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核磁共振谱在药物定量分析中的应用研究
核磁共振谱在药物定量分析中的应用研究项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心 项目完成人：贺文义1、核磁共振 1H 谱检测康爱新生素胶囊甲基素的含量方法建立药物胶囊是常用药物剂型的一种， 通常对其中主要成分的检测是用色谱法或化学 滴定等方法，比较费时和费力，康爱新生素胶囊中主要成分为甲基素。根据该化合物 的 1H 谱特征峰，用
TMS 为外标（1‰ TMS /CDCL3） ，甲基素为内标，取胶囊 5 粒， 将内空物充分混合， 定量称取五份 （10±mg）用 1ml CDCL3 溶解，温控 25℃，D1=15 秒，nt=8 测试 1H 谱，经积分后按公式计算出胶囊中主要成分的含量。 实验方法：取胶囊五粒，将内容取出充分混合，将定量称取五份（±10mg）,每 份用 1 ml CDCL3 溶解， 温控 25℃， 1=15 秒， D nt=8 测试 1H 谱。 另称取甲激素±10mg 在相同条件下测试 1H 谱，图谱以 TMS 为内标积分值定为 10，δ 1.31 峰作为基准以 其积分值计算甲激素含量。 计算公式：C=Ma0/Sa0=10.01/83.22=0.12 注：M=样品量（mg） Ma= Sa×C Sa=特征峰面积积分 甲激素在胶囊中的含量=MA/M×100%2．用 HPLC-NMR 联用技术鉴定同分异构体羧基荧光素（caboxvfluorescein）是荧光素衍生物的一种，其产品中同时含有 5-FAM （caboxyfluorescein-5-succimidyl ester） 6-FAM 和 （caboxyfluorescein-6-succimidyl ester） ，5-FAM 较 6-FAM 更经常使用。其广泛存在于荧光标记试盒，用于 DNA 自动 测序。本品采用 Varian 公司的 Prostar-230D2O，CH3OH（0.1%冰醋酸） ，其洗脱比例 70:30，流速为 1ml/min，检测器为 Varian Prostar-330 二极管振列检测器，紫外检测波 长为 242nm。 测得保留时间 10.466m,11.906m 两个峰。 LC-MS 所得到分子量均为 376。 在 INOVA-500 LC-NMR 上，用停止流动的方法采集 LC-NMR 1H 谱。进样量为 25 ?l （2mg/200 ?l） ，1H 谱采样时间为 1.5 s，累加次数为 256。通过 1H 谱分析,确定保留 时间 10.466min 为 6-FAM,11.906min 为 5-FAM.混合物 1H LC-NMR 谱图。29OH5O6O OHOOOHb5O6OH OOHOOOH图 1. 羧基荧光素混合物 1H LC-NMR 谱 a.tR=10.5min,b.tR=11.9min3、 高分辨魔角核磁共振技术定量跟踪 N?-Fmoc 保护的羟基氨基酸的糖基化 反应1）概述 九 十 年 代 初 发 展 的 高 分 辨 魔 角 核 磁 共 振 技 术 (High resolution magic spinning(HR/MAS)NMR)采用魔角旋转消除非均相溶液中磁化率不同而造成的谱线加宽。 另外特殊设计的超微量探头(gHX Nano Probe)与常规的高分辨液相探头不同， 体积很小的 样品(40?L)可以 100%地保持在检测线圈内， 填充因子高， 样品管和塞子磁化率匹配性好， 致使磁化率的不连续性达到最小，从而得到最高灵敏度和最小线宽的 NMR 谱图。该技 术不破坏样品，可灵敏、直接地提供偶联在树脂上化合物的结构信息。目前，广泛用于 监测固相合成反应；鉴定固载在单一树脂珠上化合物的结构；以及分析树脂上固载化化 合物的构象等等。 该项目首先探讨了不同常规树脂、不同溶剂以及温度对高分辨魔角核磁共振技术中 1H NMR 线宽的影响，然后利用该技术指导优化 N?-Fmoc 保护的羟基氨基酸固相糖基化 反应的条件，并利用该技术定量研究不同 N?-Fmoc 保护羟基氨基酸的固相糖基化反应。 固相组合合成糖肽库是十分热门的研究领域。该项目将 N?-Fmoc 保护的羟基氨基酸 偶联到 Teata Gel S NH2 树脂上，再在过量的乙酸化糖三氯亚氨酯供体和 BF3. Et20 的催 化条件下进行固相糖基化反应。用 HR/MAS NMR 分析技术不仅跟踪优化了固相羟基氨 基酸的糖化反应条件，而且选择固载在树脂上的糖基化 N?