细胞样细胞;60%±4.5%的细胞表达中胚层来源细胞的标志物波形蛋白。sMSCs免疫细胞化学检查无Ⅱ型胶原和MyoD516生物医学工程学杂志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第22卷3.2　向成骨细胞诱导分化9代)在向成骨细胞诱导的条件培养sMSCs(6、基中诱导分化两周,约有50%的细胞碱性磷酸酶阳性表达,碱性磷酸酶是成骨细胞的标志物。免疫细胞化学检查发现分化的细胞有60%表达Ⅰ型胶原,证明sMSCs可以表达成骨细胞表型。3.3　sMSCs分化为脂肪细胞sMSCs种植在DMEM/2%FBS的培养基中,细胞停止增殖,开始随机分化,4～10d在培养皿中出现含有脂滴的细胞,随着时间的延长,脂滴渐渐增大、融合,最终将胞体完全遮盖。随机分化的脂肪细胞所占的比例为3%～6%,细胞中出现脂滴是脂肪细胞的特征,因此sMSCs分化的细胞中有脂肪细胞。3.4　神经元样细胞的诱导传代培养的细胞(6,9代)长至50%～70%融合时,加入预诱导的培养基,既DMEM/10%FBS/1mmolBME,24h后,吸去培养基,D-hanks洗2次,换成DMEM/1mmolBME,处理1～5h,一部分细胞的形态在1～4h内就发生巨大的变化,首先细胞质以细胞核为中心收缩,细胞体积变小,形成双极或多极的细胞体,周围的胞质收缩形成细胞的突起,部分细胞对诱导无反应(图2、图3)。诱导结束后将诱导的培养基吸去,换成N2培养基/20ng/mlbFGF的培养基继续培养,可维持分化的神经元样细胞长期存活,细胞的突起可进一步伸长形成典型的神经元状态。诱导分化后10～14d进行免疫细胞化学检查,分化的神经元样细胞表达NSE(见图4)和NF-M(见图5),而无反应的细胞不表达NSE和NF-M。在适合的条件下,有50%～60%的sMSCs分化为神经元,而对照组中无神经元样细胞产生,证明了BME对sMSCs的分化作用。4　讨　论骨髓来源MSCs的研究较多,对于其它组织来源的MSCs的研究尚在起步阶段,此方面研究的难点是目前缺乏对这些组织来源的干细胞进行鉴定的标志物,分离培养的方法也没有建立起来。国内史春梦等采用含有血清的培养基对新生大鼠真皮的MSCs的培养进行了尝试,分离的细胞可以在体外长期增殖,能够向成骨细胞和软骨细胞分化。Toma等[8]采用无血清培养基对小鼠和人类的皮肤的前体[6]图1　原代培养形成的细胞球(相差显微镜,×200)Fig1　Primaryculturedcellspheresinsuspension(phasemicroscopy,×200)图2　BME诱导分化前sMSCs(相差显微镜,×100)Fig2　MorphologyofsMSCsbeforeinducationbyBME(×100)图3　诱导分化90min细胞的形态变化(相差显微镜,×100)Fig3　MorphologicalchangeofsMSCsat90minafterinductionby图4　sMSCs分化为神经元样细胞(×100)Fig4　Neuron-likecellsdifferentiationfromsMSCs(×100)第3期　　　　　　　　　　　　　　　　　杨立业等。　皮肤间充质干细胞的体外培养和分化517骨细胞可以做为组织工程骨的种子细胞,在矫形外科的研究和治疗中将获得广泛的应用,分化的脂肪细胞也可以应用到整形治疗上。在条件培养基的诱导下,sMSCs可能也具备向软骨细胞分化的能力。sMSCs能在体外分化为神经元,对于临床的细胞治疗有一定的应用意义。细胞替代疗法在中枢神经系统已经获得一定的疗效,虽然这种方法的治疗效果是肯定的,但也存在一定的问题。目前应用的是人类的胚胎组织进行移植,将来也可应用胚胎来源的图5　sMSCs分化的细胞表达NF-M(×100)Fig5　NF-Mexpressionindifferentiatingneurons(×100)[9]干细胞进行移植,但这两种方案都存在伦理问题的争议,而且应用胚胎组织移植属于异体移植,对于神经系统的病变移植后就要长期应用免疫抑制剂。sMSCs可以在体外分化为神经细胞,因此对治疗中枢神经系统疾病有潜在的应用价值,与其它的干细胞相比有显著的优越性:sMSCs容易获得;在体外增殖速度快;能够进行自体移植,可以克服免疫障碍。如果在体外证实这种细胞有功能,能分泌神经递质,将来就可进行动物实验,作为一种潜在的自体神经移植的细胞来源。参12细胞进行培养,细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞,这种细胞在含有血清的培养基中培养也可以增殖。我们结合两者的研究方法,先采用无血清培养基培养分离出细胞,经过2次传代,再改用有血清的培养基培养,经过多次传代以后(5次以上),这种皮肤来源的MSCs随机分化的细胞无神经细胞,但在BME的诱导条件下,sMSCs可以分化为神经元样细胞,不仅具有典型的神经元形态,而且表达神经元的标志物NSE和NF-M,至于这种细胞能否分泌神经递质,移植到体内能否发挥功能,目前正在研究之中。实验中尝试进行sMSCs的克隆实验,但没有成功。因此,目前还不能确定sMSCs是否含有真正意义上的干细胞,即单个的细胞具备向神经元、脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。虽然sMSCs有向多种细胞分化的潜能,这表明皮肤组织中可能存在干细胞,但这只是可能并不是结论。这种多分化的能力也可能是由于:(1)皮肤组织中多种分化潜能限定的前体细胞的存在;(2)其它组织来源的干细胞(例如血管周细胞,周围血中的MSCs);(3)或是以上两种细胞的混合物。理论上,皮肤中分离培养的MSCs是一种混合的细胞成分,可能包括干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、前脂肪细胞和分化潜能确定的其它前体细胞。在体外长期培养后,当中的一种或几种细胞获得生长优势,在含血清的培养基中培养、多次传代后,细胞的性质可能趋于均一,如果获得有关这种细胞生长的有关信息,就可以通过培养基的选择来获得成分较为均一的干细胞,但目前这方面的研究可供参考的信息极少,我们的报告也仅是初步结果。sMSCs向多种方向分化的研究目前还在起始阶段,它的多能性还需进一步的证实,我们的研究资考文献3456789DeansRJ,MoseleyAB.Mesenchymalstemcells:biologyandpotentialclinicaluses.ExpHeamatol,)∶875YangLY,LiuXM,HuiGZ,etal.Salviamiltiorrhizainducebonemarrowstromalcellsintoneurons.ChinJNeurosurgDisRes,)∶29[杨立业,刘相名,惠国桢.丹参诱导骨髓间充质细胞向神经元分化.中华神经外科疾病研究杂志,)∶29]YoungHE,SteeleTA,BrayRA,etal.Humanreservepluripotentmesenchymalstemcellsarepresentintheconnectivetissuesofskeletalmuscleanddermisderivedfromfetal,adult,andgeriatricdonors.AnatRec,)∶51ZukPA,ZhuM,MizunoH,etal.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.TissueEngineering,)∶211YangLY,LiuXM,SunB,etal.Experimentalstudyonstromalcellsderivedfromadiposetissueandexpressingneuronalphenotypes.ChinJNeuromedicine,)∶45[杨立业,刘相名,孙　兵等.脂肪源性基质细胞表达神经元表型的实验研究.中华神经医学杂志,)∶45]ShiCM,ChengTM.Longtermcultureofdermis-derivedmultipotentstemcellsandtheeffectsofcollagenspongeontheirgrowthinvitro.JBiomedEng,)∶660[史春梦,程天民.大鼠真皮间充质干细胞的体外长期培养及胶原海绵对其生长的影响.生物医学工程学杂志,)∶660]YangLY,LiuXM,HuiGZ,etal.Thelong-termcultureandpassagingofhumanneuralstemcells.ChinJNeurosurg,)∶286[杨立业,刘相名,惠国桢等.人类神经干细胞的长期培养和传代.中华神经外科杂志,)∶286]TomaJG,AkhavanM,FernandesKJ,etal.Isolationofmultipotentadultstemcellsfromthedermisofmammalianskin.NatureCellBiology,)∶778YangLY,HuiGZ.CelltherapyforParkinson'sdisease.ChinJNeurosurg,)∶63[杨立业,惠国桢.细胞移植治疗帕金森病.中华神经外科杂志,)∶63](收稿:　　修回:)
