泛素—蛋白酶体系统调节血管平滑肌细胞凋亡和表型转换的机理研究--《中国协和医科大学》2009年硕士论文
泛素—蛋白酶体系统调节血管平滑肌细胞凋亡和表型转换的机理研究
【摘要】：
近年研究证实,血管损伤效应引起的血管平滑肌细胞(SMC)表型转换及其随后发生的异常增殖和迁移,对动脉粥样硬化、血管扩张后再狭窄、高血压等心血管疾病的病理生理学改变过程,具有重要的生物学意义。目前已知,许多重要的因子和信号途径参与调节平滑肌细胞的凋亡、增殖和分化,其中,PI3K/Akt信号途径和心肌素蛋白起着关键性作用。同时Akt和心肌素本身的活性也受到许多因素的调节,如生长因子、细胞因子、转录因子、致癌化学物质如佛波酯(TPA)和泛素-蛋白酶体系统等。但是,TPA调节Akt活性的分子机制尚未完全阐明。
正常生理情况下,血管平滑肌细胞高度分化,SMC标志基因呈高水平表达;相反,在平滑肌细胞增殖过程中,这些基因表达明显下降。心肌素是最有效的血清效应因子(SRF)共同激活因子(co-activator),是平滑肌细胞发育和分化所必需的转录辅助因子。CHIP既是一个伴侣蛋白辅助因子,又是一个E3连接酶,可以把分子伴侣和蛋白酶体系统有机的结合起来发挥降解蛋白底物的作用。但是到目前为止,CHIP通过UPS调节心肌素蛋白水平和动脉血管收缩性的分子机理尚未见报道。
首先,本研究探讨了TPA通过泛素-蛋白酶体系统降解磷酸化Akt和诱导SMC凋亡的分子机理。我们发现(1)TUNEL染色显示TPA可明显诱导SMC凋亡,且呈剂量和时间依赖关系;(2)Western Blot检测发现TPA能降低磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平,抑制Akt下游靶蛋白的磷酸化水平如p-GSK3β、p-FOXO3a、p-Bad及升高P27的蛋白水平,而且Akt活性与SMC凋亡密切相关;(3)蛋白磷酸酶PP2A抑制剂OA只能部分逆转TPA诱导的Akt去磷酸化水平;(4)Pulse-chase实验和蛋白酶体抑制剂MG132抑制实验均证明TPA通过泛素-蛋白酶体系统降解磷酸化Akt水平:(5)体内外泛素化实验进一步证实TPA通过激活蛋白激酶C(PKC)信号途径,促进磷酸化Akt泛素化和降解。
其次,本研究探讨了E3连接酶CHIP降低动脉血管心肌素的蛋白水平和SMC标志基因的表达水平,进而调节主动脉血管收缩性的分子机理。研究发现(1)用CHIP腺病毒感染体外培养的胸主动脉环后,可明显降低血管心肌素的蛋白水平和SMC收缩基因的mRNA表达;(2)过度表达CHIP可明显降低苯肾上腺素(PE)诱导的动脉环的收缩性;相反,可增高乙酰胆碱(Ach,内皮依赖性)和硝普钠(SNP,内皮非依赖性)诱导的血管环的舒张功能。这些结果提示CHIP在调节动脉血管的舒缩功能方面具有重要的作用。
综上所述,本研究结果表明:(1)TPA可激活PKC,促进磷酸化Akt经泛素蛋白酶体系统降解,而促进平滑肌细胞的凋亡;(2)泛素连接酶CHIP可降低动脉血管心肌素的蛋白水平和SMC标志基因的表达,调节主动脉血管收缩性。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国协和医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：R543【目录】：
中文摘要4-5
英文摘要5-7
实验材料10-14
实验方法14-21
实验结果21-33
第一部分 TPA通过泛素蛋白酶体系统抑制AKT活性和诱导血管平滑肌细胞凋亡21-31
一、TPA通过降低Akt活性诱导血管平滑肌细胞凋亡21-24
二、TPA降低Akt的磷酸化水平24-26
三、TPA促进磷酸化Akt通过蛋白酶体降解26-27
四、TPA促进磷酸化Akt的泛素化27-29
五、PKC参与TPA诱导的磷酸化Akt泛素化和降解29-31
第二部分 E3连接酶CHIP降解心肌素蛋白和抑制动脉血管的收缩功能31-33
参考文献36-40
附录:缩写词表40-42
发表文章52-60
个人简历61
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式
【参考文献】
中国期刊全文数据库
龙彬,董明敏,吕明栓,常良才;[J];耳鼻咽喉头颈外科;2000年01期
娄可心;刘宁波;彭韬;冷静;;[J];南京医科大学学报(自然科学版);2007年06期
薛亚梅;李坤;吕杰强;;[J];生命科学;2007年01期
温进坤,韩梅;[J];中西医结合学报;2003年01期
;[J];World Journal of G2002年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库
刘新奎;王琳;张明智;;[J];第二军医大学学报;2010年04期
汤益明;汤蕙;;[J];江西医药;2006年01期
范永娜;谢平;张华;郭树彬;李汇华;;[J];中国动脉硬化杂志;2008年11期
刘巍巍,曾宗渊,肖锡宾;[J];临床耳鼻咽喉科杂志;2005年17期
居小兵;王宁宁;杨俊伟;王笑云;孙彬;邢昌赢;;[J];南京医科大学学报(自然科学版);2008年11期
张敏州;杨广;江巍;;[J];广州中医药大学学报;2006年02期
龚萍;李红霞;张素梅;;[J];武警医学院学报;2010年07期
温进坤,韩梅;[J];中西医结合学报;2004年05期
陶丽丽;雷燕;;[J];中西医结合学报;2012年01期
唐霞;周善璧;;[J];眼科新进展;2009年05期
中国重要会议论文全文数据库
翁小光;赵华云;王文会;;[A];2011·中国医师协会中西医结合医师大会论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库
王志高;[D];广州中医药大学;2007年
林羡屏;[D];福建医科大学;2009年
王琳;[D];郑州大学;2008年
桑红灵;[D];湖北中医学院;2009年
吴淑琼;[D];湖北中医药大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
