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细胞复苏失败的原因分析
细胞复苏失败的原因分析
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问：以前拿回细胞后，传代、冻存后复苏过几次都没什么问题，最近因实验室孵箱污染，清洁消毒细胞室后，重新复苏，结果连续复苏6支，细胞均未贴壁，今晚复苏6小时后观察有一瓶相对贴壁细胞数较之前复苏失败瓶多，但贴壁细胞状态不好，形态不佳，透光度亦不好！急求各位大侠会诊指导！答：juventus2004认为复苏过程没有问题，是否是从液氮拿出直接放入温水，还有培养箱，二氧化碳浓度，培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%，看看能否帮助贴壁，当然也需要考虑血清问题，还有确信拿来的细胞没问题。pcspc9认为首先应该怀疑冻存，实际上复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板。1、你冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，即使书上也不讲这个问题，但我因为这个问题就两种肺癌细胞和一种肝癌细胞专门做过试验，这个绝对是绝大部分人细胞复不活的一个原因。太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。2、你的冻存液好不好，是什么，甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。3、你的冻存液的量加的是不是太多，ATCC推荐是不超过7%，大于5%，太多也不好。4、你在冻存的时候是不是把DMSO混均匀，这个有一些影响，但不算太大。5、你的冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格，很多人容易忘却这个事情，因为这个东西流程长。6、如果你细胞污染，你是否能很快看到，我比我的导师能早一天看到污染。从这个角度讲建议去除离心这步。7、你的细胞在冻存前是否过密。还有，我是不赞成孵箱污染这个概念的，所有在一个孵箱里的细胞都污染一个细菌的话，这个细菌是源于孵箱的，但这不代表孵箱污染，因为孵箱无论你如何处理都有大量的细菌，问题在操作。我们的细胞房不换拖鞋，非常脏，别人的细胞都污染，很多细胞都污染到绝种，但我的只污染一次（两年内只有两瓶），那次是因为别人给我动了，我每次细胞摆放顺序都是记住的。如果你老怀疑孵箱污染，那说明你在养细胞这方面很差。每次污染的原因都要尽可能的找，以后就不犯同样的问题，这个很重要，不能靠猜，否则你就有可能细胞养绝最后换课题，这个我见得太多了，别不当会事。
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DXY All Rights Reserved.细胞复苏一般要几天?
细胞复苏过程：1、细胞解冻：从细胞保存处取出放入37˚C水浴中快速震摇1~2min,即可解冻.2、细胞复苏：解冻后的细胞液在1000rpm,常温条件下离心5min,弃去上清液,加入适当体积的该类细胞需要的完全培养液,置37˚C、5%CO2条件下培养.如果加入的完全培养液的量可使解冻细胞液中DMSO的含量低于1%,可省去离心.注意：过程必须快速,DMSO在常温下对细胞有杀伤作用.复苏后根据细胞的生长状态进行传代,一般达到70%-90%时传代.
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我们实验室有同事做那一块的，一般24到48小时吧，具体哪种细胞不一样。时间太短，就算复苏了细胞的状态也还不是很好的，还要再传上一两代才比较好。
复苏一般操作还是很快的，用不了以天作为计算标准；只不过刚复苏时，细胞生长速度不是很快哈！
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冻存前细胞状态很好。但我连续复苏了两支都死了。到底那些环节出了问题。。。郁闷中。。。
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是否因为冻存的时候方法不当导致了冻存之后大量细胞死亡，所以复苏的时候才逗死掉了。或者是复苏的方法不当导致的呢？
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我也曾经碰到这种事情，一般如果有小量细胞存活，多是由于冻存的原因。如果什么都没有，那就怀疑是不是复苏的问题了。
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冻存的步骤：1，配冻存液，1ML DMSO，2ML 血清，7ML培养基，共10ML。
2，离心收集细胞。
3，加6ML冻存液于离心管中，制成细胞悬液。
4，取1.5ML细胞悬液于2ML冻存管。
5，封口胶封好冻存管。4度30min ，-20度30min，-80度保存半月复苏。
复苏的步骤：
1，-80度取出冻存管握于手心，约20秒的样子投入37度水浴箱，快速摇 晃，约一分半钟全部融化。
2，细胞液快速滴入盛有6ML培养液的离心管离心。
3，将离心收集的细胞制成细胞悬液接种于培养瓶。
当时镜下看可以看到很多细胞。第二天观察培养液清亮，而且还没变黄，细胞死了很多，只剩一个一个的，都不多，我的是悬浮细胞，单个的长不好，必须成簇生长。
我细胞冻存后继续养着的细胞传了两次后也出现过死亡。当时以为是污染，但培养液是清亮的，我还是把细胞丢了。我复苏第一支的时候用的是养死细胞的那瓶培养基，但第二支我就换了一瓶培养基，但也是我同一批次配的。现在我重新买了一瓶培养基，准备把血清浓度加大点。以前是10%新生小牛血清。不知会不会活呀，真是急死了。细胞养不活什么都做不了。还请各位战友多多指教。。
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请各位师兄师姐给我看看我上面的步骤有什么问题没，谢谢。。
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你冻存细胞的步骤没有错，就我自己冻存细胞而言，
我用的冻存液的配方是1ML DMSO，9ML完全培养基（即含10%的FBS的培养基）共10ML。我每次冻存细胞时尽可能使制好的细胞悬液保持高浓度，这样复苏就算有很多死细胞，但不至于影响它的细胞密度。另外，我复苏细胞的第二天，会给细胞进行换液，去除死细胞和细胞碎片等“脏东西”，复苏了的细胞要及时观察，如果状态不好就要及时换液或做其它处理。
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建议你复苏时不要离心，也就是把你的步骤2省略掉。因为细胞经过冻存后很脆弱，经不起折腾。可以在细胞溶解后，用移液枪轻轻吹打混匀，然后直接一到含有培养基的培养皿中。
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“4度30min ，-20度30min，-80度保存半月复苏。”
都是裸着吗？一般放在泡沫盒子里，这样是“慢速”降温，如果是裸的，就是“急速”降温了。
复温为什么不直接投入水浴中?
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分析与建议：
1　细胞冻存时浓度太低，我们一般28平方厘米的细胞瓶只冻一支，而不像你分成四支；
2　细胞液快速滴入盛有6ML培养液的离心管离心？？速度太快，细胞内外渗透压变化太大，细胞容易死的，建议看一下细胞培养的细胞复苏一章，细胞加入培养基时先慢后快。
3　复苏时离心与否问题不是很大，一般复苏后六小时都要换液一次，以防DMSO对细胞的损伤作用
4　’4度30min ，-20度30min，-80度保存‘　我们是4度30－40min, -20度1.5 hours, 然后放－70度，效果也非常好，而且是祼的。没问题。如果直接把细胞放入－70或－80则需要加泡沫盒子
　一家之言，仅供参考
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我们的细胞死过一次，原因是期间有一个晚上停电了！}