【摘要】目的：建立大鼠真皮间充质干细胞的分离培养扩增的方法。方法：用0.25%的胰蛋白酶消化分离表皮与真皮，然后0.1%I型胶原酶消化获得单细胞悬液，离心后去上清加入适量L-DMEM完全培养基，放入24孔板，置37 ℃，5% CO2培养箱培养。结果：培养3天后出现少量贴壁细胞，呈长梭形，10天后基本长满单层。细胞传代后增殖速度明显加快。结论：用酶消化法能分离得到真皮间充质干细胞。【关键词】真皮；间充质干细胞；大鼠；培养文章编号：（8-03 中图分类号：R37 文献标识码：A皮肤是脊椎动物身体上最大的器官，它具有许多功能，包括体温调节，传导触觉，保护身体免受外界的侵袭和伤害。皮肤主要有两层，表皮和真皮。表皮是由角化细胞组成的多层鳞状上皮，真皮由乳突层和网状层两层[1]。真皮不能再生，缺损后由纤维组织来修复，这就会失去皮肤的许多功能，影响个体生活质量。皮肤组织工程的研究为此类患者的治疗提供了希望。皮肤组织工程有3个重要的因素：种子细胞，支架材料，以及两者的结合。国内外已经有不少学者对皮肤组织工程的种子细胞进行了研究。研究较多的主要为表皮干细胞和骨髓间充质干细胞。自2000年，加拿大研究者Toma等[2]从幼年及成年大鼠皮肤中分离出真皮干细胞，这种细胞分裂增殖能力强，具有多分化潜能，是一种新发现的来源于真皮的多能干细胞，就掀起了对DMSCs的研究热潮。近来，国内外学者对DMSCs分离、纯化、体外扩增和冻存的研究进行了不断的探索。本研究应用酶消化法，从大鼠真皮中分离出DMSCs并进行纯化增殖，以及观察真皮间充质干细胞（DMSCs）的生长情况，并对DMSC的冻存条件进行研究，为进一步的实验研究打下基础。1 材料与方法1.1 主要试剂及仪器：SD大鼠购自浙江省实验动物中心，L-DMEM 为Gibco产品，胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），胰蛋白酶为Sigma产品，二甲基亚砜(DMSO)由江苏鸿声化工厂生产的分析纯，24孔塑料培养板为Falcon产品，25 cm2、75 cm2塑料培养瓶为Orange产品。1.2 大鼠DMSCs提取：（1）取出生1天内的SD大鼠幼鼠1只，引颈处死后，浸入事先配好的75%酒精中消毒3分钟；（2）将幼鼠从酒精中取出，放入大平皿中，用眼科剪和镊子将幼鼠背部皮肤小心剪下，用PBS漂洗，剔除脂肪组织后，将整块皮片面朝下放入预先加了适量0.25%胰蛋白酶的小平皿中，浸没为宜，放37 ℃培养箱，消化4 h。（3）4h后取出平皿，将皮片取出放入干的平皿中，小心将表皮与真皮剥离。（4）将真皮剪成碎末状，加入0.1%I型胶原酶适量，4℃消化过夜。（5）将消化好的组织加入L-DMEM培养基后离心1000 r/m×5 min，弃上清，加适量的培养基混匀后吸入24孔培养板，每孔2 ml，置37 ℃，5% CO2培养箱培养24小时后换液，以后每周换液2次。3天后出现细胞克隆，10天后，细胞基本长满单层，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化约4 min，得到原代DMSCs悬液，再以1×104 cells/cm2传代培养。传代细胞以75 cm2、25 cm2塑料培养瓶培养。并按此方法反复传代增殖，每日用倒置显微镜观察。换液过程中弃除悬浮生长的杂细胞，传代时严格控制酶的量和消化时间。1.3 大鼠DMSCs的生长曲线测定：取生长良好的第二、四、八代DMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化，均以1×104 cells／m1接种于24孔板，每天各取2孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续10d。以培养时间为横轴（t/d），细胞数为纵轴，绘制生长曲线。1.4 大鼠DMSCs的冻存及复苏：将生长旺盛并已基本长满瓶底的第三代细胞消化，用1 ml的L-DMEM完全培养基 （含10%牛血清）将细胞冲洗下来，加入1 ml二甲基亚砜（DMSO）与牛血清（FBS）的混合液（DMSO∶FBS为1∶3），混匀后加入冻存管中，细胞的终浓度为2×106 cells/ml，放入厚壁塑料泡沫盒中，密封，置-60℃冰箱过夜，再放入液氮罐保存。6个月后，将冻存管从液氮罐中取出，立即放入37 ℃温水中，并轻轻摇动使其快速融化，在无菌条件下将液体移入离心管中加4 ml L-DMEM培养基混匀后离心，1000 r/min离心5 min，取出，弃上清，加入少量培养基将细胞团吹散后移入培养瓶，加适量的培养基，5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养。观察其生长增殖情况。2 结果2．1 大鼠DMSCs分离与培养：经过酶消化后的真皮组织呈现白色，将消化后的消化液及组织离心后，弃上清，加入适量培养基后吹打，把细胞悬液及组织直接接种培养24h后，观察发现孔内有大量的小圆形的细胞，3天后出现细胞克隆（见图1），10天后，细胞基本长满单层（见图2）。细胞贴壁生长，呈长梭形，细胞传代后增殖速度较原代细胞快，约5天长满培养瓶底。多次传代的DMSCs融合生长时，细胞呈成纤维细胞样（见图3），传代11代，细胞仍生长旺盛，形态无明显变化。2.2 大鼠DMSCs的生长曲线测定：第二、四、八代细胞生长曲线（见图4）。从生长曲线可见，大鼠DMSCs具旺盛的增殖能力，所测各代生长曲线相似，均呈“∫”形，但随着代数的增加，细胞生长有所减慢。细胞培养1d时，细胞稍有减少，为细胞的适应期。4d后细胞数迅速增加，为对数生长期。8d时达到顶点进入平台期，细胞保持动态平衡状态。2.3 大鼠DMSCs的冻存及复苏：大鼠DMSCs经6个月冻存后复苏培养，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形。液氮保存存活率为80%，细胞生长增殖旺盛。提示大鼠DMSCs可用液氮保存，且不影响细胞的活力。这对进行DMSCs研究提供了方便的细胞来源，并对择期进行DMSCs的移植有重大的意义。3 讨论目前研究者对骨髓来源的间充质干细胞研究比较多，对于真皮等其他来源的间充质干细胞的研究不多，都处于初级阶段，对于它们的分离纯化培养方法也只是初步探索。从真皮中分离多能干细胞主要有两种方法，酶消化法[3]和一种类似神经干细胞培养方法[4~7]，这两种方法分离的细胞主要区别是前者主要表达间充质来源的特征，后者主要表达神经前体细胞特征。本实验利用了DMSCs具有贴壁生长的特性，采用酶消化法来分离获得真皮间充质干细胞。DMSCs原代生长是以克隆状向周边散发生长，传代后就不再出现该克隆状生长方式。DMSCs能在短时间内贴壁，生长旺盛，可在体外快速大量增殖。目前大鼠DMSCs已经传至12代，该DMSCs仍能保持旺盛的生长和增殖能力。对大鼠DMSCs的生长曲线的研究发现DMSCs大致呈“∫”形生长模式，即经历初期的适应期，然后迅速增殖，为对数增殖期，细胞长满后就进入生长平台期。所测各代DMSCs有相似的生长曲线。第三代的DMSCs经过液氮长期冻存后，复苏培养发现该DMSCs的生长增殖及形态与冻前无差异，这对择期进行DMSCs研究及移植手术具重要意义。对DMSCs的研究主要存在一个分离后如何纯化及鉴定的问题。目前也只有通过不断传代来达到纯化细胞的目的，也没有一个鉴定DMSCs的金标准，只能根据DMSCs本身的特点设计检测方案，检测结果符合DMSCs的特点来证实分离获得的细胞为所需的DMSCs。