苏小军;[D];兰州大学;2011年
安婷婷;[D];山东中医药大学;2011年
穆秉桃;[D];青海大学;2011年
陈先菊;[D];广州中医药大学;2007年
常亮;[D];辽宁中医药大学;2007年
江毅;[D];湖北中医学院;2008年
仇黎丽;[D];南京医科大学;2008年
金海红;[D];中南大学;2008年
段建平;[D];青岛大学;2007年
李蓓;[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
孙志贤,罗瑛;[J];国外医学(肿瘤学分册);1994年05期
周秀霞,温进坤,韩梅;[J];河北医科大学学报;2000年04期
王静清，董震，朱建国，卜国铉，郭晓峰;[J];临床耳鼻咽喉科杂志;1994年02期
姚玉宇,冷静,彭韬,尹航,黄峻;[J];临床与实验病理学杂志;2002年01期
刘宁波,彭韬,沈波,冷静;[J];南京医科大学学报(自然科学版);2004年04期
石缨,温进坤;[J];心肺血管病杂志;1999年03期
赵灵芝,银巍,苏兴文,肖茹,曹林,邱鹏新,颜光美;[J];中国药理学通报;2005年01期
石缨,温进坤;[J];中国老年学杂志;1999年06期
韩梅,温进坤;[J];中国老年学杂志;2001年04期
韩梅,温进坤;[J];中国中西医结合杂志;1999年12期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
唐勇;余哲;;[J];解剖学杂志;1993年04期
赵庆伟;;[J];武警医学;1993年02期
覃毅;;[J];国外医学情报;1995年05期
程勇,张依仁;[J];中华实验外科杂志;1997年05期
舒春兰,袁中华,雷小勇,万载阳;[J];衡阳医学院学报(医学版);1998年03期
杨军,林曙光,余细勇,唐其东;[J];中国药理学通报;2002年02期
,赵子琴;[J];中国男科学杂志;2005年05期
李鹏云;曾晓荣;杨艳;;[J];医学综述;2006年02期
胡涛;贾国良;王海昌;郭文怡;曹燕杰;王晓燕;;[J];中华物理医学与康复杂志;2006年02期
修春英;蔡辉;;[J];中国微循环;2006年02期
中国重要会议论文全文数据库
詹鹰;刘继红;封江南;肖恒军;李忠远;张朝晖;王涛;陈俊;王少刚;叶章群;;[A];第十六届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2009年
张亮;梁朝朝;张贤生;郝宗耀;周骏;樊松;葛魏巍;李玉;;[A];第十六届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2009年
司军强;蒋志根;A.L.N;[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年
费乃昕;马涛;薛承锐;;[A];第六次全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会论文汇编[C];2005年
马涛;齐清会;杨文修;;[A];天津市生物医学工程学会2004年年会论文集[C];2005年
刘伟;章杰;李文芳;付建华;刘丽忠;杨红华;文辉才;;[A];第四届华东六省一市整形外科学术会议暨2007年浙江省整形、美容学术会议论文汇编[C];2007年
万少平;郑航;胡礼泉;郑新民;;[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
葛魏巍;梁朝朝;叶元平;郝宗耀;周骏;;[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
徐成胜;吴勇波;曾和松;;[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
赵刚;宋明宝;于学军;朱光旭;于世勇;董红梅;康华利;黄岚;;[A];中国心脏大会（CHC）2011暨北京国际心血管病论坛论文集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库
张磊;[N];中国医药报;2004年
郭斐;[N];中国经营报;2010年
吴剑洁;[N];中国保险报;2011年
唐先武　特约记者
肖鑫;[N];科技日报;2009年
;[N];中国医药报;2003年
序文;[N];国际经贸消息;2001年
外经贸部国际贸易经济合作研究院 王有莉;[N];国际经贸消息报;2002年
潘少婷;[N];东莞日报;2009年
衣晓峰?通讯员
陈英云;[N];健康报;2007年
王艳红;[N];医药经济报;2007年
中国博士学位论文全文数据库
王刚;[D];华中科技大学;2011年
王乐;[D];清华大学;2011年
王洪枫;[D];中国科学技术大学;2009年
张磊;[D];吉林大学;2007年
邓世山;[D];四川大学;2006年
张耀全;[D];第三军医大学;2008年
巫嘉陵;[D];天津医科大学;2011年
方伟;[D];第二军医大学;2012年
杨坤;[D];北京协和医学院;2012年
程龙;[D];华中科技大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库
秦晓娟;[D];泸州医学院;2009年
张鹏;[D];兰州大学;2010年
杨琰;[D];安徽医科大学;2011年
杨广;[D];广州中医药大学;2006年
赵巍;[D];吉林大学;2007年
夏承来;[D];南华大学;2007年
李世煌;[D];南华大学;2007年
黄鑫涛;[D];福建医科大学;2007年
李忠远;[D];华中科技大学;2007年
郭浪滔;[D];福建医科大学;2009年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 大众知识服务
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备75号当前位置： > 首页
