Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography | Protocol (Translated to Chinese)
Immunology and Infection
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我们描述了独立于环境病毒社区的单链DNA，双链DNA和RNA分子的有效方法。核酸是分次使用含有磷酸盐缓冲液浓度的增加羟基磷灰石色谱。这种方法允许所有病毒从环境样品中的核酸类型的隔离。
Cite this Article
Fadrosh, D. W., Andrews-Pfannkoch, C., Williamson, S. J. Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography. J. Vis. Exp. (55), e3146, doi:10. (2011).
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病毒，尤其是噬菌体（噬菌体），是地球上 1,2数量最多的生物实体。病毒调节宿主细胞的丰富性和多样性，促进养分循环，改变宿主细胞的表型，影响宿主细胞和病毒通过基因的横向转移3社区的演变。大量的研究有突出的病毒和它们在各种自然环境的功能潜力惊人的遗传多样性。 宏基因组技术已被用于研究生物分类的多样性和复杂的病毒，其成员中含有单链DNA（单链DNA），双链DNA（dsDNA）的和RNA 的基因型4-9的组合功能的潜力。当前协议，用于研究环境的DNA含有或RNA含有病毒库的建设需要一个初始的核酸治疗，为了消除非定标模板10。然而，一个全面的了解病毒的社会和病毒的多样性集体的基因补充，需要所有成员的知识，不论基因组组成。分馏纯化核酸亚型提供了一个有效的机制来研究不牺牲社会的基因特征的一个子集的病毒组合。 羟基磷灰石，磷酸三钙的结晶形式，已受聘于核酸的分离，以及蛋白质和微生物，自1960年以来 11 。通过利用带正电荷的钙 2的电荷相互作用的羟基离子和带负电荷的核酸亚型的磷酸骨架，它是可以优先洗脱每个独立于其他的核酸亚型。我们最近采用这一战略的独立分馏，准备DNA 测序 12单链DNA，双链DNA和RNA含有病毒的基因组。在这里，我们提出了一种单链DNA，双链DNA和RNA病毒核酸病毒混合组合使用羟基磷灰石chromotography分馏和恢复的方法。
1。制备解决方案在执行羟基磷灰石色谱之前，必须准备和磷酸盐缓冲液必须正确水合羟基磷灰石。
1M磷酸溶液，pH为6.8：溶解在1L容量瓶119.98克磷酸二氢钠，在1L无菌DEPC 处理的H 2 O准备在1L容量瓶一个1M钠磷酸氢二钠溶液溶解在1L无菌DEPC处理的H 2 O磷酸钠二元141.96克在以1:1的比例，结合单和DI -解决方案。将烧瓶上不小的轰动板和混合使用磁力搅拌棒。调节pH值至6.8，加入氢氧化钠（增加pH值）或磷酸（以降低pH值）。
0.12M磷酸盐缓冲液：在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升30毫升。添加无菌DEPC处理水的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理水至250ml。高压灭菌。
0.18M磷酸盐缓冲液：在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升45毫升。添加无菌DEPC处理的H 2 O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H 2 O至250ml 。高压灭菌。
020的磷酸盐缓冲液：在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升50毫升。添加无菌DEPC处理的H 2 O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H 2 O至250ml 。高压灭菌。
0.40 M磷酸缓冲液：在500ml烧瓶中，100毫升2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升结合起来。添加无菌DEPC处理的H 2 O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H 2 O至250ml 。高压灭菌。