-Fmoc 保护羟基氨基酸 1H30NMR 中最低场，且分辨好的 Fmoc 保护基信号做为内标，糖上乙酸基的积分面积为标准 直接定量了键合在 Teata Gel S NH2 树脂上氨基酸苷化的产率。利用四个羟基未保护的 N?-Fmoc 氨基酸和七种全乙酰化糖为原料，合成了 28 个糖基化 N?-Fmoc 氨基酸，均用 高分辨魔角核磁共振技术定量。该研究为进一步合成“一株一化和物”的糖肽库打下了 坚实的基础。 2）结果与讨论 A 树脂、溶剂和温度对 1H NMR 线宽的影响 有机合成中使用的固相载体有赖于两个相互关联的部分： 不溶解但可溶胀的高聚 ① 物材料，并且该材料对合成中使用的条件是惰性的；② 将底物与以上固相载体相连，并 利于中间体和终产物从固相载体上全部切下来的不同连接桥分子片段。研究表明固相载 体的氢谱主要由线宽衡量。本文将 Fmoc-L-Ser(OtBu)-OH 偶联到具有相同的交联聚苯乙 烯高聚物核心，五种不同连接桥分子片段的树脂上(Rink，Rink MBHA，Tenta Gel S NH2， Wang，Trityl)，分别检测它们在 CDCl3 中的氢谱。选择在高场δ 1.00 左右易于被识别的 特丁基上的甲基信号作为标准，测定甲基信号的线宽来比较不同连接桥片段对氢谱的影 响。Figure 1 为五种不同树脂的连接桥片段结构、氢谱及甲基信号的半峰线宽。谱图中都 观察到了交联聚苯乙烯聚合物和连接桥片段分子的多重宽带共振信号。连接在不同树脂 上 Fmoc-L-Ser(OtBu)-OH 的甲基信号线宽差别较大。Tenta Gel S NH2 树脂有较长的聚乙 二醇边链，使得固载化的化合物具有相对最好的流动性，甲基信号的线宽最窄(半峰线宽 ?10Hz)。Rink，Rink MBHA，Trityl 树脂连接桥片段结构复杂，连接桥短，而且负载量高， 限制了固载化分子的运动，图谱质量较差，半峰线宽大于 25Hz。Wang 树脂连接桥片段 结构相对简单，甲基信号的半峰线宽为 11.94 Hz，图谱质量有一定的改善。另外对 Tenta Gel S NH2 树脂?3.55 处的聚乙二醇边链信号进行预饱和可以大大改善图谱的质量，不仅 能压制连接桥分子片段的信号和旋转边带，而且由于自旋扩散作用使高聚物聚苯乙稀的 信号也降低，氢谱基线平，谱线更窄，分辨率更高(Figure 1 ③,④)。31① Linewidth at 50%=29.41FmocHN O O NH O HN O OCH 3 Knorr OCH 3FmocHN O② Linewidth at 50%=25.13OO NH OCH 3RinkOCH 3③Linewidth at 50%=5.71O O O n N H O NHFmocTenta Gel S NH2④ Linewidth at 50%=7.91O O O n N H O NHFmocTenta Gel S NH2⑤ Linewidth at 50%=11.94O O O O NHFmocWang32⑥ Linewidth at 50%=56.58OO O NHFmocTritylFigure 1. 五种不同树脂的连接桥片段结构、氢谱及甲基信号的半峰线宽① Rink Resin, ② Rink MBHA Resin, ③ Tenta Gel S NH2 Resin, ④ Tenta Gel S NH2Resin(Presaturated at δ 3.55), ⑤ Wang Resin, ⑥ Trityl Resin除此之外，溶剂的选择也很重要。本文以偶联 Fmoc-L-Ser(OtBu)的 Tenta Gel S NH2 树脂为标准， 考察了五种不同的溶剂(CDCl3, DMF-d7, DMSO-d6, CD3OD, D2O)对 Tenta Gel S NH2 树脂上 Fmoc-L-Ser(OtBu)的甲基信号线宽的影响。发现 Tenta Gel S NH2 树脂在 CDCl3, DMF-d7, DMSO-d6 中透明，甲基信号的线宽分别为 7.91Hz, 5.92Hz, 6.08Hz，说明 这三种溶剂在 Tenta Gel S NH2 树脂上对 1H NMR 的影响区别不大。Tenta Gel S NH2 树脂 在 CDCl3 和 DMF-d7 中溶胀因子高，而 DMSO-d6 能较好地使聚乙二醇边链柔韧，改善了 固载化分子的流动性，故都得到了相对最窄的线宽。其中 CDCl3 便宜，易于除去和便于 回收样品，且溶剂峰单一，不易吸潮，常被选作溶剂。Tenta Gel S NH2 树脂在 CD3OD 中 的溶胀效果虽然一般, 但仍能够使聚乙二醇边链柔韧性增加， 致使甲基信号的半峰线宽为 10.09Hz。在 D2O 中溶胀效果最差，显白色颗粒，未得到相关图谱。 