但DMSCs有其无法替代的优点，如取材方便，体外增殖能力强，可进行自体移植治疗，避免了免疫排斥反应等特点。虽然DMSCs研究尚处于初级阶段，随着对它的不断深入研究，DMSCs作为皮肤组织工程的种子细胞，用于皮肤损伤的治疗将成为一种新的治疗选择。参考文献：[1] Stocum，DL.Regenerative biology and medicine[M].科学出版社，2007.21.[2] Toma JG，Akhavan M，Fernandes KJ，et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin[J].Nat Cell Biol，8.[3] 史春梦，程天民.大鼠真皮多能间充质干细胞的分离培养[J]. 第三军医大学学报，）：1068.[4] 崔苏萍，李 悦，谢 安，等. 大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性[J].中华实验外科杂志，）：1006.[5] 柯昌能，利天增，徐盈斌，等．老年人皮肤多能干细胞的分离及有效扩增[J]．中华实验外科杂志，36．[6] Femandes K3L，McKenzie IA，Mill P，et al．A dermal niche for multi-potent adult skin-derived precursor cells[J]．Nat Cell Biol，82．[7] Toma JG．Isolation of skin-derived precursors (SKPs)and differentia-tion and enrichment of their Schwann cell progeny[J]．Nat Protoc，03．收稿日期：
中国组织工程研究(原《中国组织工程研究与临床康复》)ZHONGGUOZUZHIGONGCHENGYANJIUHttp:／／www．CRTER．orgHttp:／／www．zglckf．com本期专题目次本刊特稿1周刊1997年1月创刊(总第521期)第16卷第1期日出版骨髓间充质干细胞的培养基国内外大量实验证明，通过长期培养后获得的骨髓间充质干细胞具有非常广泛的分化潜能，形成的终末组织包括脑、视网膜、肝、肠、脾、骨髓、血液、皮肤、软骨等。一方面说明了骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化的能力，另一方面说明在适当的培养环境下，骨髓间充质干细胞能诱导向多种细胞分化。培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，因此无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁物质的组合置换培养基中的成分，在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清的不均一性。尽管无血清培养基是有化学限定性的，但在培养过程中它仍有变动，培养起始时可能有些物质缺乏，而后细胞的产物可能积累，从而使培养基的成分改变，这其实是有另一方面的好处，即条件培养基的形成。条件培养基是已经培养过某种细胞的培养液(内含该细胞分泌的活性物质，包括少量生长因子)与一定比例新鲜培养液混合的培养液，其促分化作用与分泌的细胞因子和生长因子密切相关。目前关于间充质干细胞培养基的专门研究并不多见，本期专题介绍的10篇文章，主要观察无血清培养基及条件培养基等培养条件对骨髓间充质干细胞扩增与分化的影响，可供同道研究者借鉴。更多内容详见本期102页。间充质干细胞及其临床应用中的几个问题☆郭子宽188《中国组织工程研究》杂志2012年投稿须知王莉莎，张楠，王蕾，赵萌研究与报告骨髓来源干细胞11携带双报告基因真核表达载体pHSV1-TK-IRES2-EGFP在小鼠骨髓间充质干细胞内的表达**★吴立川，杨昆，刘永哲，陈鹏，徐文贵175-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性**★史贵秀，孙丽华，张跃新22骨髓间充质干细胞条件培养液对H2O2损伤大鼠心肌细胞的保护★刘新宾，张红超，郭子宽27全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性****☆张颢，张斌，程梅，陶艳玲，扈江伟，徐曼，陈虎31人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化**☆撒亚莲，华映坤，高建梅，彭正国，董虹，严新民胚胎来源干细胞39CD271磁珠体外诱导人胚胎干细胞分化为成骨细胞的可行性*★江虹虹，张金丽，李付贵，王涛35胎源性非黏附骨髓基质细胞的特性*★肖龙艳，傅晋翔，张学光，陈秋，张宏，王盼君，孙谕，王明元，古彦铮脂肪来源干细胞51小鼠脂肪源干细胞分离培养和成骨诱导前后造血调控因子的表达**★郝丹，段显琳，毕晓娟，常相萍，马艳，曲建华，袁海龙，江明47小鼠脂肪干细胞的免疫原性及移植安全性*★梁爽，袁桂峰，钟毓娟，刘菁，陈森州坚持“创新，科学，严谨，规范”的刊社精神，坚持创办“国际化、精品化、数字化”及学科专家喜欢阅读的专业期刊。高质量：每篇稿件均需小同行专家审稿1个月；高效率：优秀稿件3-4个月、一般稿件6个月出版。多元化：提供向SCI收录杂志投稿的选刊建议和地道的语言翻译和润色服务等专业项目，详见www.crter.org。ChineseJournalofTissueEngineeringResearch2012www.CRTER.org Zhang M, et al. Human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for extensive…doi:10.3969/j.issn.12.01.021中图分类号: R394.2 文献标识码: B文章编号: 12)01-00099-04利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。 张明，于乐. 脐血单个核细胞移植治疗老年急性广泛前壁心肌梗死后心源性休克合并重度心力衰竭1例[J].中国组织工程研究，):99-102. [http://www.crter.org ] (Edited by Yang Y/Wang L)来自本文课题的更多信息--伦理批准：根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》知情同意书。 [20]，治疗前将治疗方案和风险告知对方，并签署本文创新点：干细胞移植可以改善急性心肌梗死后心脏功能，是目前冠心 病研究领域的一大热点。而合适的移植 细胞类型一直是研究者探讨的主要问题 作者贡献：张明和于乐对患者进行治疗与随访，并完成对病例资料的收集和整理，并撰写论文，均对文章负责。之一，近期人脐血干细胞作为一类移植细胞日益引起关注，但相关研究多为基 础研究。目前尚未检索到关于人脐血单 个核细胞移植治疗心肌梗死患者的临床 研究。本科室于近期为1例老年急性广 泛前壁心肌梗死后心源性休克合并重度 心力衰竭的患者行脐血单个核细胞移植 治疗获得成功。本例患者为急性广泛前 壁心肌梗死所致的心力衰竭，虽急诊行 冠状动脉内支架置置入治疗，并接受系 统内科药物治疗，心力衰竭症状仍反复 发作，文章采用了人脐血单个核细胞移 植治疗后患者心力衰竭症状明显缓解。 文章采用冠脉微导管，直接注入稀释的 干细胞悬液，不需要增加缺血时间、操 作简便、手术器械费用相对低，也达到了相同的效果，减少了不良反应。102 P.O. Box 1200, Shenyang 110004
