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bsa封闭原理 关于BSA封闭液的使用方法大讨论
A、请问各位高手,在进行免疫荧光的实验时,浸一抗之前,要用的封闭液中1%的BSA是怎么配制? 封闭液封闭后还用PBS 清洗干净再浸一抗吗?
1.可以直接用0.02M的PBS配制
2.不用PBS清洗干净，直接浸一抗。
B、各位高手，间接法中我想摸索封闭液BSA的最佳浓度，用抗原 包被后，用不同浓度的BSA(0.5%，1%，2%，3%)封闭，其他条件固定，测得 OD450nm后，可以看出随着BSA浓度增高，空白值降低，待测样品的OD450nm值也降低，，应该如何确定BSA的最佳浓度?
Q1、你的BSA 浓度是否太高?最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的BSA，封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的
Q2、判断封闭条件，要考虑在此条件下是否能达到试验要求，即棋盘滴定要满足：阳性样品OD=0.8、阴性样品OD&=0.1，而不是看你待测样品OD变化趋势;
过低封闭浓度势必造成本底过高，但过高又会使灵敏度降低，因此只要选择能够满足你试验要求的最低BSA浓度就可以了。
另外提醒，洗涤一定要彻底，很重要的。
Q3、包被后封闭前一般要洗涤一遍，以便于洗掉结合不牢固的包被物，防止在实验中影响实验结果;封闭后一定不要洗涤，封闭的目的就是要靠蛋白填补未被包被物占领的空间，另外封闭液一般也具有保护作用。
C、新生牛血清(细胞培养时候加到1640的那一种)可以么，用多大的浓度配比较好啊，是用双蒸水配吗??
Q1、5%，TBS配，BSA是牛血清蛋白，粉剂，不是牛血清哦
Q2、如果不是用biotin-avidin系统的话，用5%脱脂奶粉做封闭液就可以了，廉价，效果也很好。
Q3、封闭液一般是用5%的BSA或者是用5%的脱脂奶粉，溶剂一般使用TBST。做实验的时候，我一直强调这样的一个原理，那就是在了解原理的基础之上，我们完全可以不拘泥于书本，进行创造。就拿这个封闭液来讲，要是单纯的一种封闭效果仍然不好的话，我们完全可以两种合用，我就试过1%的BSA和5%的脱脂奶粉合用进行封闭的事例。所以，搞科学研究是需要我们进行再创造的。
D、BSA交联抗原注射到兔子体内得到一抗，我们Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP标记的二抗。请问，在封闭时，用什么样的封闭液比较好呢?是无蛋白封闭液，还是羊的免疫前血清?
Q1、用5%的脱脂奶粉就可以吧，溶到PBS里，加0.1%的吐温-20.
E、以前买的是专门的一抗稀释液，现在用完了，想换BSA液做封闭液用，因为牛奶太容易坏了，请问可以长期保存么么，谢谢诶，5%可以么，哈哈
Q1、5%BSA配完放冰箱就是了，不过BSA还是有点贵，脱脂奶粉挺好的，现用现配就是了
Q2、BSA确实有点贵,我们在牛奶中加千分之0.2的叠氮钠,放4度可保存2月左右
Q3、NaN3对HRP是强烈抑制剂，如果你使用的是HRP标记~建议要么更换防腐剂，要么延长洗膜时间和次数。其他防腐剂可以选择：硫柳汞钠、极少量的氯仿(1~2ul就可以)
Q4、BSA和牛奶一样，只要不臭，就可以反复使用，而且，有的高手提议放的时间长一点，效果反而更好，也许是溶解的更为彻底的缘故吧。
Q5、都一样吧，在不加防腐剂的情况下，两者的保存时间都不久。我们实验室是牛奶+叠氮钠，虽然用的是HRP，但只要洗膜时间有保证，一般问题不大。加了防腐剂的牛奶可以用蛮长时间的，一个月应该没问题吧。还有一点就是，有的蛋白用BSA会更好，有的蛋白则用牛奶会更好，这是我的个人经验，因为曾经用两种稀释液做过同一个样品同一个蛋白的western，结果证实牛奶的背景更干净，特异性更好，BSA的则会有杂带。
F、 请免疫荧光高手指点,我最近做了两次的免疫荧光,均失败,可基本排除是抗体问题,我想问问荧光高手,其中免疫荧光中的封闭液(我用的是5%BSA)跟我的一抗有关吗?封闭液的选择是否和一抗的稀释液需相同,非常感谢!
