Western Blot实验成功必备利器---内参
什么是内参？ 内参是一种特异识别高表达或普遍表达蛋白的抗体，在western blot中用于校正蛋白水平。 选择内参时需要考虑什么? 1. 检测大小：选择和目的蛋白大小相近的内参，但仍要能
& 什么是内参？
内参是一种特异识别高表达或普遍表达蛋白的抗体，在western blot中用于校正蛋白水平。
& 选择内参时需要考虑什么?
1. 检测大小：选择和目的蛋白大小相近的内参，但仍要能与目的蛋白区分开，足够大于或小于目的蛋白。若目的蛋白和内参的分子量大小相同，则不利于条带区分及数据解释。
2. 强表达：保证您选择的内参在样本中强表达。大多数通用内参是高表达的结构基因，旨在维持细胞基本生命活动（管家基因）。但一些稀有内参的表达并不是那么普遍。
3. 表达因素：所选内参的表达水平不受实验条件变化的影响（如，因GAPDH在糖酵解中的作用，所以研究新陈代谢过程时不建议作为内参）。最好的内参应识别在正常状态和病理状态下表达没有明显差异的蛋白。
& 什么情况下需要用内参抗体?
1. 定量比较：对比不同点样孔间信号的时候，内参是必须的。只有各孔间内参的表达量相同，目标蛋白表达量的变化才是可信的。
2. 上样和转移确认：内参可以确认是否所有的样品都加入及各孔间的转移量是否相等。通过分析内参信号可以确定蛋白从胶转移到膜上是否均一。
3. 研究发表：大部分杂志要求做WB实验时提供内参数据，来确保实验样本中差异表达量是可信的。内参可以校正各孔间目的蛋白的表达量。
& 常见内参：
亚细胞定位
胞浆/全细胞
Alpha-tubulin
可能不适合关于大年龄差的研究课题[2]；Tubulin的表达受抗癌和抗真菌药物的影响。
Beta-actin
因&-actin是染色质重塑复合体里面的组分，所以不适用于核提取物[1]；可能不适合关于大年龄差的研究课题[2]。
因组织缺氧会上调GAPDH的表达，所以不适合做与氧有关的研究[3]；可能不适合关于大年龄差的研究课题[2]。
Cyclophilin B
很多蛋白质的分子量在15-17kDa之间，因此，如果目的蛋白大小和COX 4接近的话就有必要考虑用其他的内参抗体。
不适合于胚胎干细胞[4]。
不适合作为非增殖细胞的内参。
Histone H3
很多蛋白质的分子量在15-17kDa之间，因此，如果目的蛋白大小和Histone H3接近的话就有必要考虑用其他的内参抗体。
Transferrin
Transferrin水平会受某些疾病状态和某些处理如视黄酸的影响。
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责任编辑：大汉昆仑王0
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改良多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备 徐婷 （海门市人民医...40KD的蛋白western怎么与内参分开 - 实验交流 - 生物秀
标题: 40KD的蛋白western怎么与内参分开
摘要: [40KD的蛋白western怎么与内参分开] 我现在遇到一个问题，我的目的蛋白是40KD，但是内参：β－actin的内参是42KD,GADPH是36KD,如果一起跑的话，刚好都在maker两条带的之间，很难分开，不知道有什么办法，请大家帮帮我，谢谢了 关键词:[内参 抗体 目的蛋白 目的条带 显影 敏感 分子量 丰度]……
我现在遇到一个问题，我的目的蛋白是40KD，但是内参：β－actin的内参是42KD,GADPH是36KD,如果一起跑的话，刚好都在maker两条带的之间，很难分开，不知道有什么办法，请大家帮帮我，谢谢了回复
β－actin的内参可以改为β－Tubolin分子量为55KD左右较好,我用的是博士德,效果很好
你好，谢谢哦，我想问一下，你这个大概价格是多少呢？
那就改成先杂一个后杂一个~
我觉得楼主最好还是看看老外用什么内参为好，否则做出了东西投稿人家不承认就麻烦了。
那就改成先杂一个后杂一个~
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请具体说一下可以吗？谢谢了
常用的内参有b-actin，GAPDH。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。在WESTERN中，分子量为36kDa左右。
近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)， 而不是Actin，才是在不同的组织细胞中普遍等量表达的蛋白， 因而逐渐取代Actin， 被广泛应用于Western Blotting，作为equal loading control (等量蛋白上样内参)，β－Tubolin分子量为55KD左右。
所以建议使用这两种内参看看！祝实验顺利！
