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【求助】SOUTHERN BLOT转膜问题
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这个帖子发布于11年零155天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是做辣椒转基因的,现在需要通过SOUTHERN BLOT鉴定是否转进去了,可是最近做了好几次,都失败了,maker和阳性质粒都出来了,可是辣椒总DNA经过ECOR1酶切后,没有杂上!
考虑是不是转膜问题,因为转膜后的胶经染色后,还看到有不少酶切后的大片段残留,不知道如何改进?希望有经验的高手指点迷津!还有几个月就毕业了,急啊!
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请问:你用的杂交方法是?转膜的方法是?
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我当时参照的是&分子克隆&第三板,大片段要转18h以上
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关于丁香园关注今日：31 | 主题：312087
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【求助】micrococcal nuclease在southern blot中的作用是什么？
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这个帖子发布于9年零262天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
准备做Southern，查阅参考文献时发现都要micrococcal nuclease处理核酸样品，又去查了一下micrococcal nuclease，是对单链和双链都起作用的核酸内切酶。小弟以前从来没有做过blot，不理解使用这种酶处理样品的意义何在？请高手指教一二。
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说明中说了，只对单链起作用。Nature Methods
2, 719 - 720 (2005) doi:10.1038/nmeth Micrococcal nuclease-Southern blot assay
Micrococcal nuclease (MNase) is unique among nucleases in its ability to induce double-strand breaks within nucleosome linker regions, but only single-strand nicks within the nucleosome itself. Because of this property, MNase can be used to determine whether a DNA fragment of interest is within a nucleosome1, 2. In addition, MNase can be used to determine the approximate positions of nucleosomes in a region of DNA, if the nucleosomes are consistently positioned. In brief, cell nuclei are isolated and limiting concentrations of MNase are added to the nuclei, resulting in cleavage at nucleosome linker regions. The genomic DNA is purified and the fragments are separated by agarose the resulting ladder of stained bands corresponds in size to multiples of the nucleosome core plus the linker (200 base pairs (bp)). To determine whether a DNA fragment of interest is within a nucleosome, the genomic DNA is subjected to Southern blot analysis. If a probe derived from the DNA fragment hybridizes to the ladder of nucleosomal bands, the fragment may indeed be assembled into nucleosomes. To determine nucleosome positioning, the purified genomic DNA must be cleaved with a restriction enzyme before gel electrophoresis and Southern blot analysis.
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Southern印迹技术应用与注意事项
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