Q1、封闭液对一抗的结合影响不大，失败的原因不应该是封闭液的原因。一抗可以用封闭液稀释。我们做的经验看，相对组化中一抗的浓度，荧光的稀释比例应该大，即假如组化是1：100，荧光可以试1：50。
G、我的包被的蛋白是用bsa偶联的二十四个多肽，我想问下我用什么做封闭液才行呢?
Q1、BSA或是酪蛋白的封闭液都行，封闭是为了封闭抗原没有占据的空白点，跟你的多肽用何种蛋白偶联没有任何关系!
H、小弟课题牵涉到ELISA检测血清中抗原，在网上看到封闭液的配方又很多种，由于经费有限，小弟想是否也可以效仿western blot 使用脱脂奶粉作配封闭液，不知各位有没有这方面的经验，或者能介绍一下又有效又实惠的配方
Q1、脱脂奶粉做封闭液是相当得可以，另外廉价的封闭液有BSA，酪蛋白等。都可以用来做封闭液。
Q2、放在瓶子里溶解，称量好干粉和其他的盐后，放到瓶子里使劲摇……让蛋白和盐结晶充分混合，再加水很快就溶了。
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最近用0.2孔径的膜，对封闭有一些体会，和大家交流一下。millipore 0.2的膜吸附蛋白能力很强，如果常规方法封闭，NC膜封闭一个小时就可以，而0.2的膜如果按这个条件，背景很高，几乎完全盖住目的条带。但有一些表达量不高，分子量较小的蛋白用0.2的膜还是必需的。我改进条件，4度封闭过夜，然后洗脱时间延长，效果就改善了。如前面战友所说，封闭降低背景，应该是因为封闭液与膜上能非特异性吸附蛋白的位点结合，非特异性吸附蛋白的位点结合掉以后，当一抗或二抗（蛋白）加入时，不会再与膜非特异性结合了。（这种结合可以是疏水作用，离子键，共价键等）至于非特异性条带，封闭条件优化一下应该能降低或去除。但我觉得没有太大必要去除。因为抗体特异性不一定很强。再者有很多未知的蛋白与蛋白相互作用，蛋白跟蛋白之间的相互作用，也能发生在非目的蛋白与抗体之间。只用我们所要的目的蛋白变化明显就足够了。
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不用那么麻烦 奶粉用小牛初乳就可以 我做过脑脊液与神经脱髓鞘的研究 ，那些单一抗体 比如IgG寡克隆 就是很好的例子，如果在转膜是把气泡赶走就可以
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封闭的目的---阻滞膜对抗体的非特异性吸附
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不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。
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说的太好了，一下子排除了我心中很多臆想的答案谢谢
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囡囝 不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。我用的就是牛奶，没有你说的现象。
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既然这样，无果我不封闭，直接加一抗会是什么结果？TBS配置后有两年了，一直在4度置放，会对western结果有影响吗？
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本人一直WB，交流下！ 1、奶粉（封闭液）中的蛋白填塞入膜孔道，封闭膜上无蛋白转移区，这样一抗孵育时起到减轻背景作用；2、奶粉与抗原结合只是非特异性结合膜表面抗原，在一抗孵育情况下大部分可以竞争性的与抗原结合，而此时的一抗和奶粉对杂带的作用均为非特异性的作用~ 所以奶粉封闭后可以减少杂带的显色；封闭时间长条带变弱，此时可以延长漂洗和一抗孵育的时间。3、预实验时多做几次，摸索好自己的条件~ 因为各个阶段的时间都不是唯一的~
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学习了，收益非浅，感谢各位大侠奶粉你们浓度都怎么掌握呢，多少奶粉加多少水
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nerine0102 既然这样，无果我不封闭，直接加一抗会是什么结果？TBS配置后有两年了，一直在4度置放，会对western结果有影响吗？建议不要使用了。我们最初做wb时用的就是在4度保藏了2年的TBS，结果封闭效果很差。后来从新配了，背景变得很好。
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学习了，不错。
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转自The ELISA Guidebook (2nd edition).pdf 第123页 John R. Crowther
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相信参与讨论的各位战友都有受益匪浅的感觉，我觉得这种讨论的形式真的不错。比书本上的资料来得生动，因为我们自己都做过相关的工作，有实践的体会；又比单纯的试验细节讨论更高一些，因为我们在根据实践总结一些共性的东西。在思考中我们回顾了自己的实验；在讨论中我们了解了更多的不同面；在总结中我们获得了真实性的技术。正是由于大家的积极参与，本帖上了DXY的首页热门，谢谢大家！