“1.00M磷酸缓冲液”（实际浓度的磷酸盐，在这个解决方案是91万）：在500ml烧瓶中，结合30毫升1M磷酸溶液，pH6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），2.5毫升，5ml的0.5M EDTA。添加无菌DEPC处理水的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H 2 O至250ml 。高压灭菌。 羟基磷灰石水化：重出1克的羟基磷灰石，并添加至50ml管。 6毫升的0.12M磷酸盐缓冲液添加羟基磷灰石和颠倒混合。之前使用带来的温度为60℃，调匀。长时间储存在4 ° C 在使用之前，在60 ° C平衡所有的磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石 2。经济柱的制备关闭活塞。与去离子H 2 O冲洗多次反相柱和调迁列多次。 从经济型列删除活塞和高压灭菌消毒列。 更换和关闭活塞。添加Sigmacote1毫升无菌的Econo列和大衣所有的玻璃表面。打开活塞和倒出。 列循环水浴，设定温度为60 ° C。 einsure跨列列的包装，如铝箔或泡沫保温管，绝缘剂的热损失量最少的是建议。 冲洗两次的Econo列无菌，无RNase H 2 O，然后两次无菌，无RNase 0.12M磷酸缓冲液。
3。 Hydroxypaptite Chromotography 确保活塞是封闭的，慢慢加入事先准备好的，悬浮羟基磷灰石2毫升的Econo柱底部使用无菌2毫升血清吸管。 允许羟基磷灰石重力下为30分钟解决。 排列，并关闭活塞的缓冲。 0.12M磷酸盐缓冲液核酸结合在一个终体积为500μL孵育在60 ° C时在加热块或水浴10分钟。 快速申请准备在0.12M磷酸盐缓冲液中的羟基磷灰石（使用2毫升血清吸管，确保不打扰列）的核酸。 允许核酸绑定到30分钟的羟基磷灰石。 列下放置一个15毫升管，打开活塞，收集初始样本含有单链DNA。关闭活塞。
0.12M磷酸盐缓冲液添加6毫升一定不要去打扰列，打开活塞，并在上一步15毫升管收集的单链DNA的羟基磷灰石。关闭活塞。 加入1体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:25:1，V / V / V）溶液管，混合大力离心15分钟，并在3500 XG。上清含有单链DNA转移到一个新的15毫升管。 重复使用020磷酸盐缓冲至E6毫升3.76和3.87琵琶和列净化RNA一定要使用一个新的15毫升管收集。 使用6毫升的0.40M磷酸盐缓冲液洗脱和净化一定要使用一个新的15毫升管收集的列的双链DNA重复3.76和3.87。 重复使用1.00M磷酸盐缓冲地带的任何残余的双链DNA一定要使用一个新的15毫升管收集列的6毫升3.76和3.87。
4。脱盐核酸酸样品传输样品45毫升一个Amicon超4离心过滤设备与装备切断Ultracel膜的重量为30,000分子。 集中样品&500μL纺纱6000 XG，30℃，5分钟（或直到集中量达到）在一个固定角度转子。丢弃流量通过。 其余样品（S）的Amicon Ultra - 4的离心式过滤装置，并带来了量高达45毫升用RNase免费1X TE缓冲液。 集中样品&500μL纺纱6000 XG，30℃，5分钟（或直到集中量达到）在一个固定角度转子。丢弃流量通过。
45毫升的RNase免费1X TE缓冲液添加的Amicon Ultra - 4的离心过滤设备。 6000 XG，30离心浓缩样品&500μL℃，5分钟（或直到集中量达到）在一个固定角度转子。丢弃流量通过。 重复步骤4.5一个额外的5倍，完全淡化核酸样品（S）。 将剩余的样本（S）1.7毫升无菌Eppendorf管。新增的十分之一体积3M醋酸钠，pH值7.0，两卷100％的乙醇，Glycoblue加入1μl。由涡旋混合。
28000 XG，4℃，60分钟离心。倒出作出一定不要去打扰颗粒。 70％的乙醇添加300μL。自旋为28,000 XG，室温为10分钟。倒出，干燥，并在适当体积的无RNase的TE缓冲液重悬每个分数。
5。代表性的成果：
图1总结了从混合病毒组合使用羟基磷灰石色谱分馏的单链DNA，双链DNA和RNA的核酸提出的方法。这种方法是利用电荷相互作用之间的核酸带负电荷的磷酸骨架和带正电的CA 2 +离子目前在羟基磷灰石和核酸亚型的有效分离（单链DNA，双链DNA和RNA），允许用磷酸盐缓冲液浓度增加12。
在体外的“社区”已知的单链DNA（M13mp18），双链DNA（λ）和RNA的羟基磷灰石的分离（MS2和phi6）病毒的基因组如图2所示。核酸结合在平等的浓度，适用于羟基磷灰石柱和洗脱使用的磷酸盐缓冲液浓度的增加。每个核酸亚型洗脱独立于其他与低于9％，从一小部分结转下。 这项技术的应用从切萨皮克湾收集到了病毒社会的孤立的核酸如图 3所示。羟基磷灰石柱分离纯化病毒总核酸产量。独立的单链DNA，RNA和双链DNA组成的基因材料与0.12M，020和0.40M/1.00M的磷酸盐缓冲液浓度分别洗脱。双链DNA洗脱0.40M和1.00M磷酸盐浓度，在这种情况下，占主导地位这一病毒的社区相比，单链DNA和RNA的基因型。这个观察是符合预期的海洋病毒群落组成和河口环境大多数可收回核酸双链13。
图1。核酸分馏的羟基磷灰石色谱法的流程图。在0.12M磷酸盐缓冲液制备的单链DNA，双链DNA和RNA的混合物加热至60 ° C，并应用到一个羟基磷灰石柱保持在恒定的60℃使用循环水洗澡。 （单链DNA，RNA和双链DNA）核酸是由羟基磷灰石洗脱与一个含有磷酸盐缓冲浓度的增加。由美国微生物学协会的许可，这个数字已被复制，最初是在安德鲁斯- Pfannkoch等功能。 2010年12。