兔的骨髓间充质干细胞提取1.1 兔骨髓MSC的分离 用3%戊巴比妥钠按1 mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5 ml注射器，内含3000 U/ml的肝素0.1 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心1800R 5 min；弃去上清液，沉淀用Ham f12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保留10 min，取出再离心180×g，5 min；弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细胞量达106～107后，即可进行原代培养接种用。1.2 兔骨髓MSC的原代培养 将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于6孔培养板内，加入Ham f-12培养液，于37℃，10% CO2条件下培养；于接种5 d后进行第1次换液，以后隔日换液。每天随机抽取3只实验动物的MSC作细胞生长动力学分析，各取此三者的1个培养孔用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并作贴壁细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。将此3个实验动物MSC每天的细胞计数取平均值，作原代细胞培养的生长曲线分析。1.3 兔骨髓MSC的传代培养 原代培养一旦铺满整个培养孔的表面，即可用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），然后按1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面。再重复以上操作，用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并按1∶3的比例进行下一代传代接种培养，并记为P2，余类推。将随机抽取作原代培养细胞生长动力学分析的3个实验动物MSC的P1代分为两组，一组连同其余样本的第1代一并留作后续实验用，另一组则用作传代培养的细胞动力学分析。传代培养的接种密度严格地控制于与原代培养接种密度相同的水平以便于对照。每天各取1个实验动物MSC的1个培养孔用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并作贴壁细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底面。将此3只实验动物MSC每天的细胞计数取均值，作传代细胞培养的生长曲线分析。1.4 兔骨髓MSC的自我更新能力分析 将随机抽取作原代、传代培养细胞生长动力学分析的3只实验动物MSC由P1代开始，逐代进行传代培养，直至培养细胞出现衰老征象，停止传代培养。以细胞群体倍增值（population doublings, PDs）作为分析兔骨髓MSC的自我更新能力的指标，每代细胞培养的PDs值按以下公式计算［5］：PDs=lg（培养后细胞计数/培养前细胞计数）/lg2将各代PDs值累加即得最终的累积细胞群体倍增值（cumulative population doublings, CPDs）。兔的骨髓间充质干细胞提取1.3.1 骨髓 MSCs 的分离纯化与培养 兔仰卧固定于兔台上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）润洗过的 10 mL 无菌注射器，抽取骨髓 4 mL，缓慢叠于等量 Ficoll 淋巴细胞分离液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度离心 20 min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，PBS 洗涤，2 000 r/min 离心 5 min，反复 2 次，弃上清，悬浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基（青霉素 100 U/mL，链霉素 100 U/mL），轻轻吹打均匀，接种到 25 cm2 培养瓶，置 37℃，5% CO2 及饱和湿度培养箱中培养。4~6 d 首次换液，以后每 3 d 或 4 d 换液 1 次，14~21 d 细胞生长融合达 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例传代培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态。1.3.2 骨髓 MSC 贴壁率检测 取对数生长期细胞，0.125% 胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为 1×105/mL，接种于 24 孔培养板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培养板，吸去 4 孔培养液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未贴壁细胞，0.125% 胰蛋白酶消化后离心收集细胞，进行细胞计数，共观察 12 h，按以下公式逐个计算每个时相点的贴壁率：贴壁率=（贴壁细胞总数/接种细胞总数）×100%。1.3.3 骨髓 MSCs 生长曲线的测定 取第 3 代生长良好的细胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制备细胞悬液，以每孔 103~104 个细胞于不同时相分别接种于 8 块 96 孔板中的 8 孔，每孔体积 200 L，置于 37℃、5% CO2 及饱和湿度培养箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 继续孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亚砜，振荡 10 min 后选择 490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值 A（OD）为纵轴绘制细胞生长曲线。1.3.4
骨髓 MSCs 表面标记测定 取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 离心 5 min，PBS 洗涤 2 次，调节细胞浓度为 1×106/mL，分为 4 份，分别滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作为阴性对照），室温反应 30 min 后，PBS 洗涤 2 次，滴加 FITC 标记的抗兔 IgG，避光反应 15 min 后，经流式细胞仪检测细胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 阳性细胞的表达。大鼠的骨髓间充质干细胞提取第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。心得体会：①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。④以上的细胞生长液5ml具体配制为DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计)低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml胎牛血清（HYCLONE公司的，500ml一瓶，大约3600元）浓度为10%，5ml细胞生长液中大约需要0.5mlL-VC(自己配) 浓度为50ug／ml，5ml细胞生长液中大约需要 25ul青链霉素(HYCLONE公司的，100ml一瓶，大约190元) 浓度为10万U／ml，5ml细胞生长液中大约需要5ul至于NaHCO3，一般是加的，浓度为7.5%，使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间，但是我不加，因为在细胞生长中会大量产生含N的分泌物，最好先拿试纸测一下。再者在5ml细胞生长液中L-VC和青链霉素太少，可以忽略不计，但只是在配小剂量的范围内，大剂量的话就要酌情改变。第三步：细胞计数。①从装有5ml细胞悬液的无菌容器中吸取20ul细胞悬液滴到一个培养皿。②用0.2ml的枪头吸取170ul的生理盐水，滴到20ul细胞悬液上③抽取10ul的4%台盼蓝液滴到盐水和细胞悬液的混合液体中，用枪头在这三者的混合液中抽吸几次，充分搅匀。④抽取混合液中17ul点到放有载玻片的一个计数池中，刚好填满。开始计数并算出细胞数数量及浓度。