以 CDCl3 为溶剂测定偶联 Fmoc-L-Ser(OtBu)的 Tenta Gel S NH2 树脂在三种不同温度 的氢谱时发现，在 5℃，25℃，40℃的条件下，Tenta Gel S NH2 树脂上 Fmoc-L-Ser(OtBu) 的甲基信号半峰线宽分别为 7.54Hz, 7.91Hz, 7.31Hz, 说明温度对偶联在 Tenta Gel S NH2 树脂上的化合物在 CDCl3 中氢谱影响不大。经验表明，旋转速度在 2KHz 左右可以提供 最好的谱图。 B N?-Fmoc 保护羟基氨基酸的固相糖基化反应(1) 直 接 用 全 乙 酰 化 糖 甙 化 Fmoc-Thr(OH)-CONH-TG “一珠一化合物” 组合化学既能在短时间内合成数目庞大的化合物， 同时这种树脂珠 -化学库的方式又可同时直接用于多种不同的筛选形式，包括液相筛选法和固相筛选法。 Tenta Gel S NH2 树脂在水和有机溶剂中均能较好地溶胀，并且单个树脂珠的大小和载量33均一，树脂珠没有粘性，是固相筛选中常用的树脂。本研究的目的是为了构建“一珠一 化合物”组合糖肽库，故选用了固相筛选中常用的 Tenta Gel S NH2 树脂。 采用常规的 Fmoc 策略将 Fmoc-L-Thr(OH)-OH 偶联到 Tenta Gel S NH2 树脂上(合成路 线见 Figure 2)，直至茚三酮检测为阴性。在 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG 的 1H NMR 中， δ 7.29-7.76 为 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG 中 Fmoc 芳环上的质子信号，δ 1.15 为 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG 中 Thr 的甲基质子信号， 它与邻位连氧质子偶合裂分成双峰， 偶合常数为 6.0Hz，说明 Fmoc-L-Thr(OH)-OH 偶联到树脂上。一个好的糖基化反应，需 要考虑以下指标：① 端基构型立体选择性；② 产率；③ 区域选择性；④ 供体易于制 备、纯化和储存；⑤ 操作简便。由于全 乙 酰 化 糖 商 业 易 得 ， 为 了 减 少 反 应 步 骤 ， 便 于 大 规 模 的 合 成 糖 肽 库 ， 本文最初尝试以全 乙 酰 化 糖 为 起 始 原 料 ， 并以 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG 为模型，考察了使 用 BF 3 .Et 2 O(10eq.)为 促进剂，六 种 不 同全 乙 酰 化 糖 (10eq.)(结 构 式 见 Figure 3)甙 化 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG 的产率(见 Table 1)。从 Table 1 可知这六种糖的甙化产率都很低，并且常见乙酰基迁移的副反应。因 而这种方法不适合“一珠一化合物”糖肽库的构建。OH O OH NHFm ocHOBt(3eq.) BOP(3eq.)OH O N H NHFm oc+H2N+OAc AcO O AcODIEPA(6eq.)OAc OACBF3.Et2O(20eq.)OAc AcO O AcO O OAcOAc O O N H NHFm oc+N H NHFm ocFigure 2. 使 用 全 乙 酰 化 糖 甙 化 Fmoc -Thr(OH)-CONH -TG 的 合 成 路 线 .OAc AcO AcO O OAc OAc AcO AcOOAc O NHAc OAcAcO OAc O AcO O OAc AcOOAc O OAc OAc?-D-Glucose pentaacete?-D-Glucosamine pentaacete?-D-Lactose octaacete34OAc OAc AcO AcO OAc O AcO OAc AcO OAc O OAc OAc AcO AcO O OAc OAc O AcO O OAc OAc?-D-Mannose pentaacete?-D-Galacoe pentaacete?-D-Maltose octaaceteFigure 3. 六 种 不同全 乙 酰 化 糖 的 结 构 Table 1. 