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请教这是什么敲除鼠？
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问题已解决悬赏丁当:2
请问，这是什么敲除鼠？为什么Cre是上标，后面带着的“ERT2”是什么？
不知道邀请谁？试试他们
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这是基于Cre/loxP系统建立的他莫昔芬诱导条件性基因敲除系统这里的Cre酶后接ERT2，是一个改造过的雌激素受体，可以被他莫昔芬等诱导从而激活Cre酶，这个我们就可以通过控制给药从而控制基因敲除的时间这里的Rosa26
应该是一个特异启动子（具体你查下），意思是这种鼠成活后只有在表达Rosa26 特异启动子的细胞上的Foxo1基因才可能被敲除，这就是控制基因敲除的位置这个系统完美体现条件性敲除系统的时空性
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受教了！感谢！
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谢谢，懂了。好感动
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Rosa26是被认为是safe harbour，应该插入基因片段不会影响其他的基因的地方，小鼠中动物常用插入位点
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关于丁香园1、转基因鼠的构建过程
PPT-显微注射法：(1)用显微注射法将纯化的外源基因片段导入受精卵的雄原核内；(2)将微注射后经鉴定为存活的受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管内，其中一部分移植卵能够继续生长发育成个体；(3)鉴定子代鼠中外源基因的整合和表达；(4)转基因动物品系的建立。
补充-逆转录病毒法：将插入有外源基因的逆转录病毒载体DNA，通过辅助细胞包装成高感染低毒的病毒颗粒，再感染上升期的胚胎细胞，随后将胚胎导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物。
补充-胚胎干细胞法：(1)分离培养ES细胞
先要获取发育至一定时期的胚胎，经培养后，剥离和分散内细胞团，再行培养，最后分离，扩大培养并鉴定ES细胞;(2)在ES细胞上的基因操作 通过基因打靶技术，将外源基因导入ES细胞，体外培养和筛选外源基因表达者；(3)获取囊胚细胞，作为ES细胞的移植受体；(4)通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，与其细胞团紧靠在一起，成为嵌合体；(5)将注射过的胚胎，经培养后筛选无发育缺损的囊胚，移植到交配第三天的假孕受体鼠子宫内，培育出转基因动物。
2、小鼠的基因敲除（gene knockout）流程
基因敲除是采用同源重组的方法，用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因，再应用转基因方法孵育出转基因动物。
简：将灭活的基因导入ES细胞中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。由于嵌合体小鼠的一部分细胞来源于ES
细胞，所以通过小鼠培育即可获得纯合子基因
敲除小鼠。
繁：a.获取ES细胞
ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上，此重组载体即为打靶载体。
ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式(导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。
ｄ．用选择性培养基筛选已击中的细胞：将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。
ｅ．通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
3、RNAi的概念和原理
RNA interference:RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制（PTGS)被称为RNAi。
第九章转录组学研究方法
cDNA、EST的概念
cDNA:为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写。
补充：以mRNA为模板，经反转录酶在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
EST（Expressed Sequence tags，表达序列标签 ）是从已建好的cDNA库中随机抽取克隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。
第十章 DNA测序法
2. Sanger 测序法的原理
利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
DNA延伸过程中随机地掺入双脱氧核苷酸，终止DNA延伸
Sanger法需要引物、模板、DNA polymerase、dNTP/ddNTP混合物、检测体系
采用PAGE或毛细管电泳
早期用 32P-dNTP为标记，现在用带荧光基团的ddNTP
限制性内切酶（restriction endonuclease）
识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子，故DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。
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基于Cre/loxP系统建立的他莫昔芬诱导条件性基因敲除系统
基于Cre/loxP系统建立的他莫昔芬诱导条件性基因敲除系统
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基于 Cre/loxP 系统建立的他莫昔芬诱导条件性基因敲除系统
该系统将雌激素 (estrogen receptor，ER)的配体结合区(ligand―binding domain，LBD)和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。为了消除内源性雌激素的影响，研究者将雌激素配体结合区进行了关键氨基酸的突变，从而使其不能与体内的生理性雌激素结合，而只能与外源性的雌激素类似物他莫昔芬结合，这样就消除了内源性雌激素所造成的非特异性基因敲除。该系统与四环素诱导系统相似，也可以对靶基因的敲除进行时间和空间二维调控。利用该系统，Schwenk等在1998年成功建立了B淋巴细胞特异启动子调控的E／1／SV40―CreERT转基因小鼠，并成功实现了他莫昔芬的诱导，结果显示在B淋巴细胞中Cre介导的重组效率达到了80％。
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DXY All Rights Reserved.拉帕替尼逆转ER-α36介导的他莫昔芬耐药的分子机制研究--《浙江大学》2015年硕士论文
拉帕替尼逆转ER-α36介导的他莫昔芬耐药的分子机制研究
【摘要】：目的：已有研究发现ER-a36可通过非经典的雌激素膜信号传导通路,使激素受体阳性的乳腺癌对内分泌治疗产生耐药。拉帕替尼(Lapatinib)是一种小分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂,可通过阻断下调信号抑制乳腺癌细胞增殖。本研究将探索拉帕替尼是否能通过下调ER-a36相关非经典的雌激素膜信号传导通路,逆转激素受体阳性乳腺癌细胞的他莫昔芬(tamoxifen, TAM)耐药,并初步探索其逆转耐药的分子机制,为乳腺癌内分泌治疗及靶向治疗提供新的理论支持。
方法：运用MTT、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术、Western Blot等技术检测经拉帕替尼单药或加用4-羟基他莫昔芬(4-hydroxy-tamoxifen,4OHT)处理后乳腺癌细胞株的增殖情况及相关蛋白水平的变化。
结果：1、MTT检测可发现拉帕替尼对ER阳性乳腺癌细胞存在明显抑制作用,在MCF-7、MCF-7/ER-a36两细胞系中,存在剂量依赖效应；2、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测发现拉帕替尼可显著增强40HT诱导激素受体阳性、ER-a36过表达的乳腺癌细胞凋亡(P0.001)；3、拉帕替尼预处理或与40HT联合作用均可加强凋亡起始、执行阶段关键Caspase家族蛋白剪切活化、抑制抗凋亡Bcl-2蛋白表达,下调细胞周期正性调控蛋白Cyclin D1、Cyclin D3、CDK2、CDK4等的表达；4、拉帕替尼显著抑制ER-a36相关非经典的雌激素膜信号传导通路中AktT308位点及S6K1蛋白的磷酸化活化,发挥增敏、部分逆转MCF-7/ER-a36对40HT耐药的作用。
结论：拉帕替尼可逆转ER阳性、ER-a36过表达的乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药,其主要通过(1)诱导细胞周期停滞与凋亡,(2)抑制ER-a36相关的非经典的Akt-mTOR信号传导通路过度活化,发挥逆转他莫昔芬耐药作用。拉帕替尼可能成为激素受体阳性、ER-a36过表达的他莫昔芬耐药乳腺癌治疗的新靶点。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：R737.9【目录】：
致谢4-6中文摘要6-8Abstract8-10中英文缩写对照表10-11目次11-12前言12-151 材料与方法15-242 实验结果24-333 讨论33-374 结论37-38参考文献38-42综述42-51 参考文献48-51作者简历51-52
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