图2。使用羟基磷灰石色谱已知的病毒核酸的分离。平等浓度M13mp18单链DNA，MS2的ssRNA，phi6双链RNA和lambda双链DNA（泳道2-5分别）相结合（6车道），并应用到羟基磷灰石柱。 SINGLE -双链DNA（M13mp18），RNA（MS2/phi6）和双链DNA（λ）分别独立使用0.12M（8车道），0.18M（9巷）和0.40M/1.00M（10巷）羟基磷灰石柱洗脱从。一个1KB的阶梯（1车道，7）是用来确定基因组大小。由美国微生物学协会的许可，这个数字已被复制，最初是在安德鲁斯- Pfannkoch等功能。 2010年12。
图3：从社会孤立的切萨皮克湾内的病毒核酸的分离。核酸分离并应用到羟基磷灰石柱。单链DNA（巷0.12M），RNA（020道）和双链DNA（车道0.40M/1.0M）独立使用0.12M，020万和0.40M/1.00M的磷酸盐缓冲液浓度，分别洗脱。您好地下DNA梯状条带（巷L1）和1KB梯（车道二级），用于直观地确认近似分子量和核酸的质量。由美国微生物学协会的许可，这个数字已被复制，最初是在安德鲁斯- Pfannkoch等功能。 2010年12。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
羟基磷灰石色谱这里介绍的方法是核酸病毒混合的组合，当目标是研究社会的总核酸组成的分馏的高效和强大的工具。一般来说，单链DNA，RNA和双链DNA列PHO磷酸盐缓冲液浓度比约?0and 0.40M分别洗脱。然而，每一个羟基磷灰石的制备可以有一个稍微不同的组成和流出曲线，所以重要的是测试每个准备使用已知的核酸（例如，从耕地的病毒编写）。这将允许用户以确定具体含有磷酸盐缓冲液洗脱所需的核酸浓度。 该技术的限制因素是可用数量的Ca 2 +离子在羟基磷灰石，可以结合核酸的磷酸骨架。 capacityamount的列中的羟基磷灰石可以扩大或下降到列（水套列，并用羟基磷灰石量的大小决定），洗脱使用的缓冲区数量可以扩展，以容纳很小或大量输入的核酸，但最终是有限的水套列的大小。 此外，一批技术，核酸，羟基磷灰石，并含有磷酸盐缓冲液在管，混相结合，并在低速离心是一个有针对性的核酸分离的另一种方式。这种策略可能是有益的，但在某些情况下，是不是更准确和提供更好的分馏核酸的色谱方法的可靠。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgements
这项研究的支持，美国能源部科学办公室（BER）的合作协定“没有。 DE - FC02 - 02ER63453，国家科学基金会的微生物基因组测序计划（奖号码31916）。我们感谢他的技术专长和建议，并K.埃里克Wommack约翰玻璃，他与环境样品的采集援助。
Catalog Number
Econo-Column
0.7cm ID package/2
Hydroxyapatite
DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td&
Sodium Phosphate, Monobasic
VWR international
Monohydrate, Crystal 500g
Sodium Phosphate, Dibasic
VWR international
Anhydrous, Powder 500g
DEPC-treated Water
Invitrogen
10% SDS Solution
Invitrogen
UltraPure, 1L
Invitrogen
pH 8.0, 1L
Sigma-Aldrich
2ml serological pippette
VWR international
Polystyrene, Sterile
BD Falcon Centrifuge Tubes
VWR international
15ml, Sterile
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v)
Invitrogen
UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 Centrifugal Device
EMD Millipore
Ultracel-30 membrane
20X TE Buffer, Rnase free
Invitrogen
Invitrogen
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Usage Statistics
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癌变是一个涉及癌细胞和肿瘤微环境之间的相互作用的方法。要解剖的分子事件，一个需要，隔离癌症的发展过程中的不同阶段的不同的细胞群。利用小鼠模型基底细胞癌癌变过程中，我们描述了一个协议，用于细胞分析。
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Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311, doi:10. (2013).