并按浓度分装到培养皿中。心得体会：①计数的这个培养皿可以是污染的，只要看的干净就行。②混合的液体为20+170+10=200ul。其中细胞悬液的浓度为10%，也就是说细胞悬液被稀释了10倍（也可以稀释至20倍，稀释的越多，更容易数清楚，但误差也随之增大）。 ③计数公式 : 细胞数×104／ml=（四个大方格细胞数÷4）×稀释倍数×104／ml 比如，你数了四个大方格中有拒染细胞400个，那么根据公式算出（400÷4）×10×104／ml = 1×107／ml，现在有5ml的细胞悬液，也就是有1×107／ml×5= 5×107 个细胞。当然这么多细胞，不全是我们需要的骨髓间充质干细胞，还有很多其他像红细胞之类的，所以这就要设计到以后的换液纯化了。④按6-8×l06/ml的浓度接种，故 5×107 ÷ 6-8×l06/ml = 8.3 – 6.25 ml 。因为一般60mm的培养皿承载最多5ml的液体，故将5ml的细胞悬液再加入3ml的细胞生长液稀释成8ml的细胞悬液，各取4ml分装至两个60mm的培养皿。此刻每个培养皿的细胞浓度为：（5×107）÷8 =6.25×l06/ml,正好在要求的接种密度6-8×l06/ml范围内。⑤将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。第四步，48h后半量更换细胞生长液。以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培养皿约80%时可进行传代，大约周期为7天。
－１２５６?中国实验血液学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ２０１３；２１（５）：１２５６—１２６０文章编号（ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ）：１００９—２１３７（２０１３）０５—１２５６—０５?论著?无血清培养脐带间充质干细胞的研究周平，李丹，陈广华，＋王易苏州大学附属儿童医院血液肿瘤科，江苏苏州２１５００３；苏州大学附属第一医院，江苏省血液研究所，卫生部血栓与止血重点实验室，江苏苏州２１５００２摘要本研究观察无血清培养液培养的人脐带间充质干细胞（ＵＣ—ＭＳＣ），并比较与含１０％胎牛血清培养液培养的人脐带间充质干细胞的异同。采集正常足月剖宫产胎儿脐带，用ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ—ＸＦ无血清培养液或含１０％胎牛血清培养液培养。观察不同培养液培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明，采用无血清ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ＠－ｘＦ培养液培养的ＭＳＣ平均传代倍增６．５７±０．７倍，含血清培养液培养的ＭＳＣ平均传代倍增４，５９±０．４５倍（Ｐ＜０．０５）；两种培养液培养的ＭＳＣ均表达ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤｌ０５抗原，不表达ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＨＬＡ—ＤＲ及ＣＤ３４等抗原，表达程度无明显统计学差异；无血清培养液培养的ＭＳＣ（６５±５．２）％均为Ｇ。／Ｇ．期细胞，含血清培养液培养的ＭＳＣ（６２±３．１）％为Ｇ。／Ｇｌ期细胞（Ｐ＞０．０５）；两种培养液培养的人脐带ＭＳＣ均可向成脂细胞、成骨细胞分化；无血清培养液培养的脐带ＭＳＣ按ｌ１００００、２００００、５０００、０００个细肜孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的每分钟闪烁值（ＣＰＭ）分别为（６．４３±０．４７）×１０４、（４．３０±０．３８）×１０４、（１．９７±０．１３）×１０４和（０．２４±０．０３）ｘ１０４，含血清培养液培养的ＭＳＣ与不同密度的混合淋巴细胞共培养的ＣＰＭ值分别为（７．８５±０．０７）×１０４、（５．６４±０．１２）×１０４、（３．０９±０．１８）×１０４和（１．７３±ｏ．０５）×１０４。结论：无血清培养液培养的细胞均为ＭＳＣ，有传代增殖潜能，传代可达临床治疗ＭＳＣ细胞量，并可避免异种蛋白致敏。关键词中图分类号脐带间充质干细胞；无血清培养液；ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ—ＸＦ无血清培养液；细胞治疗Ｒ３２９．２８文献标识码Ａｄｏｉ：１０．７５３４／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—２１３７．２０１３．０５．０３４Ｓｅｒｕｍ．ｆｒｅｅＣｕｌｔｕｒｅｏｆＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓＺＨＯＵＰｉｎｇ．ＵＤａｎ．ＣＨＥＮＧｕａｎｇ—Ｈｕａ，ＷＡＮＧＹｉ＋ａｎｄＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＳｏｏｃｈｏｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＣｈｉｌｄｒｅｎＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５００３，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ＋ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇＡｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧＹｉ．ＳｅｎｉｏｒＰｈｙｓｉｃｉａｎ．Ｔｅｌ：（０５１２）６７７８８４０９．Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｄｏｃｔｏｒ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎＴＩｌｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｐｕｒｐｏｓｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＵＣ—ＭＳＣ）ｗｉｔｈＡｂｓｔｒａｃｔｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ．ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｉｔｗｉｔｈｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）．Ｔｈｅｎｏｒｍａｌｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｓｗｅｒｅａｃｑｕｉｒｅｄｄｕｒｉｎｇｃｅｓａｒｅａｎｓｅｃｔｉｏｎ．ａｎｄｔｈｅｎｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＭｅｓｅｎＣｕｌｔ—ＸＦｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）．Ｔｈｅｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｍｏｎｐｈｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｃｅｌｌｏｒｍｅｄｉｕｍｄｉｆ＆ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍｉｘｅｄｃｙｃｌｅ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅａｃｔｉｏｎｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｒｏｕｇｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｕｍｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＭＳＣｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅＭｅｓｅｎＣｕｌｔ四一ＸＦｍｅｄｉｕｍｃｏｕｌｄｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｙｆｏｒａｖｅｒａｇｅｏｆ６．