SMC（中国）有限公司
企业认证：
联 系 人：
联系地址：
北京经济技术开发区兴盛街甲2
联系电话：
(86) 10-678 855 66
在线咨询：
(86) 10-678 818 37
企业网址：
公司网站：
联系我时，
告知来自模具联盟网
地址：北京经济技术开发区兴盛街甲2联系电话：(86) 10-678 855 66 传真：(86) 10-678 818 37访问统计：911
模具联盟网 设计制作，未经允许翻录必究。Copyright &
, All rights reserved. &
以上信息由企业自行提供，信息内容的真实性、准确性和合法性由相关企业负责，模具联盟网对此不承担任何保证责任。SMC（中国）有限公司招聘
 - 北京理工大学就业信息网
当前位置：&&&详细信息
SMC（中国）有限公司招聘
SMC是世界著名的气动元件制造商，在世界51个国家和地区设立了分公司。SMC（中国）有限公司是SMC集团于1994年9月在北京经济技术开发区投资建立的独资子公司，为北京市高新技术企业、十百千工程单位。目前投资额已达5亿美元，在北京经济开发区建有研发中心、3个生产工厂，在顺义天竺建有1个生产工厂,总共占地面积为55万平方米，员工5700多人，生产用于工业自动化的气动元件。公司采用当今世界同行业最精锐的自动化生产设备，引进了完整的现代化气动元件制造工艺。经过20多年的高速发展，SMC（中国）有限公司已成为世界上最大的气动元件生产和出口基地之一，产品销售全球56个国家和地区。同时在全国主要工业城市建立了67个销售服务分支机构。&招聘岗位1：软件开发职责:负责公司软件系统的开发及维护.专业:计算机类& &学历:本科及以上& &外语:英语四级&&& 基本要求: 熟练使用SQL Server数据库的开发. 熟悉.NET平台，能熟练使用C#等编程语言，有JAVA开发经验.&&& 工作地点:北京&&招聘岗位2：制造工程师& &职责：现场设备技术支持（一般故障排除、日常设备点检）；生产管理；生产合理化、制造方法改善提案。学历：本科及以上专业：机械相关专业外语：英语四级工作地点：北京邮件地址:.cn&&&& 注明应聘岗位网&&& 址：.cnSMC（中国）有限公司嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究-医学教育网-青年人
临床医学专科
医学影像及其他
您现在的位置：&&>>&&>>&&>>&&>>&&>>&正文
嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究
来源：青年人()&更新时间： 17:55:28 &【字体： 】
摘　要　目的：探讨c-myc基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义c-myc寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞(SMC)增殖的作用。方法：采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(AS-ODN)，以lipofectin导入SMC后，通过细胞计数和3H-TdR掺入观察其对SMC增殖的抑制作用。结果：c-myc AS-ODN不仅对从静止状态刺激的SMC增殖有抑制作用，而且对处于增殖状态的SMC的增殖也有显著抑制作用，这种抑制作用可因加入正义c-myc ODN而减弱甚至消除，而且随着剂量的增加，抑制作用越来越明显。一次性应用c-myc AS-ODN可达到较持久的作用。而正义ODN和错配ODN对SMC增殖无影响。结论：c-myc AS-ODN以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。c-myc基因表达在SMC增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。　　主题词　寡核苷酸类，反义；基因，MYC；肌，平滑；细胞
Inhibition of rat aortic smooth muscle cell proliferation by chimeric phosphorothioateantisense c-myc oligodeoxynucleotide
WANG Jia-Ning, HU Da-Yi, MA Ya-Luan, GAO Tian-Xiang, LIU Bo The Heart Cennter, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences，Beijing(100020)
　　Abstract AIM：Investigate the role of c-myc gene expression in the signal transduction pathways mediating smooth muscle cell (SMC) proliferation and the effect of chimeric phosphorothioate antisense c-myc oligodeoxynucleotide (AS-ODN) on rat aortic SMC proliferation.METHODS：Chimeric phosphorothioate c-myc AS-ODN targeting the 1st 5 codons of translation initiation region of c-myc mRNA was introduced by lipofectin and its inhibitory effect on SMC proliferation was observed by cell count and　［3H］-TdR incorporation. RESULTS：c-myc AS-ODN markedly suppressed proliferation of not