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癌症的发展是一个多步骤的过程，涉及到许多类型的细胞，包括肿瘤细胞前体细胞，免疫细胞，成纤维细胞和内皮细胞。每种类型的细胞癌变过程中，经过信令和功能上的变化。许多癌症研究人员目前的挑战是剖析这些变化在多步骤的过程中体内不同的细胞类型。在过去的几年中，作者已经开发了一套程序，来隔离不同的细胞群，在皮肤癌的发展过程中，使用YFP的小鼠K14creER/R26-SmoM2只。的程序被划分成6份：1）生成适当的小鼠为研究对象（+与R26-SmoM2 YFP +老鼠在这个协议中）; 2）诱导SmoM2 YFP的表达在小鼠皮肤中; 3 K14creER）制备小鼠皮肤活组织切片检查; 4）隔离从皮肤的表皮; 5）制备单细胞从表皮; 6）标签流式细胞仪分析单细胞群。生成足够数量的合适的基因型的小鼠，在这个协议中的限制步骤，这可能需要长达两个月。其余的步骤需要几个小时到几天。在这个协议中，我们还包括一节进行故障排除。虽然我们侧重于皮肤癌，该协议可以被修改，以适用于其他的人类疾病的动物模型。
Introduction
基底细胞癌（BCC）作为最常见的类型的人类癌症，影响约200万美国人每年1。越来越多的证据表明，刺猬（Hh）信号异常激活相关：BCC的发展（2,3）的动力。 Hh信号在基底细胞癌的改变包括失活突变的PTCH1 4-6，SMO 7-9增益功能的突变，异常表达Hh信号通路的转录因子GLI1 10 GLI2 11或负调节素（富罕见的灭活突变）12。通过所有这些和其他研究，美国联邦药物管理局（FDA）近日批准使用的Hh信号抑制剂Vismodegib治疗转移性和局部晚期基底细胞癌13-15。 尽管所有这些成就16，我们仍然不明白Hh信号驱动致癌物的分子和细胞机制inogenesis。建立动物模型，利用组织特异性激活Hh信号仍然是重要的，这些研究对于我们理解的耐药性。在小鼠中，野生型小鼠不发展基底细胞癌，即使在大量的致癌物质，紫外线或电离辐射的剂量。 PTCH1 + / -小鼠与此相反，容易受到到BCC开发17,18的影响 。 PTCH1 BCC发展渗透率+ / -小鼠是超过50％，18,19虽然PTCH1 + / -小鼠很少发展为完全成熟的基底细胞癌，如果在正常情况下保持。 PTCH1胚胎致死- / - ，组织特异性的基因敲除PTCH1通常用于研究20。此外，有条件的皮肤特异表达的致癌：YFP SmoM2（KRT14 CREER：中R26-SmoM2 YFP或KRT14-CRE：R26-SmoM2 YFP）导致多个微观基底细胞癌的形成在一个非常早期的年龄，提供一个简单的基因检测Hh信号SMO 21 wnstream。 主要有三个问题，我们的知识BCC生物学。首先，基底细胞癌的细胞起源目前尚不完全清楚。虽然一些研究支持毛囊干细胞网站22-24让步，优素福等 25个本地化的小鼠皮肤HH-驱动肿瘤起源细胞在滤泡间表皮区域，而不是在毛囊通过采用细胞特异性表达Cre重组酶的激活表达的一个驱动ROSA26的转基因突变SMO。二，细胞相互作用BCC发展过程中不能很好地理解。它是已知的，角质形成细胞的激活Hh信号。可以导致基底细胞癌的形成，但不理解其他细胞的变化。此外，治疗的SMO拮抗剂在小鼠可以导致耐药26-28。 BCC因此，新的目标，是非常必要的。了解这三个问题，需要在小鼠的细胞变化分析carcinog香根草。角质细胞培养，流式细胞术及皮肤干细胞分离29-31虽然已经出版的几种方法，目前还没有完备的程序在小鼠基底细胞癌的细胞分析。基底细胞癌的小鼠模型，分离表皮，产生的单细胞组织和细胞分析相结合的方法，我们会为读者提供了一套程序来研究细胞信号传导，细胞和分子间的相互作用，在BCC发展。我们相信，这个协议将使读者看到每个过程是如何完成的。此外，我们还提供了一些数据来说明什么样的结果应该看起来像，故障排除，以帮助读者克服困难，在执行这些程序。
IACUC委员会已批准在美国印第安纳大学医学院的这项研究。