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liupeng0215 请问：“把封闭蛋白推开，自己坐上去！！！”，如何推开？？？与目的蛋白结合的力量？？中间隔着封闭蛋白，抗体能不能找到目的蛋白还是个问题吧？
那又是如何推开的呢？？哈哈，推开只是一种比喻，至于具体如何推开就和抗体和目的蛋白的相互作用强度有关了，比如氢键，共价键，范德华力，还有空间位阻等等。这里的推开用取代或许更准确一点。而能不能找到目的蛋白，这就是一个碰撞几率的问题，按理说，这个几率在这些实验上不成问题才对。这个问题看来是很细化。
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精彩!封闭蛋白与以结合到膜上的蛋白作用方式两种观点都有道理,我个人觉得两种作用方式在同时起作用.但个人觉得封闭蛋白对目的蛋白两种作用方式很微弱,试想如果作用一般的话,那么有的蛋白就有可能做不成WB,因为蛋白的多样性的存在会使这两种作用方式占主导地位;不管是那种方式占主导地位,最终的结果就是抗体结合不了目的蛋白.至于封闭时间过长会产生信号减弱的现象,本人认为蛋白之间洗脱和吸附多是需要时间的,相互作用弱的就更依赖时间了.(对吸附作用来江,也许很可能时间长了会产生不可逆影响;对洗脱也是如此).总之,我个人认为:1、封闭液中的蛋白与膜上的空白位置结合占主导地位；2、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白的洗脱和吸附作用在相对短的时间内很微弱，但也很重要。
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在不断的思考过程当中，觉得无论封闭（膜与封闭蛋白或非蛋白）、特异性的抗体结合（抗原抗体，一抗二抗）、非特异性的蛋白相互作用（杂带与封闭蛋白，杂带与一抗二抗，封闭蛋白与一抗二抗）、洗脱液中各种成分的作用（如Tween）都可以用化学反应中的动态平衡来比喻。影响WB结果的就是这些反应的化学反应平衡常数，参与反应的物质，以及化学动力学中达到反应平衡所需的反应时间。平衡常数决定了这些相互作用的强度，而动力学决定了能否到达平衡的时间作用。从理论上来讲，WB体系中的吸附和洗脱都是存在的，无非就是参与反应的强弱而已。可能平衡常数和动力学决定了某些反应在实践中难以察觉。想到一点说一点，不知不觉向化工方面靠了，见笑。大家继续讨论，加票加分，呵呵。
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有人注意过膜上面蛋白量的问题么？如果是洗脱，则膜上蛋白要脱如覆盖屏蔽杂带是否较易理解
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强贴！ 很多时候就是因为这些小细节让实验差强人意，只有理解了它们，才能在各种情况前从容面对。支持置顶！
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丁香园准中级站友
好帖子，学习了！
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supermaltose 你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合高手的回答，简单易懂，切中提要。赞一个。
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page3-索莱宝的说法，我支持。封闭膜上的-OH, =O, -NH, -NO2,-COOH,-SH, -SO, 等很多基团。甚至就是-C-C-, -C-H, 免得结合一抗二抗。亲水，疏水，氢键，范德华力，离子键，……各种作用都有；所以教科书不详细列举了。脱脂奶粉中蛋白大小都有，所以封闭彻底；其中最多的还是BSA吧。拿别的蛋白封闭也行，但是贵。
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tibhar edited on
supermaltose 你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合说句实话，我以前一直是这么理解的，但是看了supermaltose的回帖，反而又仔细思考了一次，我觉得也不尽然就是这么回事。因为封闭不好的话，常常出现的情况是杂带显色，而不是没有蛋白条带的空白膜上显色！我现在倒更倾向于认为封闭可能是利用蛋白质之间的非特异性的相互作用（次级键的作用）而将能潜在结合抗体的部位占据。如果有人可以做一个极端的实验，利用BSA的抗体做Western，看看封闭以后是不是整个膜都显色可能会有一个比较直观的结果，呵呵。
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xuezhishui edited on
囡囝 不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。我买的BSA是TAKARA的0.3%的，配封闭液时应该怎么稀释？
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原来如此，受益匪浅！