使用 BF 3 .Et 2 O 为 催化剂甙 化 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG Entry 1 2 3 4 5 6 Fmoc Amino Acid Fmoc-Thr-OH Fmoc-Thr-OH Fmoc-Thr-OH Fmoc-Thr-OH Fmoc-Thr-OH Fmoc-Thr-OH Peracetated Carbohydrate (10eq.) Glu Gal Man GluN Lac Mal Solvent CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 Reaction Time (h) 3 3 3 3 3 3 Yield (%) 59 57 25 0 31 17(2) 三氯亚胺酯法甙化固载在 Tenta Gel S NH2 树脂上 N?-Fmoc 保 护 羟 基 氨 基 酸 通常影响糖基化的因素包括：供体(donor)、受体(acceptor)、促进剂(promoter)和反应 条件(如溶剂、温度、反应时间等)。三氯亚胺酯介导的糖基化反应首先由 Schmidt 提出， 故又称之为 Schmidt 法。在甙元与糖链的偶联研究中，经常使用乙酰基保护的三氯亚胺 酯作为供体。本文以全 乙 酰 化 糖 为 原 料 ， 依 照 常 规 的 液 相 合 成 方 法 ， 制 备 乙酰 基保护的三氯亚胺酯供体(Figure 4)。文献报道乙酰基保护的岩藻糖三氯亚胺酯供体，使 用 BF 3 .Et 2 O 为 促进剂时，可得到理想的收率。以乙酰基保护的岩藻糖三氯亚胺酯供体 甙化 Fmoc-L-Thr(OH)-CONH-TG 为模型，优化了糖基化反应条件(反应时间、温度、促 进剂和供体的配比)。Table 2 为不 同 配比的 BF 3 .Et 2 O(10eq.)对产率的影响。从 Table 2 可知： 反应中使用 20 倍过量的 BF 3 .Et 2 O 可 得 到 理 想 的 收 率 ， 一 步 提 高 BF 3 .Et 2 O 进 的 量 ， 反 应 产 率 反 而 降 低 。 最后选用糖基化反应操作条件为：偶联 N?-Fmoc 保 护 羟 基 氨 基 酸 的 Tenta Gel S NH2 树脂和糖三氯亚胺酯供体(10eq.)经冷冻干燥过夜后，加 入 适 量 的 无 水 二 氯 甲 烷 ， 在 氩 气 保 护 下 树 脂 溶 胀 30min 。 然 后 在 冰 盐 浴 下 加 入 BF3.Et2O(20eq.)，反应 3 小时后，终止反应。本文共考察了四种不同的 N?-Fmoc 保 护 羟 基 氨 基 酸 (Thr, Ser, Tyr, Hyp) 分 别 与 七 种 糖三氯亚胺酯供体固相糖基化反应。35Figure 5 为 Fmoc-Thr(OH)-CONH-TG 与全乙酰化的半乳糖三氯亚胺酯糖基化反应的合成 路线。OAc O AcO AcO OAc AcO AcO OAC AcO O OC(NH)CCl3 AcO AcO OAc O AcO AcO OAc O1OC(NH)CCl323OAc OC(NH)CCl3NHAc4OC(NH)CCl3OC(NH)CCl3 O OAc AcO OAcAcO OAc O AcO O OAc AcOOAc OAc O OAc O AcO AcO OAc OC(NH)CCl3 O O AcO OAc567OAc OC(NH)CCl3Figure 4.固相合成 O-glycoylated Fmoc-AA(OH)-TG.使用的三氯亚胺酯供体HOO OH NHFmoc + H2NHOBt(3eq.) BOP(3eq.) NMM(6eq.)HOO N H NHFmocAcO OAc AcOO OAc O HN (10eq.) CCl3 +HOO N H NHFmoc BF3.Et2O(20eq.) CH2Cl2AcO OAc AcOO OAcOO N H NHFmocFigure 5. Fmoc-Thr(OH)-CONH-TG 与全乙酰化的半乳糖三氯亚胺酯糖基化反应的合成路线Table 2. 以乙酰基保护的岩藻糖三氯亚胺酯供体甙化 Fmoc-Thr(OH)-CONH-TG. Entry 1 2 3 4 5 Trichloroacetimidate donor (10eq.) Fuc Fuc Fuc Fuc Fuc BF3.Et2O (eq.) 5 10 20 30 50 Solvent CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 CH2Cl2 Reaction Time (h) 3 3 3 3 3 Yield (%) 32.7 25.9 79.4 56.9 25.3C 高分辨魔角核磁共振技术定量跟踪 Nα -Fmoc 保护羟基氨基酸固相糖基化反应 我们已系统研究了 5 种不同树脂和 5 种不同溶剂对 1H 谱线宽的影响， 结果表明固相 合成中 NMR 图谱的质量主要依赖树脂的种类和溶剂。 