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构建质粒后扩增片段却变小了，求教
最近构建质粒出现了奇怪现象，质粒和扩增片段（近5kb）双酶切后验证大小都是符合的，连接之后挑选的阳性菌落提取质粒再进行PCR验证，用之前扩增的引物或者原质粒上酶切位点上下游的引物扩增都只得到了3kb的片段，怀疑酶切时间过长出现星星活性，之前是切过夜的，但是后面就减少到四五个小时了，重复了几遍都是这样的结果。
& && & 前面用相同的载体构建其它质粒时也出现过这个现象，后经测序是只将部分片段连接了上去，之后也没怎么改进步骤重复了一下就得到正确的质粒了，这次一直得不到正确结果了，扩增片段上是没有对应酶切位点的，请问下大家可能会有什么问题呢，谢谢！
用的pfu，两步法和三步法都试过了，就算是有点突变，5kb的条带也不至于一点都没有吧
5k是可以的，之前扩增片段就用的这个，到后面验证时同样的程序就只扩增出3k了
5k应该不算太长吧，两步法三步法都试过，扩增片段是可以的，只是很奇怪连接完了之后就只能扩增出3k，所以酶应该不是问题。之前相似的现象在测序后确实是只把其中一段连接了上去。
那就是出现了点突变，有些位点和你的引物结合了。
我换了一种酶使用选质粒上连接位点前后两个引物扩增出现了5kb的片段，但是很暗，然后1kb左右出现了特别亮的非特异条带，但是用扩增基因片段的引物却没有得到5kb的片段，仍然只能扩增出3kb片段，送测序后结果很让我疑惑，用的引物是质粒上酶切连接位点前后的能扩增出5kb的那对引物，可是测序后这两个引物测得结果是一样的，都反向互补后竟然和原质粒上酶切位点以外的不相干的1kb序列完全一致，真心搞不懂了。
回过头来又检查了一下实验设计应该是没问题的，只是我这次扩增的基因片段的阅读顺序和质粒正常的顺序是相反的，这个应该没什么影响的了。
感谢您的应助！
哦。祝您顺利！做分子的实验，有一个容易被忽视的因素，就是各种分子的空间构型，也叫构象或者拓扑，比如质粒，我们不经意间就会想象成一个圆环，其实它们存在的主要形式是螺旋。
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构建 表达质粒，但是PCR扩增不出目的片段。
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待解决问题
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1、根据无缝克隆设计片段引物，第一对：上游引物：GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGAGCCTGAGGTGAACTTGAGGGTGC下游引物：GCACAGTGGCGGCCGCTCGAGCCGGCTTGACAGCTAAA第二对：上游：GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCGCCAGGGCCAGCGGAAAG下游：GCACAGTGGCGGCCGCTCGAGACAGGTAAGTCATCCCTCA使用HCT116、HT29、U87提取的RNA反转的cDNA模板，采用Taq酶和LA酶均没有目的条带。2、将整个CDS长2.8k分为两段，~1.4+1.4k中间引物：第一片段 Anti-sense:
5’-CACGTCGTGGGACAAATAG-3’第二片段 sense
5’-CTATTTGTCCCACGACGTG-3’2k Marker，1-6是HCT116模板。7-12是HT29模板。1-3是第一片段，用1Hsp90-F和anti-sense，,60度、58度、55度。4-6是第二片段，用sense和2Hsp90-R，60度、58度、55度。7-9是第一片段，用1Hsp90-F和anti-sense，,60度、58度、55度。10-12第二片段，用sense和2Hsp90-R，60度、58度、55度。3、之后又重新设计上游引物。从CDS开始或往前更靠近CDS区域。ATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGCCCCCGTGTTCGGGCG以及TAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTACCCTACGGGGAGCGCG依旧没有条带。请问是什么原因
