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内部资料第 1页共 13页色谱资料( 液相) 一、液相色谱简介――――――――――――――――――――――――――第2页二、液相色谱的常见问题与维护――――――――――――――――――――第4页三、液相色谱柱的使用与维护―――――――――――――――――――――第8页四、高效液相色谱柱常见故障总结―――――――――――――――――――第 12页内部资料第 2页共 13页一、液相色谱简介高效液相色谱法(HPLC) 是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。在已知的有机化合物中,约有 80% 能用高效液相色谱法分离、分析, 而且由于此法条件温和,不破坏样品,因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。 HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等,现代 HPLC 仪还有微机控制系统,进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。目前常见的 HPLC 仪生产厂家国外有 Waters 公司、 Agilent 公司(原 HP公司)、岛津公司等,国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。一、输液泵 1.泵的构造和性能输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能: ①流量稳定,其 RSD 应小于 0.5 %,这关系到定性定量的准确性; ②流量范围宽,分析型应在 0.1 ~ 10 ml/ min 范围内连续调,制备型应能达到 100 ml/③输出压力高,一般应能达到 150 ~ 300KG/CM2 :④液缸容积小; ⑤密封性能好,耐腐蚀。泵的种类很多,按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阴影响,流量不稳定;螺旋泵缸体太大,这两种泵己被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。柱塞往复泵的液缸容积小,可至 0.1 ml ,因此易于清洗和更换流动相,特别适合于再循环和梯度洗脱;改变电机转速能方便地调节流量,流量不受柱压影响;泵压可达 400KG/CM2 。 ADW 主要缺点是输出的脉冲性较大,现多彩采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式,一般说来并联泵的流量重现性较好( RSD 为 0.1 %左右,串联泵为 0.2 ~ 0.3 %),但出现故障的机会较多(因多了单向阀),价格也较贵。二、进样器一般 HPLC 分析常用六通进样阀(以美国 RHEODYNE 公司的 7725 和 7725I 型最常见) ,其关键部件由圆形密封垫子(转子)和固定底座(定子)组成。耐高压( 35~ 40MPA ) ,进样量准确,重复性好( 0.5 %) ,操作方便。六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时,进样量应不大于定量环体积的 50 %(最多 75%) ,并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度,而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时,进样量应不小于定量环体积的 5~ 10倍9最少 3倍,这样才能完全置换定量环内和流动相,消除管壁效应,确保进样的准确度及重复性。三、色谱柱色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等,其粒度一般为 3,5,7, 10UM 等,柱效理论值可达 5~ 16万/米。对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效;对于同系物分析,只要 500 即可;对于较难的分离物质对则可采用高达 2万的柱子,因此一般 10~ 30CM 左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到最佳效率,除柱外死体积要小外,不要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起 30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。内部资料第 3页共 13页四、检测器 HPLC 的检测器分为两类:通用型检测器和专用型检测器。 1.通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化,通常采用差分测量法,这类检测器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器等,通用检测器适用范围广,但由于对流动相有响应,因此易受温度变化、流动相和组分的变化的影响,噪声和漂移都比较大,灵敏度较低,不能用梯度洗脱。 2.