５７±０．７ｔｉｍｅｓ．ａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍｍｅｄｉｕｍ—ｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣｃｏｕｌｄｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｙｆｏｒａｖｅｒａｇｅｏｆ４．５９±０．４５ｔｉｍｅｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｗｏｋｉｎｄｓｏｆｍｅｄｉｕｍｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣａ１１ｅｘｐｒｅｓｓｅｄＣＤ４４，ＣＤ９０．ＣＤ７３，ＣＤｌ０５ａｎｔｉｇｅｎ，ｂｕｔｄｉｄｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄＣＤ３１，ＣＤ４５，ＨＬＡ—ＤＲａｎｄＣＤ３４ａｎｔｉｇｅｎ，ａｎｄｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ—ｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣ（６５±５．２％）ｗｅｒｅａｌｌａｔＧ。／Ｇｌｐｈａｓｅ，ａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍ—ｃｏｎｔａｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍ—ｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣ（６２＋３．１％）ｗｅｒｅａｔＧ。／Ｇ１ｐｈａｓｅ（Ｐ＞０．０５）；ｔｈｅ２ｋｉｎｄｓｏｆｍｅｄｉａ—ｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣａｌｌｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｆａｔａｎｄｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｗｈｅｎｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｃｕｌｔｕｒｅｄｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄＭＳＣｗｅｒｅｉｎｎｏｃｕｌａｔｅｄａｔｔｈｅｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆ１０３。５×１０３，１０４，ａｎｄ２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，ｔｈｅｎｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅａｃｔａｎｔａｎｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｃｅｉｌｓ．ｔｈｅＣＰＭｗｅｒｅ（６．４３±０．４７）×１０４，（４．３０±０．３８）ｘ１０４，（１．９７±０．１３）×１０４ａｎｄ（０．２４±０．０３）×１０４．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍｅｄｉｕｍ—ｃｕｌｔｕｒｅｄＭＳＣｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｎｓｉｔｙｏｆｍｉｘｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ．ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇＣＰＭｔｈａｔｗｅｒｅ（７．８５±０．０７）ｘ１０４，（５．６４±０．１２）×１０４，（３．０９±０．１８）×１０４ａｎｄ（１．７３±０．０５１×１０４．Ｉｔｉｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｂｅｅｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅＭＳＣ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｃｏｕｎｔｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｃａｎａｖｏｉｄｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．基金项目：江苏省ｐ．生厅面上项日（Ｈ２０１２１２）；苏州市科技发展计划项目（ＳＳ０７１８）；江苏省临床医学中心血液病学开放课题编号（ＫＦ２００９４３）＋通讯作者：王易，主任医师．电话：０５１２－６７７８８４０９．Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｄｏｃｔｏｒ＠ｙａｈｏｏ．ｃａ２０１２一ｌｌ一０７收稿；２０１２—１２—１２接受万方数据无血清培养脐带间充质干细胞的研究Ｋｅｙｗｏｒｄｓ?１２５７?ｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ：ｓｅｒｕｍｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ；ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ一）（Ｆｓｅｒｔｌｍ—ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ；ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙ问充质干细胞（ｍｅｓｅｎｓｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）是来源于发育早期中胚层的一类非永生的多功能干细胞，它具有一定自我更新和增殖能力，是造血微环境的主要细胞成分。它具有低免疫原特性、多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，可从骨髓、脐带、脐血、胎肝等组织分离培养出来，在造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病、促进造血干细胞植入等具有重要作用。但常规培养问充质干细胞的培养基多含胎牛血清或牛血清白蛋白等潜在致敏异种蛋白，我们拟采用无异种蛋白的无血清培养基培养人脐带问充质干细胞，并对比其与常规培养的人脐带间充质干细胞扩增效率及生物学特性。材料和方法试剂和仪器Ｆｉｃｏｌｌ液，ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ．ＸＦ贴壁基质成分（加拿大Ｓｔｅｍｃｅｌｌ公司产品），ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ＠－ＸＦＭｅｄｉｕｍ无血清无动物成分的培养基，ＴｒｙｐＬＥＥＤＴＡ钠溶液（美国Ｇｉｂｃｏ公司产品），ＰＥ标记的鼠源性ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤｌ０５、ＨＬＡ—ＡＢＣ、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＨＬＡ．ＤＲ及ＣＤ３４单抗（美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司），油红Ｏ染液，ｖｏｎＫｏｓｓａ染液，细胞周期试剂盒（美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司），流式细胞仪ＦＣ一５００（美国Ｃｏｕｌｔｅｒ公司），Ｂ液闪计数仪。细胞培养脐带标本取自ｌｏ例正常足月剖宫产胎儿，均来源于苏州大学附属第一医院产科，经产妇及家属知情同意，并经医院医学伦理委员会批准。产妇年龄２２—２８岁，中位年龄２５岁。收取标本前用生理盐水稀释ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＸＦ贴壁基质至５０ｍｇ／Ｌ，每个Ｔ－７５ｃｍ２培养瓶加入６ｍｌ，包板后于３７０Ｃ、５％ＣＯ：环境的培养箱中静置５—２４ｈ。在达《药品生产质量管理规范》（ＧＭＰ）要求的实验室内取５ｃｍ长的脐带，用ａＭＥＭ冲洗干净后，剪碎脐带为１．５ｃｍ大小的组织块，转移至２５０ｍｌ离心瓶中，再加入０．２５％Ⅳ型胶原酶ｌｏｎｌｌ和含双抗１％（１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００Ｉｘｇ／ｍｌ链霉素）的ｃｘＭＥＭ３０ｍｌ，３７℃水平振荡消化ｌｈ。消化后应用ａＭＥＭ洗涤２遍去除胶原酶。用ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ＠－ＸＦＭｅｄｉｕｍ无血清无动物成分万方数据ＪＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ２０１３；（５）：１２５６—１２６０的培养液重悬消化后的其中５例胎儿脐带制备的脐带小块组织，接种于１个Ｔ－７５ｃｍ２培养瓶，置３７℃、５％ＣＯ，饱和湿度的培养箱中培养。２４ｈ后换液弃去从培养瓶壁爬出的脐带组织残块。之后每３日换１次无血清无动物成分的培养液。当贴壁细胞汇聚度达到８５％一９０％时，吸弃培养液，用２ｍｌＴｒｙｐＬＥＥＤＴＡ钠溶液置于３７℃培养箱消化传代。另５例胎儿脐带制备的脐带小组织块则用含１０％胎牛血清及双抗ｌ％（１００Ｕ／１１１ｌ青霉素、１００“ｇ／ｍｌ链霉素）的ａＭＥＭ完全培养液重悬并培养，０．２５％胰酶ＥＤＴＡ钠溶液消化。免疫表型监测细胞传代培养至第３代时进行免疫表型分析，鉴定所培养细胞为间充质干细胞。用０．２５％ＴｒｙｐＬＥＥＤＴＡ钠溶液或２ｍｌ０．２５％胰酶ＥＤＴＡ钠溶液消化采集细胞，ＰＢＳ洗涤计数重悬后置于ＥＰ管（１．５ｍｌ，含细胞１×１０５个），取细胞悬液２０斗ｌ，加入ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤｌ０５、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＨＬＡ—ＤＲ及ＣＤ３４单抗１０斗ｌ，室温避光１５ｍｉｎ，上流式细胞仪（ＢＤＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ型），用ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析结果。各样本设空白对照，判断各抗原表达情况。细胞周期分析用０．２５％ＴｒｙｐＬＥＥＤＴＡ钠溶液或２ｍｌ０．２５％胰酶ＥＤＴＡ钠溶液消化采集第３代ＭＳＣ细胞５×１０５个，参照ＣｙｃｌｅＴｅｓｔ试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测，应用Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ软件分析结果。诱导分化将第２代细胞按１×１０４个／ｃｍ２细胞密度接种６孔板，继续用无血清培养液或含胎牛血清的完全培养液培养，当达９０％汇聚度时开始换为成脂、成骨诱导分化液。成脂分化液是含１０％胎牛血清、ｌ¨ｍｏＬ／Ｌ地塞米松、０．５ｉ比ｍｏＶＬ异丁基甲基黄嘌呤（ＩＢＭＸ）、６０ｉｘｍｏｌ／Ｌ吲哚美辛、５ｍｇ／Ｌ胰岛素（美国Ｓｉｇｍａ公司产品）的ｃＩ【ＭＥＭ。每３日换新诱导分化液１次，诱导培养２周后采用油红０染色。成骨分化液是含１０％胎牛血清、０．１ｉｘｍｏｌ／Ｌ地塞米松、１０ｍｍｏｌ／Ｌ１３２甘油磷酸二钠、５０ｍｇ／Ｌ抗坏血酸（美国Ｓｉｇｍａ公司产品）的ｔｘＭＥＭ。每３日换新诱导分化液１次，诱导培养１４ｄ后行ｙｏｎＫｏｓｓａ法染色。每个标本各接种一个６孑Ｌ板，取２孔进行成脂?１２５８?中国实验血液学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ分化，２孔进行成骨分化，其余２孔用原培养液培养作为对照。抑制混合淋巴细胞反应将第３代ＭＳＣ接种于９６孔板，接种密度按ｌ５０００、１００００、２００００、０００个细胞／孔分组，加Ｃｏ辐照２０Ｇｙ。采集正常人外周血２５ｍｌ，Ｆｉｃｏｌｌ液分离单个核细胞，用全Ｔ细胞分选试剂盒免疫磁珠分选Ｔ细胞，再采用抗鼠ＣＤ３单克隆抗体检测Ｔ细胞纯度。取１×１０５个Ｔ细胞作为反应细胞，另取１×１０５个Ｔ细胞经６０ｃｏ辐照２０Ｇｙ后作为刺激细胞。该反应细胞和刺激细胞均与以上不同密度的第３代无血清培养基或含胎牛血清的完全培养液培养的ＭＳＣ混合培养。同时设反应细胞和刺激细胞共培养孔作为对照孑Ｌ。３７０ｃ、５％ＣＯ：饱和湿度培养箱中培养３ｄ，培养结束前２４ｈ每孔加［３Ｈ］ＴｄＲ，收获细胞并用Ｂ液闪计数仪测定放射性核素每分钟闪烁计数（ＣＰＭ）。混合淋巴细胞增殖抑制率的计算公式如下：混合淋巴细胞增殖抑制率＝［（对照组ＣＰＭ一实验组ＣＰＭ）／对照组ＣＰＭ］×１００％Ｆｉｇｕｒｅ１．Ｐ３一Ｐ８ＮｕｍｂｅｒｏｆｐａｓｓａｇｅｓＭＳＣｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ．问充质干细胞免疫表型流式细胞仪检测结果显示，两种培养液培养的第３代ＭＳＣ均高表达ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤｌ０５抗原，不表达ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＨＬＡ—ＤＲ及ＣＤ３４抗原，无血清培养液和含血清培养液培养的ＭＳＣ免疫表型无显著差异（Ｐ＞０．０５）。细胞周期流式细胞仪检测结果显示，无血清培养的第３代ＭＳＣ中（６５±５．２）％均为Ｇ。／Ｇ。期细胞，含血清培养液培养的细胞（６２±３．１）％为Ｇ。／Ｇ。期细胞（Ｐ＞０．０５）。统计学处理采用ＳＰＳＳ１６．０软件作统计分析并绘图，实验数据以平均值±标准差（又±ＳＤ）表示，对实验结果分别进行组问独立ｔ检验。分化潜能无血清和含血清培养液培养的第２代贴壁细胞，经过２周向中胚层诱导分化培养后，并经油红Ｏ染色证明细胞内有多个大小不一的脂泡即已分化为脂细胞；经ｖｏｒｌＫｏｓｓａ法染色证明有钙盐沉积即已分化为骨细胞（见图２），两种培养液培养的细胞经诱导分化并染色后在显微镜下观察到的形状相似。Ｔ淋巴细胞增殖抑制分析结果流式细胞仪检测分选后的Ｔ细胞纯度达８５％。反应细胞与刺激细胞共培养对照组ＣＰＭ值为（８．６０±０．２４）×１０４。无血清培养液培养的脐带ＭＳＣ１０００、５０００、１００００、２００００个细胞／孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的ＣＰＭ值分别为（６．４３ｓ０．４７）×１０４、（４．３０±０．３８）Ｘ１０４、（１．９７±结果贴壁细胞形态及传代培养增殖潜能无血清培养液原代培养过程中培养２４ｈ即弃去从培养瓶壁爬出的脐带组织残块后可见贴壁圆形细胞较多，之后每３ｄ换１次无血清无动物成分的培养液，培养４８—７２ｈ可见细胞拉长呈梭形，后逐渐伸出伪足呈纺锤状。３ｄ换液１次，换液培养１０ｄ左右汇聚度可达到８５％。吸弃培养液后，传代培养后的细胞约４ｄ可达８５％左右汇聚度。含血清培养液培养的细胞培养２４ｈ则可见细胞变长，培养７ｄ汇聚度可达８５％，传代培养则３ｄ可达８５％左右汇聚度。取第３代ＭＳＣ５０００００个细胞另接种于一Ｔ－７５ｍ２培养瓶，采用无血清培养液或含血清的完全培养液培养至Ｐ８，每次传代用台盼蓝计数，３—８代无血清培养液培养的细胞平均传代倍增６．５７±０．７倍，用含１０％胎牛血清培养液培养的细胞平均传代倍增４．５９±０．４５倍（Ｐ＜０．０５）（图１）。０．１３）×１０４和（０．２４±０．