only SMC stimulating from quiescent state but also exponential SMC. The inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation was decreased and even abrogated by adding sense c-myc ODN. The larger dose there was, the greater inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation there was. A single administration of c-myc AS－ODN had lasting action.Sense c－myc ODN and mismatch c-myc ODN had no significant effect on SMC proliferation compared with control. CONCLUSIONS：c-myc AS-ODN inhibited SMC proliferation in a dose-dependent and sequence-specific manner. This investigation indicates that c-myc gene product is involved in the signal transduction pathways mediating SMC proliferation and provides a basis for future study of the potential role of antisenese strategy using c-myc AS-ODN designed to inhibit SMC proliferation for the prevention of coronary restenosis.　　MeSH　Oligodeoxyribonucleotides, Genes, Muscle, Cells
　　经皮腔内冠脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)已成为冠心病的主要治疗手段之一，但术后3～6个月内发生的再狭窄是影响PTCA远期疗效的限制因素，迄今尚无有效防治再狭窄的措施［1］。反义核酸技术是近十年来兴起的技术。它的特异性和负调控靶基因的作用为再狭窄的防治带来了新的希望。　　动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是再狭窄形成的重要机制之一。c-myc基因表达是SMC从G0／G1期进入S期所必需的。多种引起SMC增殖的生长因子和血清刺激均导致c-myc基因表达增高。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN)，通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的大鼠SMC，观察其对SMC增殖的影响，以期探索一条抑制SMC增殖进而防治再狭窄的新途径。
材料与方法
　　(一)试剂：DMEM培养基、lipofectin、HEPES和胰蛋白酶购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自中国医科院天津血研所，3H-TdR购自中科院原子能研究所。　　(二)ODN的合成和序列：ODN由美国Research公司合成。ODN 5′和3′端各3个磷酸二酯键中的一氧原子被硫取代，其它磷酸二酯键未行修饰。合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义(sense)序列5′ATG CCC CTC AAC GTG 3′;反义(antisense)序列5′CAC GTT GAG GGG CAT 3′；错配(mismatch)序列5′ CAC GTG GAG TGG CAT 3′。　　(三)尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ODN的稳定性：将处于指数生长期的SMC培养上清液(含20%FCS的DMEM)取出，分别在电泳前的不同时间，加入c-myc AS-ODN至SMC培养上清液中，使其浓度达到200 mg/L，置37℃体积分数为5%CO2的孵箱中孵育。电泳时取1μL加入7μL缓冲液，2μL甲酰胺，混匀，于55℃加热5 min，再加2μL缓冲液，混匀，用微量进样器按顺序上样。加样前，先用1500V电压预电泳15 min。切断电流后，加入样品，使用1500V电压进行电泳。电泳结束后取下凝胶。EB染色1 h，紫外灯下观察照相。　　(四)SMC的培养：方法参照文献［2］。　　(五)［3H］－TdR的掺入实验：方法参照文献［3］。　　(六)统计方法：实验数据采用SPSS软件处理，所有计量资料均先行方差分析。若方差齐性，多组之间的两两比较采用q检验；若方差不齐，进行秩和检验，多组之间的两两比较采用推广的t检验。