Tenta Gel S NH2 树脂以聚苯乙烯为36核心， 具有较长的聚乙二醇边链， 能够提供好的流动性， 而氯仿即能较好的溶胀 Tenta Gel S NH2 树脂又能溶解键合在树脂上的糖肽，有利于得到高质量的图谱。在 HR/MAS NMR 实验中，采用了预饱和技术，对聚乙二醇边链(PEG)信号(?3.55)进行预饱和照射不仅能压 制连接桥分子片段的信号和旋转边带，而且由于自旋扩散作用使树脂核心聚苯乙稀的信 号也大大降低，氢谱基线平，谱线窄，分辨率很高。 在研究固相羟基氨基酸的糖基化反应过程中，首先用茚三酮检测，并结合 HR/MAS NMR 确定 Nα -Fmoc 保护羟基氨基酸定量地偶联到 Tenta Gel S NH2 树脂上。再用 HR/MAS NMR 技术直接定量键合在 Tenta Gel S NH2 树脂上氨基酸甙化产率。 使用有机碱 洗净并干燥树脂(如 TEA、DIPEA、NMM)是成功获得高质量图谱的关键因素之一。可能 的原因是残留的路易斯酸(BF3)影响图谱的质量。在 Fmoc-L-Thr(Ac4-?-D-Gal)-CONH-TG 的 1H NMR 中(Figure 6)出现了半乳糖的相关信号。 4.66(1H, d, J=7.5Hz)为半乳糖端基质 δ 子。因偶合常数为 7.5Hz，说明该糖基化反应是立体选择的反应，只生成β 构型的产物。 δ 5.18(1H, t, J=9Hz)， 5.06(1H, d, J=10.5Hz)分别为半乳糖 2 位和 3 位上的质子， 2.00， δ δ 2.03 ， 2.06 ， 2.16 为 半 乳 糖 上 四 个 乙 酰 保 护 基 上 的 甲 基 质 子 。 另 外 Fmoc-L-Thr(Ac4-?-D-Gal)-CONH-TG 上的甲基质子因甙化向高场位移，从而表明四乙酰 基保护半乳糖与固载在 Tenta Gel S NH2 树脂上苏氨酸发生了偶联反应。本文选择在最低 场，且分辨好的 Fmoc 保护基(起始原料)信号作为内标，半乳糖上四个乙酰基的积分面积 为标准，计算公式为：产率=I2/6×I1。I2 表示糖上四个乙酰基的积分面积，I1 为 Fmoc 保 护基上两个质子的积分面积(Figure 6)，产率为 95.7%。依次类推：①具有四个乙酰基保 护的三氯亚胺酯(Glu、Man、Gal 和 GluN)分别与固载化的 Thr、Ser 和 Tyr 偶联的产率= I2/6?I1；②具有三个乙酰基保护的三氯亚胺酯(Fuc)分别与固载化的 Thr、Ser、Tyr 偶联的 产率= 2?I2/9?I1；③具有七个乙酰基保护的三氯亚胺酯(Lac 和 Mal)分别与固载化的 Thr、 Ser、Tyr 偶联的产率=2?I2/21?I1；由于羟脯氨酸的亚甲基信号与糖上的乙酰基重叠，此时 选择易于归属的端基质子(H3)积分面积为标准，计算公式为：产率=2?I3/I1。I3 表示糖上 端基质子的积分面积，I1 仍然为 Fmoc 保护基上两个质子的积分面积(Figure 7)。本项目共 选择了四个羟基未保护的 N?-Fmoc 氨基酸和七个全乙酰化糖为原料，合成了 28 个糖基 化 Nα -Fmoc 羟基氨基酸，并且均用该法定量(Figure 8)。37H2AcOOAc O O N H O H2 CH3COx4: δ 2.16, 2.06, 2.02, 2.00(12H, I2=11.48) H1 Fmoc: δ 7.77(2H, I1=2.00) Yield=I2/6xI1=11.48/6x2.00=95.7%H1AcOO OAc HNH2OH1Figure 6. Tetra-O-acetyl-β -D-galactopyranosylated Fmoc-Thr-CONH-TG 的高分辨 魔角核磁共振氢谱及 H1 和 H2 质子信号的归属.OAC AcO AcO OAc OH3 2-H: δ 4.92(1H, I3=0.30) H1 Fmoc: δ 7.72(2H, I1=2.00) Yield=2xI3/I1=2x0.30/2.00=30%H1HOH3N O OO N HH1H3Figure 7. Tetra-O-acetyl-α -D-mannopyranosylated Fmoc-Hyp-CONH-TG的高分辨 魔角核磁共振氢谱及H1 和 H3质子信号的归属OAc O AcO AcO O OO O AcO OAc O OAc N H NHFmocAcOOAc OAc O O O O OAc N H NHFm oc8N H NHAc NHFmoc GluN-Thr