０３）×１０４，混合淋巴细胞增殖抑制率分别为：（２５．０９±１．７１）％、（５０±０．５７）％、（７７．０±１．１９）％、（９７．１４±０．２８）％。含血清培养液培养的脐带ＭＳＣ２０１０００、５０００、１００００、０００个细胞／孑Ｌ接种密度与反应细胞和刺激细胞万方数据无血清培养脐带问充质干细胞的研究?１２５９?讨论２０世纪后期Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等…证实了骨髓间充质干细胞（ＢＭ．ＭＳＣ）的存在，并创建了体外分离培养扩增骨髓ＭＳＣ的方法。ＢＭ．ＭＳＣ是骨髓中除造血干Ｉ）细胞（ＨＳＣ）之外的另一类具有多向分化潜能的原始细胞，在适宜的培养条件下它可以增殖并被诱导分化为包括骨、软骨、肌肉、脂肪、神经等组织细胞。ＭＳＣ的多向分化潜能和在体外可方便扩增的特点，Ｆｉｇｕｒｅ２．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉａｔｉｏｎａｎｄｏｆＭＳＣｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｓｅｒｕｍ．ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙＳｅｌｕｍ．ｆｒｅｅｂｙｓｅｒｕｉＩ＇１．ｍｅｄｉｕｍ．Ａ：ＭＳＣｉｎｔＯｆａｔ：Ｂ：ｉｎｔＯｍｅｄｉｕｍｄｉｆｆｅｒｅｎ．ｔｉａｔｅｄｍｅｄｉｕｍ使其首先被尝试用于临床治疗旧Ｊ。近年来临床和实验研究表明，ＭＳＣ联合异基因造血干细胞移植可明显加速造血干细胞的植人口Ｊ，并能抑制Ｔ淋巴细胞增殖ＭＪ，可应用于异基因造血干细胞移植后移植ＭＳＣｃｕｌｔｕｒｅｄｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｃ：ＭＳＣｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｓｅｒｕｍｍｅｄｉｕｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｉｎｔｏ物抗宿主反应（ＧＶＨＤ）的预防和治疗∞Ｊ。本研究用脐带组织分离培养的原代ＭＳＣ量较少，必须体外扩增培养方能得到治疗需要的细胞量。ＭＳＣ培养最初主要采用含１０％胎牛血清的ｅｔＭＥＭ或低糖ＤＭＥＭ完全培养液培养扩增，培养后用猪胰腺源性胰酶消化收集细胞，其中牛血清白蛋白和猪胰酶均是明确的过敏原∞。８Ｊ。尽管反复洗涤ＭＳＣ，但其中残留的胎牛血清蛋白含量仍可达７—３０ｍｇ／１０８个细胞∞１。为避免含胎牛血清培养的ＭＳＣ在临床治疗过程中出现异种蛋白致敏，国外曾有研究中心采用人富含血小板血浆替代胎牛血清。研究显示，采用添加冻融人富含血小板血浆的完全培养液培养ＭＳＣ可获得相当的培养扩增效率∽＇１０Ｊ。但血小板ｄ颗粒富含血小板源生长因子、转化生长因子、表皮生长因子，仍有血源性异体蛋白及病原体传播风险。近年来有一种新的、完全不含或含极低量蛋白的无血清培养液问世，称双无培养液（Ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ—ｆｒｅｅ培养液）¨１｜，这种培养液成分均为已知化学物质，因此可避免血清所带来的外源性污染、血清组份的细胞毒性作用、不明血清组份对细胞培养及试验研究的影响及血清批问的质量差异，而且在细胞培养与生产过程中稳定性很好；其完全不含蛋白或含量极低的优点，更有利于目标蛋白的分离纯化¨２｜。本培养方案采用无异种蛋白、无血清的ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ—ＸＦ培养基培养脐带间充质干细胞，贴壁前２４ｈ用ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ—ＸＦ贴壁基质包板，促进细胞贴壁，并采用重组ＴｒｙｐＬＥ酶替代猪胰酶消化贴壁细胞，从根本上避免了牛血清与猪异种蛋白的致敏。ｉｎｔｏｆａｔ；Ｄ：ＭＳＣｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｓｅｒｕｍｍｅｄｉｕｍｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ共培养的ＣＰＭ值分别为（７．８５±０．０７）×１０４、（５．６４±０．１２）×１０４、（３．０９±０．１８）×１０４和（１．７３±０．０５）×１０４，混合淋巴细胞增殖抑制率分别为：（８．０９±０．５３）％、（３５．５８±０．８７）％、（６４．１±１．０２）％和（７９．８±０．２４）％。无血清培养液和含血清培养液培养的ＭＳＣ与混合淋巴细胞共培养组ＣＰＭ值与混合淋巴细胞培养组ＣＰＭ值相比具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），两种培养液及培养的ＭＳＣ高剂量组ＣＰＭ值比ＭＳＣ低剂量组ＣＰＭ值低（Ｐ＜０．０５），两种培养基培养的ＭＳＣ高剂量组混合淋巴细胞增殖抑制率比ＭＳＣ低剂量组｝昆合淋巴细胞增殖抑制率低（Ｐ＜０．０５），间充质干细胞抑制混合淋巴细胞反应呈细胞浓度依赖性。无血清培养液培养的ＭＳＣ较含血清培养液培养的ＭＳＣ更显著抑制混合淋巴细胞反应（Ｐ＜０．０５）（图３）。：弋Ｒａｔｉｏｏｆ【、）ｎ¨ＭＳＣａｎｄｒｅａｃｔｉｖｅＴｃｅｌｌｓｅｆｆｅｃｔｏｆＦｉｇｕｒｅ３．ＩｎｈｉｂｉｔｅｄｏｒｙＭＳＣｏｎｍｉｘｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅａｃｔｉｏｎ．本研究中分离出的脐带ＭＮＣ培养２４ｈ弃去脐带组织残块后即可见较多贴壁圆形细胞，培养４８—７２ｈ可见细胞拉长呈梭形，后逐渐伸出伪足呈纺锤状，换液培养１０ｄ左右汇聚度可达到８５％，较传统万方数据?１２６０?的含胎牛血清培养ＭＳＣ的时间更长，形态差异不明显。根据国际细胞治疗协会（ＩＳＣＴ）制定的标准¨３。，本研究通过流式细胞仪对第３代ＢＭ－ＭＳＣ进行细胞表面分子抗原的表达检测显示：细胞表达黏附分子和基质细胞标记ＣＤ７３、ＣＤ９０及ＣＤｌ０５，也表达透明质酸盐受体ＣＤ４４，不表达造血细胞标记ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ—ＤＲ，表明ＭＳＣ是区别于造血细胞的另一种处于未分化状态的非定向干／祖细胞。细胞周期分析表明，６５％的扩增后ＭＳＣ细胞处于Ｇ。／Ｇ，期，证明所培养的细胞仍保持干细胞特性。ＭＳＣ是一种高度异质性的细胞群，由于多潜能的ＭＳＣ可以向中胚层细胞系分化，使分离出的ＭＳＣ中可能含有不同分化阶段的细胞类型，如含有较原始的ＭＳＣ，成骨前体细胞和成脂前体细胞等处于不同分化阶段的细胞类型。在本研究中，经过成骨和成脂肪诱导１４ｄ后，ｖｏｎＫｏｓｓａ法和油红一Ｏ染色均呈阳性，表明无血清培养基扩增后的骨髓间充质干细胞能够分化成成骨和脂肪细胞。本研究的这些结果证明无血清培养基同样能够在体外进行骨髓间充质干细胞的扩增，且扩增后的细胞仍能保持其干细胞特性（包括自我更新即集落形成能力、慢周期特性以及多向分化潜能）。ＭＳＣ主要的免疫学特性是低免疫原性和免疫调节能力，它对多种免疫细胞的免疫调节功能主要表现在抑制淋巴细胞增殖和免疫球蛋白及ＩＦＮ一＾ｙ的分泌，其作用机制主要是通过分泌转化生长因子Ｂ因子、吲哚胺．２，３．双加氧酶、一氧化氮等。１４ｊ发挥作用的。本研究用不同浓度的ＵＣ．ＭＳＣ抑制｝昆合淋巴细胞反应，其抑制作用呈浓度依赖性也可以证明它的免疫调节功能。总之，无血清培养液同样可培养出具有ＭＳＣ所有特性的ＵＣ．ＭＳＣ，也可培养出临床治疗ＭＳＣ细胞量，这种大量扩增的ＭＳＣ细胞用于造血干细胞移植后患者可完全避免异种蛋白致敏及病原微生物的污染。这种无血清培养基中的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠是多数细胞株的必需补充因子，其中无血清培养液中转铁蛋白至少达５“ｇ／ｍＬ，胰岛素才能起作用，转铁蛋白在无血清培养液中的作用可以被某些铁盐所代替，如柠檬酸铁、葡糖酸铁等，而微量元素硒在培养过程中参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害，其最适浓度是３—６ｘ１０５ｍｍｏｌ／Ｌ。这种培养液培养的ＵＣ—ＭＳＣ暂未发现不足之处，研万方数据中国实验血液学杂}