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关于丁香园质粒构建 - 上海蓝基生物科技有限公司
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> 质粒构建
通过各种DNA克隆方法，可以短时、高效、保质地完成服务。我们专业的分子生物学团队从设计到PCR克隆提供全方位的服务，
可以充分满足您的实验要求。
细菌的DNA克隆是把外源基因与克隆载体进行体外连接，继而转化宿主细胞，筛选出含有目的基因重组质粒的转化子，
并将该转化子大量扩增提取重组质粒的过程。
服务内容：
1、PCR产物TA克隆：使用Ex Taq或LA Taq等聚合酶扩增的PCR产物3& 末端带有一个&A&尾，
&&&&& 可直接克隆至带有&T&末端的载体上&(如pMD19 -T Vector等)。
2、目的基因亚克隆：将含有目的基因的质粒采用酶切方法克隆至商品化的表达载体或改造后的特殊载体上。
3、以质粒为模板PCR扩增目的基因后克隆：将质粒上的一段序列通过PCR加入酶切位点或将几个不同来源
&&&&& 的片段通过PCR拼接后进行克隆。
4、多片段高效克隆：使用Clontech公司独创的In-Fusion克隆技术，可以通过同源重组，无需加入连接酶，
&&&&& 将PCR产物一次性克隆至所需载体(目前成功的案例中最多一次克隆6个片段)。同时该方法也适用于扩增片
&&&&& 段内含有克隆所用限制性酶切位点，酶切方法无法克隆的情况。
通过各种DNA克隆方法，可以短时、高效、保质地完成服务。我们专业的分子生物学团队从设计到克隆提供全方位的服务，
可以充分满足您的实验要求。
DNA克隆是把外源基因与克隆载体进行体外连接，继而转化宿主细胞，筛选出含有目的基因重组质粒的转化子，
并将该转化子大量扩增提取重组质粒的过程。
载体构建的基本步骤：
1、用限制性内切酶分别酶切消化表达载体或克隆载体，同时用相同的限制性内切酶酶切含有目的片段的载体；
2、琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功；
3、酶切成功，割胶回收目的片段；
4、用T4连接酶或其他相关的酶将载体骨架和目的片段连接；
5、连接产物转化宿主如大肠杆菌，毕赤酵母或其他相关宿主；
6、.阳性克隆子的筛选；
根据载体上抗性基因筛选连接正确的重组子，提取重组质粒，酶切,验证连接是否成功。
但最好的验证方法是将重组子送交测序公司测序。我从国外要回的质粒,有谁知道下一步该怎么处理扩增啊?请写具体一点,试剂都用多少,我还没做过实验呢.
那逝去的56
在PCR管内配置100uL反应体系：双蒸水70uL 10×buffer 10uL 2.5mol/L dNTP混合产物 8uL 正向引物 4uL 反向引物 4uL 模板DNA 2uL Taq聚合酶 2uL 步骤：（1）94℃预变性2min （2） 94℃变性30s （3） 55℃退火30s （4） 72℃延伸1min （5）重复（2）（3）（4）30次 （PCR热循环仪做）（6）72℃总延伸2min
你好，你这个是不是就不用大肠杆菌了？也不用质粒提取试剂盒之类的了？之前的步骤是怎么做的啊？
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可能是质粒根本没进去啊 P出来的也许是引模二聚体 也可能是你引物特异性不好扩增了细菌的基因组片段 可能质粒在细菌外
这个时候一般是先制备感受态的大肠杆菌，一般是用CaCl2处理，现在也有商品化的感受态，一般菌株为DH5α。具体制备方法搜一下“感受态细胞制备”就有。然后一般取50-100ng质粒加入100ul的感受态细胞里，进行热激处理，这个操作方法网上也有，一般是感受态细胞（-70°C取出才有这一步）冰上融化，加入质粒，42℃保温90s，冰上放置5min。然后加入400ul LB培养基，37...
楼上guangyi1012回答的很具体了，我补充点大致方案：大体来讲分为3步：1，将要回的质粒溶于无菌水；2，转化至大肠杆菌，培养细菌，也就是扩增质粒；3，提质粒，并检查其大小，测定浓度。既然你没做过这个实验，我觉得你先做如下准备工作：（1）查清这个质粒的图谱，弄清其受体菌有无特殊要求，以及质粒大小、抗性特征。大多质粒都可以用DH5a菌株来扩增，抗...