1。生成正确的基因型的小鼠建立基底细胞癌的小鼠模型。的队友K14-CREER的小鼠（杰克逊实验室股票号005107）YFP的小鼠R26-SmoM2（杰克逊实验室股票号005130）（18）产生K14-CREER的+和R26-SmoM2的YFP +小鼠。 进行基因分型。沉浸尾标本1 mg / ml的蛋白酶K在directPCR尾裂解液（0.5厘米长），在55℃振荡过夜。第二天，通过离心分离除去组织碎片在微型离心机中以最快的速度（保持上清液用于基因分型）。每个PCR反应中的引物和由供应商推荐的条件下，使用1微升上层清液。选择正确的基因型（年龄为3-6周，丁丙诺啡在0.05-0.1毫克/公斤，将被应用于通过SQ每8-12小时后2-3天尾剪断）FO小鼠步骤2?。
2。诱导表达SmoM2皮肤角质通过喂食针灌胃（弯曲20计）连续5天口服他莫昔芬（5微克/公斤体重每次喂奶50毫升的植物油）角质形成细胞诱导SmoM2的表达。
3。准备皮肤标本在一般情况下，表型在GFP小鼠K14creER/R26SmoM2只耳朵和尾巴上更严重。为了准备细胞分析，我们首先收获小鼠皮肤动物牺牲后与机构的批准过程（CO 2，加上颈椎脱位）。
4。隔离表皮经过牺牲小鼠批准的程序（见第3步），除去毛皮使用一个微调。在分散酶溶液（5毫克/毫升的含10％FBS的DMEM）在37℃下1-2小时（1小时少于8周龄和2小时的小鼠的皮肤浸入试样老鼠老大于8周）。 中性蛋白酶处理后，表皮钳真皮分开。
5。产生单细胞要获得单细胞群体，肉表皮用剪刀，然后沉浸在胶原酶溶液（1毫克/毫升含10％FBS）为1-2小时，在37°C在50毫升管。试着轻轻地旋转管每20分钟，以帮助细胞解离。 在显微镜下检查细胞解离。当单细胞胶原酶介质中可以检测到，孵育样品需额外的30分钟，以提高细胞产量。在一般情况下，从一个鼠标的表皮可以产生高达10 7个细胞。 过滤通过细胞过滤器（孔径70微米），自旋细胞组织液通过台式离心1500转，并用PBS洗一次时间。
6。标签细胞进行流式细胞仪分析重悬细胞在10％FBS的在PBS中30分钟，在2.5×10 6个细胞/ ml，以阻断非特异性结合（在冰上） 径各1.5毫升的微管中的特定抗体标记细胞的等分试样。每个试管中添加不同的抗体，使最终浓度为2微克/毫升。混合抗体，细胞通过一个温柔的顶点几秒钟，让他们在冰上30分钟，然后用1毫升PBS洗。 BCC标本，我们采用了以下的生物标志物CD11b的PE加Gr1的APC（髓细胞或髓源性抑制细胞）;波形蛋白-FITC（成纤维细胞）（见试剂细节）抗体。 细胞内染色，我们使用了一个工具包，并按照厂商的说明书（见试剂细节）。我们用新鲜的细胞，分析细胞表面标志。表面标记物染色后，洗涤细胞，并在PBS重悬。加入DAPI染色的细胞混合物中的终浓度为1微克/毫升。 DAPI染色死细胞，将门从进一步的分析。 分析具体数据C软件。我们首先选择根据FSC与SSC情节的单细胞，并用DAPI人口负（活细胞）作进一步的分析。
Representative Results
它是已知的小鼠没有发展基底细胞癌，除了与Hh信号激活。 图1显示了平滑化的致癌基因的诱导表达后的皮肤的表型，SmoM2 YFP 图2显示了在正常和荷瘤小鼠的骨髓细胞分析。细胞CD11b + Gr1的+细胞是从骨髓细胞，其中一些是髓源性抑制细胞。在正常情况下，细胞CD11b + GR1 +细胞群体是很难察觉，但会增加炎症或肿瘤的发展。细胞CD11b + Gr1的+细胞增加，我们在皮肤结果表明，诱导表达的SmoM2YFP的。目前，这种变化在基底细胞癌的分子机制尚不清楚。
图1。 Morphologica升后诱导小鼠皮肤SmoM2YFP。小鼠基因型的顶部示出了示。他莫昔芬治疗K14creER +和R26 SmoM2的YFP +鼠标中间面板：显示严重异常（右）在皮肤以及皮肤肿瘤的H＆E部分（左）。底部面板的鼠标没有SmoM2YFP感应显示正常的皮肤（右）与H＆E段（左）无异常形态。