　　(一)c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞上清液中相当稳定，一直到孵育第7天，AS-ODN也没有明显降解，说明本研究所采用的嵌合性硫代磷酸修饰的ODN性能稳定，能够抵抗核酸酶的降解。　　(二)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制：　　(1)c-myc AS-ODN对从静止状态刺激的SMC增殖的抑制：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育24 h后，换无血清的DMEM静止SMC 24 h，弃去培养液，加入含lipofectin 8μmol/L和c-myc AS-ODN 100 nmol/L DMEM培养液，4 h后换20%FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数，每组设3个平行孔。实验设正义ODN组，错配ODN组和对照组。结果显示，正义c-myc ODN和错配c-myc ODN对SMC增殖无影响，而c-myc AS-ODN与其它各组间差异均有显著(P＜0.01)。　　(2)c-myc AS-ODN对处于增殖状态的SMC增殖的抑制作用：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育48 h后，换含8 μmol/L lipofectin和100 nmol/L c-myc AS-ODN的DMEM培养液4 h后，换20% FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数。每组设3个平行孔。实验同时设正义ODN组、错配ODN组和对照组。结果显示，c-myc AS-ODN能显著抑制增殖状态SMC的增殖，与其它各组间相比，差异有显著，P＜0.05。　　(三)Lipofectin/AS-ODN作用于SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN是否进一步抑制SMC增殖：lipofectin/AS-ODN处理SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN并不能显著增加首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的效果。说明一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖抑制作用的持久性，无需反复应用。　　(四)生长抑制率与c-myc AS-ODN剂量的关系(图1)：生长抑制率=正常对照组细胞数-实验组细胞数/正常对照组细胞数-接种细胞数×100%。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制存在着明显的剂量效应关系，生长抑制率=0.27 lgConc,其中Conc代表c-myc AS-ODN的浓度，单位为μmol/L,相关系数r=0.9867，P＜0.01。
Fig 1 Curve showing dose-dependent growth inhibition of SMC after c-myc AS-ODN administration. Percent inhibition was calculated at day 7 by comparison of cell number in c-myc AS-ODN treated cells with that of control group.图1　不同浓度的c-myc AS-ODN对生长抑制率的影响
　　(五)正义c-myc AS-ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的逆转作用(图2)：在c-myc AS-ODN浓度不变的情况下，改变正义与反义ODN的浓度比，可以看出，随着正义c-myc AS-ODN剂量的加大，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用逐渐减弱，在正义ODN与反义ODN浓度之比为10∶1时，正义ODN几乎完全消除反义ODN抑制SMC增殖的作用。
Fig 2 Growth curves of SMC showing that the growth-inhibitory effect of c-myc AS-ODN is prevented by excess of sense oligomers. Rat SMC were incubated with 100 nmol/L c-myc AS-ODN alone or with excess sense oligomers in the presence of 8 μmol/L lipofectin for 4 h, medium was replaced with 20% FCS*DMEM. Live cells were counted at the indicated period of time图2　正义c-myc ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的影响
　　(六)c-myc AS-ODN对SMC ［3 H］-TdR掺入的影响(图3)：c-myc ODN能显著抑制［3H］-TdR掺入SMC，c-myc AS-ODN组与其它各组之间相比，差异有显著(P＜0.01)。
Fig 3 The amount of　［3H］-TdR incorporation of SMC treated with antisense, sense and mismatch oligomers and left untreated with oligomers图3　c-myc AS-ODN对SMC ［3 H］-TdR掺入的影响
　　(七)正义c-myc AS-ODN对c-myc ODN抑制［3H］-TdR掺入SMC的影响(图略)：c-myc AS-ODN对SMC ［3 H］-TdR掺入的抑制，随着正义c-myc ODN剂量的加大，其作用逐渐减弱。在正义与反义c-myc ODN浓度之比为10∶1，［3H］-TdR的掺入量与对照组相比，P＞0.05,说明大剂量的正义c-myc ODN可完全逆转c-myc AS-ODN的作用。