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质粒载体是如何整合到动物受体细胞染色体DNA上的呢收藏
是什么机理？怎样的过程？我的疑问主要是：1、载体（质粒）是环状的，它要整合到受体细胞DNA上先要断开成直链，动物细胞里貌似没有什么限制酶能断开它。2、就算断开了，它又是怎样被连在受体细胞DNA上的呢？我知道真核细胞里也有DNA连接酶，可是他为什么会把不是自己的DNA连在自己DNA上？
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是依靠同源重组（重组酶介导的）整合上去的。以农杆菌转化植物细胞为例，农杆菌内部本身具有一个可编码重组酶的巨大质粒，侵染植物后，可将穿梭载体上的T-DNA区切下，依靠同源重组插入植物基因组。不要死套分子克隆操作中的酶切-连接操作。
那么整合到动物细胞染色体DNA上也是因为重组酶吗？有人说这种质粒整合是靠运气的，机率很低，病毒载体的整合率要高。但质粒载体会在细胞质中大量复制，细胞分裂时也可以一定程度上保证传给子代细胞，不知道对不对？
还有，基因枪法是怎样达到整合的呢？光金属颗粒打入就可以？
嗯，是的。细胞内本身也有重组酶的存在。转化率大约1%左右。质粒载体在宿主内不复制的。靠的就是插入宿主基因组内后随着基因组复制而复制。
看我ls第一句。
质粒载体上不是有复制原点吗?（高中生物书上写的）
质粒载体的复制起始位点只能被原核生物和少数真核生物（主要是酵母）识别。真核宿主（如植物细胞、动物细胞）不能识别质粒载体的复制起始位点。
哦，懂了，实在太感谢了！
比利时普威伦生产不含邻苯二甲酸盐,具有特殊的热性能与机械性能,可与食品接触,电话:6
不好意思，突然想问为什么真核宿主不能识别复制起点呢？
我查了一下，为了能让真核宿主识别，要加上病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列，那么这样就能虽不整合DNA但一定程度上可以传给子代了吗？穿梭载体(shuttle vector)
又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在 真核细胞中复制和表达。 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体 和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞 中表达，并可提高外源基因的表达效率。
11L的问题改成：为什么原核质粒上的复制起点不能被真核细胞识别？那真核质粒上的复制起点不能被原核细胞识别吗？
刚才看到这个帖子，对于质粒载体是如何整合到动物受体细胞染色体DNA有了大致了解。但是我想问如果用脂质体转染的办法整合质粒载体是怎么的过程？环形质粒载体是进入细胞后是怎么断开的，难道普通真核的载体也可编码重组酶，自己切断吗，还是在包进脂质体之前人为把它切开？还有您说质粒载体整合到基因组是依靠同源重组（重组酶介导的），那么我能否根据这个同源性大致推测我的质粒整合到基因组哪个位置？这个同源重组是否把整个质粒载体全部整合上去，还是只把目的基因整合上去而载体部分没有整合上去？质粒载体整合到基因组DNA上后，还是以一个完整的线性片段存在吗，还是会被断开，分成几个片段？
复制起始相关蛋白要识别一定的DNA序列才行。具有特异性。
转染对于所用质粒和细胞株是有一定要求的。质粒是有特殊区域可进行重组的。真核细胞内一般都有重组酶存在。同源区比较短，在整个基因组上可以看做随机插入。重组的只是一个片段，不是整个质粒。质粒载体整合到基因组DNA上后还是一个完整的线性片段。
真核原核生物的DNA启动子序列完全不同，而且两类生物的DNA聚合酶及配套的各种酶联复合物也完全不同。所以，真核生物是无法识别原核生物复制七点的。
谢谢！我还有几个问题请较：1、pCI-neo载体是否具有与细胞重组的特殊区域？2、您说重组的只是一个片段，不是整个质粒，是说质粒中会有部分丢失，还是环形质粒被切成片段后全部重组上去？3、同源区一般多短，才会随机插入？
谢谢您的指点!我还想请教几个问题：1、如果是pCI-neo质粒载体，与动物细胞基因组重组也是Cre-LoxP系统的原理？那是不是说这个载体中具有LoxP（locus of X-over P1）序列？2、您之前说先把质粒切成线性的，是用特定的酶切位点吗？一般是什么位点？
pCI-neo是动物表达载体，您说的直接在动物细胞里面复制，转录，不需要经过重组是什么意思，是没有整合到染色体上吗？质粒整合到基因组上时，质粒中会有部分丢失吗，还是环形质粒被切成线性后全部重组上去？
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