我来帮个忙，先杂你的目的条带或者内参，建议先杂内参（除非急于得到结果），一来可以看看电泳和转膜的情况，二来可以看看内参的量，常规二抗-曝光-显影之后，用抗体剥离液将杂在膜上的抗体去除，重新杂目的蛋白，之后再曝光显影，最后将两者叠加起来即可。这样可以避免你说的情况。
如果你的蛋白本来丰度较低，还是建议先杂目的条带，因为第二次杂的肯定没有第一次敏感。
谢谢各位战友，我这个目的蛋白跟GADPH跑开了呵呵，嘿嘿
我来帮个忙，先杂你的目的条带或者内参，建议先杂内参（除非急于得到结果），一来可以看看电泳和转膜的情况，二来可以看看内参的量，常规二抗-曝光-显影之后，用抗体剥离液将杂在膜上的抗体去除，重新杂目的蛋白，之后再曝光显影，最后将两者叠加起来即可。这样可以避免你说的情况。
如果你的蛋白本来丰度较低，还是建议先杂目的条带，因为第二次杂的肯定没有第一次敏感。
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请问 抗体剥离夜是何物，如何配置？
呵呵,也可以分开跑!
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求助western内参蛋白杂带很多?
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如题，第一次做western，做的是大鼠肝组织，取80mg，上的20ul，然后电泳140v45分钟，转膜用的半干转8mA一个半小时，脱脂奶粉封闭一个小时，b-actin1：3000 4度过夜孵育，然后TBST洗膜三次，每次10分钟，孵二抗室温1小时，TBST洗膜三次，显影求问大神为什么我的结果杂带特别多，还很黑乎乎一大片？后来找老师说老师说是一抗的浓度太大，或者上样量比较大，所以我后来提蛋白浓度少了点，把一抗稀释到1：5000，并且洗膜时间也加长了十分钟，但是结果还是差不多，背景很黑，还隐约看到了杂带，所以有大神知道是具体哪步出错了吗，不知道是不是肝组织中有脂肪对提蛋白有干扰，因为提蛋白时候离心发现上面一层絮状物，并且沉淀很少。这是这次一抗1：5000这是这次一抗1：3000
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古夜幽月 edited on
可能是蛋白提取过程有问题，
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我买的索莱宝的蛋白高效裂解液，是有降解吗？
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前辈，我是用高效裂解液在冰上操作提取的，难道是有降解？降解的话也会有杂带吗？
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楼主这个问题解决了吗，是样品的问题吗？
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sususk 楼主这个问题解决了吗，是样品的问题吗？是胶的问题，抗体也不太好
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古夜幽月 sususk 楼主这个问题解决了吗，是样品的问题吗？是胶的问题，抗体也不太好请问胶有什么问题呢，后来怎么解决的？我也是这个问题，一直不得其解，很困扰
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sususk 古夜幽月 sususk 楼主这个问题解决了吗，是样品的问题吗？是胶的问题，抗体也不太好请问胶有什么问题呢，后来怎么解决的？我也是这个问题，一直不得其解，很困扰我用的是买的胶一开始，所以背景黑，后来自己配胶感觉还可以，不过最主要的还是抗体，不好的抗体什么胶都会背景很脏，所以建议你换抗体
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古夜幽月 sususk 古夜幽月 sususk 楼主这个问题解决了吗，是样品的问题吗？是胶的问题，抗体也不太好请问胶有什么问题呢，后来怎么解决的？我也是这个问题，一直不得其解，很困扰我用的是买的胶一开始，所以背景黑，后来自己配胶感觉还可以，不过最主要的还是抗体，不好的抗体什么胶都会背景很脏，所以建议你换抗体谢谢，非常感谢！
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【求助】做western，如何保证内参一致？
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做了一个多月，内参没调整齐。想问问大家都怎么调节上样量，保证内参一致的。上样前测BCA，再根据测到的浓度调节上样量，能保证内参一致吗？
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妙曲轻扬 做了一个多月，内参没调整齐。想问问大家都怎么调节上样量，保证内参一致的。上样前测BCA，再根据测到的浓度调节上样量，能保证内参一致吗？内参蛋白在组织细胞中的表达量基本是一致的，所以只要样本总蛋白量一致，最后得到的内参条带就会一致。先BCA定量，再依据测得的浓度调整上样量或把所有样本的浓度调至相同后上样。由于不同样本BCA定量时可能会有误差，也需依据最终内参条带调整下次实验的上样量。