Yield: 0%AcO OAcO AcO9 Fuc-Thr Yield: 79.4%10 Lac-Thr Yield: 61%38OAcAcOAcO AcO O O OAc O N H NHFmocOAc O O O N H OAc NHFmoc Gal-Ser Yield: 96.7%AcO AcOOAC AcO O O O N H NHFmocAcO11 Glu-Ser Yield: 99.6%O O AcO OAc O OAc N H NHFmoc1213 Man-Ser Yield: 68%AcO OAcOAc AcO AcO O O O N H NHAc NHFmoc GluN-Ser Yield: 8%OACOAc O O OAc AcO O O OAc O N H NHFmocAcO14 Fuc-Ser Yield: 52.8%16 Lac-Ser Yield: 106%15OAc AcO AcO O O OAc O N N Fmoc HOAc O AcO AcO O OAcO AcOOAc O O OAc O N N H Fmoc17 Glu-Hyp Yield:43%19 Gal-Hyp Yield: 68%18 Man-Hyp Yield: 30% NOAc AcO AcO O O NHAcO O OAcN Fmoc HAcO OAcOAc O O OAc AcO O O OAc O N N Fmoc HOAcOO N N Fmoc HAcO AcO20 GluN-Hyp Yield: 0%N N Fmoc H 21 Fuc-Hyp Yield: 89%22 Lac-Hyp Yield: 24%OAc O AcO AcO OAc O OAcO AcOOAC OAc OAcO OAc O AcOOO OAc O23 Glu-Tyr Yield: 92.3%N H NHFmocO24 Man-Tyr Yield: 99.8%FmocHN N H25 Gal-Tyr Yield: 101%N H NHFmocOAc O AcO AcO NHAc O OO AcO AcOO OAcAcO OAcONH NHFmocO AcO O OAcAcOOAc O O OAc O N H NHFmoc26 GluN-Tyr Yield: 0%N H NHFmoc27 Fuc-Tyr Yield: 74.9%28 Lac-Tyr Yield: 95.8%OAc AcO AcO O O OAc AcOOAc O O OAc O N H NHFmocAcO AcO OAc O O OAc AcO OAc O O OAc O N H NHFmoc29 Mal-Tyr Yield:95.3%30 Mal-Thr Yield: 51.6%OAc AcO AcO O O OAc AcOOAcOAc O O OAc O N H NHFm ocOAc O O OAc AcO O O OAc O N N Fmoc HAcO AcO31 Mal-Ser Yield: 52.4%32 Mal-Hyp Yield: 9%Figure 8. O-glycosylated Fmoc-AA(OH)-CONH-TG 和收率393）结论 本项目首先探索了不同常规树脂、不同溶剂以及温度对 HR/MAS NMR 谱线宽的影 响。研究表明：树脂和溶剂是影响 1H NMR 关键因素，Tenta Gel S NH2 树脂有较长的聚 乙二醇边链，具有较好的柔韧性和流动性，可以得到最好的谱图。在 HR/MAS NMR 实 验中，对 Tenta Gel S NH2 树脂的聚乙二醇边链信号(?3.55)进行预饱和照射不仅能压制聚 乙二醇自身的信号，而且大大降低树脂核心聚苯乙稀的信号和旋转边带。以聚苯乙烯为 核心的树脂在 CDCl3 中溶胀较好，并且 CDCl3 便宜，易于除去，常用作溶剂。温度对固 载化化合物在 CDCl3 中的 1H NMR 影响较小。经验表明，旋转速度在 2KHz 左右可以提 供最好的谱图。 高分辨魔角核磁共振是组合化学中有用的分析工具，可以跟踪固相有机合成反应， 快速、直接地提供连在树脂上化合物的结构信息，指导反应条件的优化。它能直接简便 地定量反应的产率，而这种分析方法恰恰在常规液相合成中很难实现。选择四个羟基未 保护的 N?-Fmoc 氨基酸和七种全乙酰化糖为起始原料，首先液相合成乙酰基保护的糖三 氯亚氨酯供体，然后将 Nα -Fmoc 保护羟基氨基酸偶联到 Tenta Gel S NH2 树脂上，再用 过量的糖三氯亚氨酯供体，在 BF3.Et2O 的催化条件下实现固相糖基化反应。