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受教了，受教了！
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弱弱地问一句：为什么封闭完了后还要洗脱呢？
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恩，觉得ZZ19806说的很有道理
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学习了一把，都是高人呀！！！
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说的真好，孔的原理！
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牛人很多，小弟学习了！
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不错，认真学习了。
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正在疑惑这个问题，然后搜到了答案，受益匪浅
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skykiller 好帖好帖，supermaltose的生动，zzz198506的分析推理都让人击节赞叹。由zzz198506的分析受到启发，本人再抛出一个吸附-洗脱假说，来解释封闭不仅可以降低背景，而且可以使杂带信号变弱的原因，大家看看如何。Western Blott用的膜和蛋白质纯化用的柱类似，都是对蛋白进行了吸附，包括胶电转到膜上的蛋白以及封闭所用的奶粉和BSA等都是对膜的一种吸附。这种吸附作用的机理是包括疏水作用、静电、范德华力等等的综合作用，都是非特异性的。本人认为，封闭时的封闭蛋白不仅是吸附到膜上的空白位置（此点与zzz198506相同），而且还会和膜上已有的蛋白（目标蛋白和杂蛋白）产生竞争性的洗脱作用，而不是和膜上的蛋白产生结合作用。即不是用封闭液封闭杂蛋白的非特异性的抗原决定簇（用抗原决定簇这个词不是很妥当，但好理解一些），而是将杂蛋白从膜上部分洗脱下来，从而减轻了非特异性的条带信号。这种洗脱也会对目标蛋白产生作用，同样减轻其条带信号。zzz198506的这句话：“当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因”不能用结合来解释，但用洗脱就比较好理解。抗体与目标抗原的亲和结合常数远远高于这个zzz198506战友假说的非特异性结合，即使封闭液中的蛋白可能有与目标蛋白的非特异性结合，在抗体孵育过程中也会完全被替代，而不会影响到最后的显影信号。用吸附-洗脱假说来看封闭的操作，就能明白为什么封闭液的组成、浓度、时间等等要素的对WB的影响。封闭液中要有可以和膜产生非特异性吸附的分子量适中的蛋白，太大了可能对邻近的目标蛋白产生位置阻碍，太小了容易从膜上的孔洞里脱落。封闭液的pH，盐，表面活性剂等一方面影响封闭液中的蛋白与膜的结合吸附，另一方面还会对膜上的已有的蛋白产生不同洗脱作用，这也是WB中选用不同封闭液的原因，即为了尽可能多的洗脱杂蛋白，尽量减少对目标蛋白的洗脱作用。封闭液的浓度越高，封闭时间越长，对膜上孔洞的覆盖越好，由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。深受supermaltose和zzz198506两位战友的启发，感谢感谢！我是一位初学者，感谢各位的解释，但是不知道各位的解释是否有理论依据？
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关于丁香园按“封闭原理”设计和完善企业领导制体--《经济与管理研究》1985年06期
按“封闭原理”设计和完善企业领导制体
【摘要】：正 如同设计一台机器必须遵循一定的原理一样,设计一种管理领导体制也必须遵循一定的原理。当然,管理领导体制不同,其具体原理也不同。但在这些不同的具体原理中却包含着一个共同的一般原理,这就是“封闭原理”。那么,什么是“封闭原理”?为什么“封闭原理”是设计任何管理领导体制都必须遵循的一般原理?现行企业(指全民所有制企业,下同)领导体制的关键缺陷是什么?又怎样按“封闭原理”去完
【关键词】：
【正文快照】：
如同没计台机器必须遵循一定的原理一样,设计一种管理领导体制L匕必须遵循一定的原理。当然,管理领导体制不同,其其体原理也不同。但在这些不同的具体原理中却包含着一个共同的一般原理,这就是“封闭原理”。那么,什么是“封闭原理”?为什么“封闭原理”是设计任何管理领导体
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抗体杂交之前的封闭，主要是为了防止免疫试剂的非特异性吸附。一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% No-fat milk等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背景浅，封闭液以20%BSA，5%N-fat milk 比较常用。
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