专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感,而这一性质是流动相所不具备的,或至少在操作条件下不显示。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、放射性检测器等。二、液相色谱的常见问题与维护☆液相色谱中对流动相的要求(1) 溶剂必须纯净,在使用前需经过滤板除去颗粒杂质,必要时在进样口再加一块滤板以除去可能由泵带来的颗粒。(2) 必须控制吸附色谱中溶剂的含水量,过量水会使吸附剂活性降低,溶质保留值下降(3) 如需在一定 pH 值下操作,须定期测定流动相的 pH 值,大气中的 C02 溶解在流动相内将引起 PH 值的改变, 特别是贮液瓶密闭不严时这种影响可能更大(4)软质或半软质填料的溶胀率随溶剂极性的变化而变化,使用新柱时应先用 25— 30倍柱容积的合适动相平衡;更换流动相时,如果两种流动相不互溶,需采用过渡溶剂使前一种流动相逐步溶解消除(例如,2、2、 4-三***戊烷换成甲醇时,必须用乙酸乙酯或其他溶剂过渡,直到标准物保留值达到稳定状态) (5) 为延长不易装填、价格昂贵的高效柱寿命,可在进样器和色谱柱之间安装预柱,对流动相和样品中的颗粒和杂质进行最后的过滤;在填充和连接预柱时,不应有造成谱带变宽、分离度下降的死体积;预柱与色谱柱的体积之比应保持为 1: 15至1: 25,以减少谱带变宽☆关于梯度洗脱 HPLC 有等强度( isocratic )和梯度( gradient )洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定,适合于组分数目较少,性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个周期内程序控制流动相的组成,如溶剂的极性、离子强度和 PH值等,用于分析组分数目多、性质差异罚大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高检测灵敏度,但是常常引起基线漂移和降低重现性。梯度洗脱有两种方式:低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合,即有多种洗脱曲线:线性梯度、凹1
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【求助】冲洗液相泵头的10%异丙醇怎么配置
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这个帖子发布于7年零20天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠，请教一下，安捷伦1100液相冲洗泵头用的10%异丙醇溶液是异丙醇和乙醇1：9配置吗？吗？
不知道邀请谁？试试他们
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10%异丙醇溶液是异丙醇和水1：9
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谢谢楼上的支援
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这个问题，我们上学的时候，俩教分析的老师，一个说90％的是甲醇，一个说90％的是乙醇，俩人争执不下，还为此打了一仗呢，现在又来了个水，三国鼎立，到底是哪个呢。
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异丙醇：水（1：9）
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胡闹，甲醇有毒，甲醇、乙醇都容易挥发，水也容易挥发导致浓度不准。明明应该用异丙醇：浓硫酸=1：9，陶瓷制作的泵头用浓硫酸才能洗净啊，没看洗液都是用浓硫酸配置的么？
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丁香马甲大队队长 胡闹，甲醇有毒，甲醇、乙醇都容易挥发，水也容易挥发导致浓度不准。明明应该用异丙醇：浓硫酸=1：9，陶瓷制作的泵头用浓硫酸才能洗净啊，没看洗液都是用浓硫酸配置的么？洗液里面还加重铬酸钾呢～，而且硫酸粘度太大，不合适我个人认为还是应该用硝酸，虽然挥发一点，但是粘度比较小，比较适合硅胶管里面流动
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这是一个争议很久的问题，为此，CDE网站做了专题讨论，各位可以去搜索一下
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液相使用手册上是有写“异丙醇：甲醇＝1：9”的，但是大多数培训的时候得到的答案是和水的。我也不知道哪个对，但是平时冲管路是用甲醇配制，冲柱子用水。
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不是应该用DMF吗？那个不是万能溶剂吗？我们都是用这个的，难道师父教的一直是错的……
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fashenhuali edited on