用 HR/MAS NMR 分析技术不仅跟踪优化了固相羟基氨基酸的糖基化反应条件， 而且直接定量了键合 在 Tenta Gel S NH2 树脂上氨基酸甙化的产率。研究表明：① 固相合成 Gal-Thr、Glu-Ser、 Gal-Ser、Lac-Ser、Glu-Tyr、Man-Tyr、Lac-Tyr、Mal-Tyr 产率超过 90%。这些糖和氨基 酸的组合可以直接用于 “一珠一化合物” 糖肽库的合成。 固相合成 Glu-Thr、 ② Man-Thr、 Fuc-Thr、Lac-Thr、Man-Ser、Fuc-Ser、Gal-Hyp、Fuc-Tyr、Mal-Ser 产率在 50%~80%， 这些糖和氨基酸的组合有待进一步优化。 除了固相合成 Fuc-Hyp 和 Gal-Hyp 产率分别 ③ 为 89％和 68%，羟脯氨酸与其它乙酰基保护的糖三氯亚氨酯供体的甙化产率都很低。该 研究是进一步合成“一珠一化合物”的糖肽库的前期研究工作。附：发表论文 1 LC－NMR 技术在同分异构体鉴定中的应用研究，在第十三届全国波谱学术年会 Solid-phase -219 投稿，2004 年 8 月，乌鲁木齐。 2 Nian-Huan Yao, Wen-Yi He, Kit S. Lam, Gang Liu, Synthesis of O-glycosylated Fmoc protected amino acids and analysis by the High Resolution Magic Angle Spinning NMR(HR/MAS NMR), J. Comb. Chem.40君，已阅读到文档的结尾了呢~~
圣云蓝莓果中锦葵色素-3-半乳糖苷的结构鉴定
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如题啊！在一个黄酮苷的核磁谱中如何区分葡萄糖和半乳糖啊？求大家帮帮忙啊
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B一1,4一半乳糖基转移酶抑制剂的设计合成及氨基糖衍生物二丁基锡配合物的合成摘要细胞表面的糖和糖复合物参与许多重要生命现象,例如细胞识别,代谢,免疫反应等。因此选择性的抑制参与细胞表面寡糖合成的糖基转移酶的活性则有可能为治疗与这些糖介导的有关疾病提供新型的先导治疗化合物。人们应用了不同的策略来试图发现糖基转移酶的潜在抑制剂,其中最重要的是设计受体类似物、供体类似物以及过渡态类似物。本文选择目前研究相对较为透彻p一1,4-半乳糖基转移酶(p—l,4-galactosyltmsferaSe,13-1,4-GaIT)作为模型体系。p一1,4-GaIT的主要功能是在高尔基体上负责将半乳糖苷基团从UDP一半乳糖苷转移到N一多糖复合物的末端N-_乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上,形成p一1,4一糖苷键。目前,虽然已有p一1,4-GaIt的三维晶体结构,但是其具体的作用机理和抑制位点尚不是十分明确。所以本文在综述近年来B一1,4-GaIT抑制剂的研究进展和合成方法的基础上,参考前人做的大量工作以及根据文献报道的人们所推测的B一1,4-GaIT抑制剂的构效关系,设计并合成了B一1,4-GaIT的受体类似物和供体类似物,以期发现高效专一的p一1,4-GaIT抑制剂,进而对了解和推测B一1,4-GaIT相应生物靶点的结构和功能,发现潜在的新型预防和治疗药物有所帮助。本文第二章中设计合成了B.1,4-GaIT的受体类似物,第三章设计合成了p.1,4-GaIT的供体类似物作为B.1,4-GaIT抑制剂的先导化合物。另外,本文在第四章中还设计合成了氨基糖衍生物的二丁基锡配合物,并对其作了体外抗肿瘤活性研究和造血细胞毒性研究。本论文的具体内容:1.由于B一1,4一半乳糖基转移酶对受体底物的识别并不具有非常严格的特异性,且与脂肪链或糖链相比,其受体结合位点更倾向于与大体积的、芳香性的基团结合。因此,设计合成了一系列通过氨基酸连接臂在受体糖(N一乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖)上引入芳香性基团的化合物作为13-1,4-半乳糖基转移酶的受体类似物。用红外光谱、核磁共振氢谱、质谱对上述化合物进行了结构确证,并对部分反应机理进行了探讨。对所合成的化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。2.