　　反义核酸技术抑制SMC增殖已有报道［4～6］。反义ODN针对的靶点包括c-myc、非肌源性肌球蛋白重链(nonmuscle myosin heavy chain)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)等。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA翻译起始区前5个密码子的嵌合性硫代修饰c-myc AS-ODN，在细胞上清液中非常稳定，将其通过lipofectin导入SMC后以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。现将有关问题讨论如下：　　(一)c-myc AS-ODN的设计［7］：本研究中所针对的序列是大鼠c-myc mRNA的翻译起始区，因为该区较少含有二级结构，便于AS-ODN与靶序列相结合。据计算，在基因组中识别一单一特异序列所需的最小数目为12～15个碱基。在实际研究中，大多采用15～30个左右碱基的长度。本实验中c-myc AS-ODN的长度为15个碱基。本实验采用了磷酸骨架修饰，将核苷酸间的磷酸二酯键的一个氧原子被硫取代，目的在于增加ODN对核酸酶的抵抗性，同时保留了修饰的ODN仍为RNase H底物的特点，通过间接方式诱导靶序列的降解。ODN的修饰固然可以增加对核酸酶的抵抗性，却有可能降低其与靶序列的亲合性。因此本实验只修饰两端部分序列，两端的修饰是保护ODN免受核酸酶降解所必需的，是一种三明治式的嵌合性修饰。　　(二)c-myc AS-ODN的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中孵育不同时间后，进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现孵育7 d后，其浓度仍然没有显著变化，未发生明显降解，说明嵌合性硫代修饰的ODN非常稳定。　　(三)剂量依赖性：本研究结果表明，c-myc不仅能抑制从静止状态刺激的SMC增殖，而且对处于增殖状态的SMC亦有类似的抑制作用。随着c-myc AS-ODN剂量的加大，其对SMC增殖的抑制作用越来越明显，在c-myc AS-ODN的浓度为100 nmol/L时，第7 d时生长抑制率为63.5%，c-myc AS-ODN浓度为5 μmol/L时，生长抑制率为99.3%，存在着明显的剂量效应关系。　　(四)作用的持久性：虽然一次性使用c-myc AS-ODN，可以看出在相当长的一段时间内显著抑制了SMC增殖，再次加入c-myc AS-ODN，对首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的作用仅有轻度加强，使生长抑制率增加6%～10%，但差异无显著性，进一步说明了c-myc AS-ODN对SMC增殖的作用持久性。一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖可达到比较持久的效果，这可能与c-myc基因是一迅速早期反应基因有关。　　(五)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制具有序列特异性：c-myc AS-ODN显著抑制了SMC增殖和［3H］-TdR掺入，而正义ODN和错配ODN对SMC增殖和［3H］-TdR掺入无影响。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用可因加入过量的正义c-myc ODN而减弱甚至消除，这进一步说明c-myc AS-ODN作用的序列特异性。　　本研究进一步提示c-myc基因在SMC增殖中起着重要作用，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制为防治血管损伤后再狭窄的发生提供了一种新的思路。
*湖北省十堰市郧阳医学院附属太和医院心内科(442000)
作者单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院(北京100020)
1　Franklin SM, Faxon DP. Pharmacological prevention of restenosis after coronary angioplasty: review of randomized trials. Coronary Artery Dis, 2.2　汪浩川，刘秉文，傅明德.人动脉平滑肌细胞贴块培养法.华西医科大学学报，)：105.3　熊一力，赵华月.穿心莲成分API0134对猪主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用.中华心血管病杂志，)：214.4　Simons M, Posenberg RD. Antisense nonmuscle myosin heavy chain and c-myb oligonucleotides suppress smooth muscle cell proliferation in vitro. Circ Res, .5　Simons M, Edelman ER, Dekeyser JL, et al. Antisense c-myb oligonucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cell accumulation in vivo. Nature, .6　Speir E, Epstein SE. Inhibition of smooth muscle cell proliferation by antisense oligodeoxynucleotide targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen. Circulation, .7　Bennett MR, Evan GL. Antisense therapy for angioplasty restenosis: some critical considerations. Circulation, 1.
日收稿，日修回
&&&&责任编辑：想飞&
上一篇文章： 下一篇文章：
【字体： 】【】【】【】【】【】
┊ 热线:029- 传真:029-
投诉意见,或24小时QQ热线：. Copyright & 2005- All Rights Reserved 陕ICP备}