什么答案都有，估计楼主都看迷糊了，^_^！首先要看为什么要洗液相的泵头，高压液相色谱的泵一般在压力比较高的条件下运行，当你用到缓冲盐作为流动相时，在高压下盐容易在泵头析出，因此需要及时清洗泵头，以免细小的盐将高压泵的石英杆磨损造成漏液。一般来说泵头的清洗液用水就可以，但是由于水容易长菌，适量加一些异丙醇来达到抑菌的目的，例如10%的异丙醇溶液（异丙醇-水=1：9），我常用甲醇-水=1：9来作为泵头清洗液。
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风之子307 什么答案都有，估计楼主都看迷糊了，^_^！首先要看为什么要洗液相的泵头，高压液相色谱的泵一般在压力比较高的条件下运行，当你用到缓冲盐作为流动相时，在高压下盐容易在泵头析出，因此需要及时清洗泵头，以免细小的盐将高压泵的石英杆磨损造成漏液。一般来说泵头的清洗液用水就可以，但是由于水容易长菌，适量加一些异丙醇来达到抑菌的目的，例如10%的异丙醇溶液（异丙醇-水=1：9），我常用甲醇-水=1：9来作为泵头清洗液。同意8D
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用含10%甲醇的水溶液就行，如果泵的压力过大怀疑有堵得情况就用10%的异丙醇！
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人家楼主说的是泵头在线清洗，当然是用10%的异丙醇 ，异丙醇：水（1：9）
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用水是大多数的操作和经验，但是安捷伦和岛津书上可都是和异丙醇啊。
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关于丁香园高效液相的泵压过低(超声处理,异丙醇,纯水,流动相,缓冲液) - 生物药学 - 生物秀
标题: 高效液相的泵压过低(超声处理,异丙醇,纯水,流动相,缓冲液)
摘要: 大家好 我第一次用高效液相白天做的还好着呢 前门加了点磷酸缓冲液 后来泵压就很不稳定了太低了 没什么峰出来 求助啊这是为什么呢 接头处我检查了 没漏液啊进空气是不是也是这样:hand:网友回复1 滤头堵：浸泡在流动相中的滤头截流的微粒太多了（如果浸在纯水中也可能是长菌了），需要纯水或甲醇超声处理一下。2 单向阀堵：亦需拆下来超声处理。3 泵内有气泡未排净，用大流速运行一段时间应可解决。4 泵后柱前……
大家好 我第一次用高效液相白天做的还好着呢 前门加了点磷酸缓冲液 后来泵压就很不稳定了太低了 没什么峰出来 求助啊这是为什么呢 接头处我检查了 没漏液啊进空气是不是也是这样:hand:网友回复1.滤头堵：浸泡在流动相中的滤头截流的微粒太多了（如果浸在纯水中也可能是长菌了），需要纯水或甲醇超声处理一下。
2.单向阀堵：亦需拆下来超声处理。
3.泵内有气泡未排净，用大流速运行一段时间应可解决。
4.泵后柱前某段管路发生漏液。
5.自动脱气是否运行正常，气泡堵住管路也能导致柱压低。网友回复你用的是自动还是手动，要是自动看看排气时要打开的阀门有没有关好或松动网友回复看看溶剂入口过滤头有没有堵？
主动阀有没有问题
测下的流速是否准确
是否有气泡观察下
看看有没有漏的地方网友回复 引用内容:
1.滤头堵：浸泡在流动相中的滤头截流的微粒太多了（如果浸在纯水中也可能是长菌了），需要纯水或甲醇超声处理一下。
2.单向阀堵：亦需拆下来超声处理。
3.泵内有气泡未排净，用大流速运行一段时间应可解决。
4.泵 ... 非常同意2楼的观点！特别是第2点，在用缓冲盐时经常会出现的！:hand:网友回复堵了，如果前面走的是溶剂，马上去走，就是堵了网友回复假设全部操作都正确的话，可能是有气泡没排干净，或者说泵头脏了。
楼主可以看看是不是洗泵的那个10%异丙醇是不是没了？还是放置时间长了？网友回复1、看一下purge阀是否关闭，
2、你的泵头堵了，拆下来，超声
3、你的管路之中有大量的空气，用专用注射器将液体充满泵及其前面的管路
4、查看管路或检测器是否漏液
如以上均排除，请致电工程师。其实液相问题均可以找工程师解决。网友回复单向阀堵：亦需拆下来超声处理网友回复应该是缓冲盐析出把柱堵了网友回复 引用内容:
堵了，如果前面走的是溶剂，马上去走，就是堵了 我靠，V587！:D网友回复 引用内容:
假设全部操作都正确的话，可能是有气泡没排干净，或者说泵头脏了。
楼主可以看看是不是洗泵的那个10%异丙醇是不是没了？还是放置时间长了？ 我靠，V587!:D网友回复 引用内容:
我靠，V587!:D... 难道我被你认出来了么？这么快啊网友回复单向阀堵的现象是压力不稳网友回复 引用内容:
你用的是自动还是手动，要是自动看看排气时要打开的阀门有没有关好或松动 那天阀门没拧紧 嘿嘿 谢谢了:hand:网友回复你把每一个滤头依次拿出流动相看看，有空气进去么？是不是没有液体流出来了，这个很简单，别担心啊，首先用水过度一下，接二通过异丙醇，如果还是不行就拆单向阀吧，哈哈，最后只有换泵里面的垫圈了，希望不要吧，问题不大，放心吧网友回复 引用内容:
你把每一个滤头依次拿出流动相看看，有空气进去么？是不是没有液体流出来了，这个很简单，别担心啊，首先用水过度一下，接二通过异丙醇，如果还是不行就拆单向阀吧，哈哈，最后只有换泵里面的垫圈了，希望不要吧，问 ... 恩恩
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