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China13113 内参蛋白在组织细胞中的表达量基本是一致的，所以只要样本总蛋白量一致，最后得到的内参条带就会一致。先BCA定量，再依据测得的浓度调整上样量或把所有样本的浓度调至相同后上样。由于不同样本BCA定量时可能会有误差，也需依据最终内参条带调整下次实验的上样量。根据BCA测得计算得到的上样量来上样，一般条带都会一致吗？
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妙曲轻扬 根据BCA测得计算得到的上样量来上样，一般条带都会一致吗？是的，依据BCA测得计算得到的上样量来上样，一般内参条带都会是一致的。BCA法特点： 1. 灵敏度高，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。
3. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 4. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM。
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China13113 是的，依据BCA测得计算得到的上样量来上样，一般内参条带都会是一致的。BCA法特点： 1. 灵敏度高，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。
3. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 4. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM。解释的很详细，非常感谢。不过我看一般测蛋白浓度都需要一组标准蛋白样品，测完BCA后做标准曲线，然后根据标准曲线计算蛋白浓度。这样不做标准曲线，直接用BCA测到的浓度会很准吗？
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妙曲轻扬 解释的很详细，非常感谢。不过我看一般测蛋白浓度都需要一组标准蛋白样品，测完BCA后做标准曲线，然后根据标准曲线计算蛋白浓度。这样不做标准曲线，直接用BCA测到的浓度会很准吗？BCA试剂盒里面有标准蛋白，蛋白定量肯定要做标准曲线，不然楼主是怎么得到的浓度？
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妙曲轻扬 解释的很详细，非常感谢。不过我看一般测蛋白浓度都需要一组标准蛋白样品，测完BCA后做标准曲线，然后根据标准曲线计算蛋白浓度。这样不做标准曲线，直接用BCA测到的浓度会很准吗？不用标准曲线得不到很准的浓度，但是样品间的相对浓度比例还是很准的，只要你测的方法对，结果在线性范围内。如果不需要精确的绝对浓度，有经验的话直接根据OD值可以估算出大概的浓度范围，或者用BSA配一个标准样品也不是什么麻烦事吧。
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xufangyi4527 BCA试剂盒里面有标准蛋白，蛋白定量肯定要做标准曲线，不然楼主是怎么得到的浓度？很多时候都会把BCA结果当成蛋白浓度
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roy2929 不用标准曲线得不到很准的浓度，但是样品间的相对浓度比例还是很准的，只要你测的方法对，结果在线性范围内。如果不需要精确的绝对浓度，有经验的话直接根据OD值可以估算出大概的浓度范围，或者用BSA配一个标准样品也不是什么麻烦事吧。嗯嗯，谢谢！
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妙曲轻扬 很多时候都会把BCA结果当成蛋白浓度这样定量结果是不准的。因为OD值与蛋白浓度存在的是线性关系而非正比例关系，按照朗伯比尔定律y=ax+b，如果直接将OD值当成蛋白浓度，会漏掉b值的计算，如果b值不能忽略那么定出来的蛋白量是有很大差异的。
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为什么要内参一致？不同样品很难保证内参一致吧，你可以用imagej分一下光密度就好得结果
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用BCA检测做标准曲线后会有r平方，越接近1越好，之后调齐上样了，最后灰度分析也可以弥补内参不齐
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