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【求助】荧光显微镜观察GFP
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这个帖子发布于4年零246天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近再做慢病毒相关实验，用荧光显微镜观察转染GFP的细胞，感觉拍照效果很不好，晚上看的GFP的图片的背景都是黑色的，这样看起来GFP就特别突出，但是我的背景就是有绿色，这方面我是新手，又没有其他老师教，所以想请教下大家，是不是我倒置荧光显微镜设置错了，还是有其他原因，希望有这方面经验的高手能挤出点你们宝贵的时间帮帮我，万分感谢！这是我的图片
不知道邀请谁？试试他们
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没做过这个实验，不过，从这张图上看，你的染料染出来是绿色荧光吧？背景的绿色应该是染料的散射光或者这个波段细胞本身有绿色光。如果是散射光，可以用降低曝光强度和稀释染料来调节；如果细胞有荧光，就要用背景消除剂。建议你先降低一下曝光强度，再试一下稀释染料看看。还有种方法就是强制调黑平衡（不知道你的软件有这个功能没有，就是把你认为是黑的地方用黑色显示），不过这种方法会改变某些细节，如果要对图片进行后续分析的话可能会造成偏差。
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shuangrenmu 没做过这个实验，不过，从这张图上看，你的染料染出来是绿色荧光吧？背景的绿色应该是染料的散射光或者这个波段细胞本身有绿色光。如果是散射光，可以用降低曝光强度和稀释染料来调节；如果细胞有荧光，就要用背景消除剂。建议你先降低一下曝光强度，再试一下稀释染料看看。还有种方法就是强制调黑平衡（不知道你的软件有这个功能没有，就是把你认为是黑的地方用黑色显示），不过这种方法会改变某些细节，如果要对图片进行后续分析的话可能会造成偏差。谢谢
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调一下曝光时间和对比度。普通的ADsee就可以编辑~~试试吧。注：我不是托啊
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荧光照片调曝光强度和通常说的调曝光时间和对比度是不一样的。比如LZ的照片减小了曝光强度之后现在看来比较浅的那些绿色就会看不见，显示为黑色。而用图片编辑软件处理后那些地方还是绿的，起不到作用。
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把白光全部关掉，只用蓝光激发试一试
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丝竹乱 调一下曝光时间和对比度。普通的ADsee就可以编辑~~试试吧。注：我不是托啊
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qst1981 把白光全部关掉，只用蓝光激发试一试我看荧光的时候是用盖子把上面挡住，这样白光不是被遮住了么
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shuangrenmu 荧光照片调曝光强度和通常说的调曝光时间和对比度是不一样的。比如LZ的照片减小了曝光强度之后现在看来比较浅的那些绿色就会看不见，显示为黑色。而用图片编辑软件处理后那些地方还是绿的，起不到作用。嗯，非常感谢你，我下次去试一下
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我觉得楼主这个背景光的强度好像太强了吧
如果激发光足够强的话 假阳性的可能性会大大增加
我做的GFP的阳性细胞会非常强 但背景是几乎全黑的 我这边一张我自己做的图片 给你做个参考吧
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LS战友的照片拍得就很好。拍荧光的时候光源只开荧光的就可以了。如果怕对焦调不到位置可以先开普通光源找到位置，然后关了再打开荧光光路。
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shuangrenmu edited on
只能说肉眼分辨率远远高于摄像头了，看着背景是黑色的，细胞明晃晃的绿色，照出来愣是另外一番景象了。。。
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dr_huruoyu 我觉得楼主这个背景光的强度好像太强了吧
如果激发光足够强的话 假阳性的可能性会大大增加
我做的GFP的阳性细胞会非常强 但背景是几乎全黑的 我这边一张我自己做的图片 给你做个参考吧你好，太谢谢你的回答了，我还有问题想请问您，你看荧光的时候是不是要把日光灯关掉呢，我看绿色荧光的时候一把房间的电灯关掉马上就看不到绿色荧光了，还有，我的实验组是转染试剂加质粒，对照组有只加转染试剂盒只加质粒的，但是很奇怪，只加质粒的居然也能看到绿色荧光，想请问您有遇到过这种问题没，或者有没建议，大恩不言谢
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shuangrenmu LS战友的照片拍得就很好。拍荧光的时候光源只开荧光的就可以了。如果怕对焦调不到位置可以先开普通光源找到位置，然后关了再打开荧光光路。谢谢你的回答
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我是关灯的
有的文献说 灯光会对效果有影响的 不过我觉得这个还是取决于你的细胞的荧光强度 如果本来细胞里面的GFP表达就很少
荧光强度弱 影响肯定会比较大；我没有遇到你说的那种情况，我觉得如果你只有荧光显微镜的话，还是那句话，任何细胞，如果激发光强度足够大，还是可以激发出非特异荧光的，我觉得你所谓的那些荧光应该属于非特异荧光。另 你用的什么荧光显微镜？ 我们常用的是Olympus X71，我觉得效果还不错，这台机子可以调节曝光时间和光圈，我一般都把曝光时间缩短些，这样背景会比较黑，光圈在可能的情况下，尽量小一点，这样景深会比较大。说给你，不知道对你有无帮助，如果有问题，再联系。
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dr_huruoyu 我觉得楼主这个背景光的强度好像太强了吧
如果激发光足够强的话 假阳性的可能性会大大增加
我做的GFP的阳性细胞会非常强 但背景是几乎全黑的 我这边一张我自己做的图片 给你做个参考吧为啥你的第二张成那样的呢？一条一条的
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是Epc 呈血管样排列
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dr_huruoyu 是Epc 呈血管样排列请问您的GFP荧光是直接在培养皿上观察的还是用细胞爬片观察的呢？
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您好，我也在做慢病毒转染，观察GFP，荧光显微镜下怎么是不是绿色的呢？我在丁香园上发帖了，这里没办法发图片，麻烦您来我的帖子上看一下，谢谢
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求助：吖啶橙与DNA作用后，在普通的倒置相差显微镜下可以观察到绿色荧光吗
请问吖啶橙与40多个碱基的DNA作用后，在普通的倒置相差显微镜下可以观察到绿色荧光吗
首先谢谢你的回复！不过我还有一些疑问想在您请教下。之前用吖啶橙对电极上捕捉的细胞进行染色，在荧光倒置相差显微镜放大50倍，蓝光激发的时候可以看到绿色的小点，应该就是细胞的细胞核吧，但是对电极上结合的DNA用吖啶橙进行染色的话，在同样的放大倍数下，蓝光激发下下能观察到荧光吗？资料上倒是说说吖啶橙是可以和单链或是双链DNA进行结合的。。。
光学显微镜下是看不到。意思是荧光显色也同样看不到？
你的DNA比较短，结合染料后的荧光不会太强，而且不是聚集的状态，你要知道基因组DNA的长度在30亿bp,聚集在细胞核，所以细胞核染色后能看清。你假如要表征DNA组装到电极上，完全可以用阻抗等方法。
非常感谢您的回复。长知识了，哈哈。谢谢！
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