将焦磷酸、尿苷进行修饰或替换也正成为糖基转移酶抑制剂的一种新的设计思路,因此去掉焦磷酸结构,根据电子等排原理以具有较好生物活性的5一***脲嘧啶替换尿嘧啶,它们之间的连接臂为6—7个C—C单键键长,以期与核糖提供的糖与碱基之间6个c.c单键键长间距相吻合,设计合成了B.1,4-GaIT的供体类似物。所合成的化合物均为新化合物,未见文献报道,应用红外光谱、核磁共振谱、质谱对它们进行了结构确证。对所合成的化合物进行了体外抗肿瘤活性测试,并对构效关系进行了初步探讨。对不同氨基与五***脲嘧啶乙酸的反应进行了探讨。3.应用拼合原理,将对肿瘤细胞具有较好的杀伤作用,而对人体正常细胞毒性很小的D一氨基葡萄糖衍生物与氧化二正丁基锡反应合成了两个新的有机锡(Ⅳ)羧酸酯类化合物1、2,并经红外光谱(ⅡD,核磁共振(1HNMR,MR)谱学研究,初步确定了其结构。体外抗肿瘤活性结果表明,化合物1对人肺癌细胞株彳—黝和人肝癌细胞株BEL一刀馏显示出较强的细胞毒活性,为强效;而对小鼠白血病细胞株只Z船和人白血病细胞株HL-60显示弱的细胞毒活性,为弱效。化合物2对肿瘤细胞株HL-60.爿一5卯和觑一7402显示出较强的细胞毒活性,为强效;而对肿瘤细胞株,。388作用则稍低,为弱效。克隆基因分析表明化合物1、2均具有相对较低的造血细胞毒性。关键词:B-1,4-半乳糖基转移酶抑制剂;受体类似物;供体类似物;有机锡羧酸酯;抗肿瘤活性DesignandsynthesiSofB一1.pIexesofaminogIucosedervativesAbstractCellsurfacecarbohydratesserveaskeyelementsinvariousmolecularrecognitionprocess,includingbacterialandviralinfections,celladhesionininflamemationandmetastasis,immuneresponse,differentiation,development,municatinandsignaltransductionevents.Selectiveinhibitionoftheenzymes,suchasglycolsyltransferases,thatareinvolvedinthesynthesisofcell—haridesisthusofinterestasitmayleadtothedevelopmentofnewtherapeuticagents.Todate,however,onlylimited$uccessshasbeenachievedindevelopinginhibitorsofglycolsyltransferases.eptoranalogues,donoranalogues,transitionstateanalogues.Thedevelopmentofglycolsyltransferasesinhibitorsbringsgreatinterest.B一1,4一GaIThavebeenchosenasamodelsystem.Todate,[3-1,4-GaITisoneofthemostextensivelystudiedandcharacterizedglycolsyltransferases.3-1,4-GaITisanenzymethattransferrsgalactosefromuridine一5’-diphosphogalactose(UDP—Gal)tothe4-OHofterminalN-acetylglucosamine(lucoseresidues.Thisgalactosyltransferaseisofbiologicalandmedicinalinterestasitinvolvedinthebiosynthesisofmanycell—haridestructuressuchasbloodgroupantigensandsialylLewisX.IncreaseordecreaseinD.1,4-GaITactivityhasbeenassociatedwithdiseasestatessuchasarthritisandcancer.Interestingly,13-1,4-GaITcanalsoactasacellsurfacerecaptorandisknowntobeimportantforfertilizationanddevelopmentinmammals.Basedolltheproposedtransitionstateofp一1,4-GaiT,Wehavesynthesizedtwoser1
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