图2。流分析的CD11b + Gr1的+细胞的CD11b + Gr1的细胞 ，为了研究本皮肤癌的发展过程中，我们分离单细胞和染色的荧光标记的抗体CD11b和Gr1的。 FlowJo分析后，我们发现这种细胞人口增长从他莫昔芬治疗的小鼠皮肤组织。
Discussion
我们已经描述了一种用于在基底细胞癌的细胞群体分析。肿瘤组织中的许多细胞类型相一致的，不同的细胞类型不同的行为的发生在给定时间，这是非常困难的，即使在体外条件下的最夺回。使用此协议，我们发现，基底细胞癌的发展是伴随着扩张的表皮干细胞以及招聘髓细胞。比较，与免疫组织化学或免疫荧光分析，细胞种群分析更定量评估到多种细胞类型特异性抗体的细胞群的变化，因为现在可用。 对于这个协议中，需要完成10周诱导基因的表型变化的研究，因为需要时间。因此，它是重要的规划实验的时间提前。细胞的分离和分析，可能需要整整两天。由于用于活细胞分析产品上课，重要的是，以预定的时间提前一个FACSCALIBUR。我们还列出了常见问题的工作时，这个协议（见下文）。 根据我们的经验，下面是我们遇到的常见问题： 分离表皮差：这可能是由于不完整的中性蛋白酶治疗（请增加时间diapase治疗）或的中性蛋白酶不足的解决方案（皮肤需要完全沉浸在中性蛋白酶溶液）。我们使用中性蛋白酶溶液5毫升至少一个鼠标。该卷可能会发生变化，根据皮肤的大小。 手机号码：这可能由于胶原酶消化不完全的低收益率。请首先检查的胶原酶浓度或到期日。这也可以使用不足量的表皮造成的。此外，应进行酶消化至37℃振荡（请在调整进行消化之前的温度）。 细胞团块：这是很常见的皮肤细胞（移液器细胞了几次后，通过过滤器（离心之前），或存在的Mg 2 +和Ca 2 +的溶液中的（请使用镁2 +与Ca 2 +的PBS洗涤细胞）。 太多的死细胞退化的组织，这可能是一个结果（请使用新鲜组织），或过度消化（避免扩展潜伏期与中性蛋白酶和胶原酶）。 这个协议可以结合骨髓移植或组织移植研究的细胞来源。例如，移植的GFP表达到致死剂量照射小鼠的骨髓细胞，让我们检查骨髓细胞肿瘤相关成纤维细胞和骨髓细胞的贡献。同样，皮肤肿瘤可以移植到一个新的鼠标主机检查肿瘤 - 宿主相互作用。 除了检测细胞癌变过程中的人口变化，该协议也将允许研究人员，研究药物治疗的效果，肿瘤环境中的细胞。虽然这个协议被设计为使用在皮肤的细胞群体分析癌变，稍加修改就可以对其他类型的癌症。 综上所述，皮肤癌小鼠模型中的细胞群体分析可以给我们的动态细胞癌变过程的变化，从而更好地了解细胞生物学，肿瘤转化，在转化过程中不同的细胞活动。
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgements
这项研究是由美国国立癌症研究所（R01-9086），IU西蒙癌症中心和富国儿科研究中心支持。
Catalog Number
directPCR lysis reagent (tail)
Viagen Biotech
store @ 4 &C
proteinase K
store @ -20 &C
ApliTag 360 taq polymerase
Applied biosystems
store @ -20 &C
store @ 4 &C
Feeding needle (20 gauge)
Fisher scientific
Roche Diagnostic
store @ 4 &C
Collagenase IV
Worthington
store @ -20 &C
Cell strainer
Fisher scientific
Anti-CD11b-PE
eBioscience
12-0112-81
store @ 4 &C
Anti-Gr1-APC
eBioscience
17-5931-81
store @ 4 &C
Anti-vimentin-FITC
eBioscience
11-9897-80
store @ 4 &C
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