构建质粒载体中用PCR获得目的基因,其中涉及的引物为什么要加酶切位点?难道不论载体都要加酶切位点吗?
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获得目的基因后一般需要将目的基因连接到质粒载体上,在引物上加酶切位点可以使后续的连接过程简单、可控.因为可在载体和目的基因上酶切产生相同的切口.也有不需要加酶切位点的T载体,但连接过程效率不高还会有反向的错误连接.
请问“反向的错误连接”是？有什么影响？我只是用重组质粒载体做标准品的。
插入的目的基因无法正常表达，相当于把句子倒过来念。
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没有酶切位点的话怎么用限制性内切酶处理
没处理的话怎么连到载体上
当然要根据不同的载体来选择合适的酶切位点了，否则怎么把目的片段链接到载体上？
那是针对你的目的基因上没有载体上的酶切位点的情况！
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[求助]如何添加A尾
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这个帖子发布于10年零312天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
如题，使用PFU酶PCR获得目的基因后如何处理使其增加A尾，以便将其连接到T-VECTOR。先在此谢过了。
不知道邀请谁？试试他们
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请问你是基于什么样的目的来进行这个实验？如果你想用pfu酶来扩增目的基因片段来进行表达，那为何不在引物的两端设计适宜的酶切位点来进行克隆，如果你只是想调基因的话，那为何不用Taq酶进行PCR扩增？这样你就不必为加A尾巴而烦恼了。再进一步说，你可以选择进行平端连接啊。。没必要非得连到T-easy载体上啊。
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一下是我常用加A方法，效率很高：
PCR产物回收，在10体系中配置如下：pcr产物8ul，10mM dATP 1ul,普通taq酶 1ul。37度反应15min就能加上A.之后，电泳回收或酚仿抽提乙醇沉淀后，取适量用于T载体连接。
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可以在pfu中加点Taq酶pcr, 这样两者可以互补。回收产物后再进行T载体连接。
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把PFU酶得到的亮带切下，作为模板再用相同的条件扩增一次，此次用TAQ酶。这样就可以加上A了。
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关于丁香园对PCR产物加A尾(高保真酶,末端) - PCR实验 - 生物秀
标题: 对PCR产物加A尾(高保真酶,末端)
摘要: [对PCR产物加A尾(高保真酶,末端)] 我用的是高保真酶，PCR产物为平滑末端，如何用Taq酶对PCR产物加A尾？望说得详细一点。谢谢 关键词:[高保真酶 末端]……
我用的是高保真酶，PCR产物为平滑末端，如何用Taq酶对PCR产物加A尾？望说得详细一点。谢谢
回复方法现在很多实验指导上都有，很清楚，很简单。或者买个国产的加A盒，更方便。回复方法现在很多实验指导上都有，很清楚，很简单。或者买个国产的加A盒，更方便。回复用过天根的加A反应液，就是利用DNA与dATP反应来加A，按说明书操作即可，效果还可以回复
具有校正活性的热稳定性DNA 如Pfu DNA 聚合酶，Pwo DNA 聚合酶，Tli DNA 聚合酶在进行PCR 扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR 产物可以通过加A 尾程序后，连接到T载体。采用这种方法连接，只有一个片段插入，而平端连接克隆可能产生多个插入。Pfu 和Tli DNA 聚合酶产生的PCR 产物经过加尾处理，并以理想载体：插入片段比例进行连接，可得到55－95％重组子,值得注意的是，PCR 产物有必要采用纯化试剂盒进行PCR 产物直接纯化或凝胶纯化。若PCR 产物不进行纯化，Pfu、Pwo 和Tli DNA 聚合酶的校正活性在进行加尾反应或连接反应时，可降解PCR 片段的3’-A 或除去加尾反应的载体的3’-T突出端，同时会造成大量的假阳性白斑（即使加有IPTG和X-Gal）⑴由具有校正活性的DNA 聚合酶（如Pfu DNA 聚合酶）产生的PCR 扩增片段的纯化产物1-7μl；加入1μl Taq DNA 聚合酶10×反应（含MgCl2）；加入dATP 至终浓度0.2mM；加入5 单位的Taq
聚合酶；加去离子水至终反应体积为10μl⑵70℃孵育15-30 分钟⑶纯化试剂盒纯化（可不割胶回收）⑷采用1-2μl 用于T载体连接反应
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电话：021-大家酶切载体的时候回收完了用不用碱性磷酸酶处理啊？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 大家酶切载体的时候回收完了用不用碱性磷酸酶处理啊？
摘要: [大家酶切载体的时候回收完了用不用碱性磷酸酶处理啊？] 如题，讨论交流一下：因为好多载体酶切一次是可以用好多次的，大家酶切载体的时候回收完了用之前用不用碱性磷酸酶处理啊？我一般不用的，除非平端或单酶切。 关键词:[单酶切 载体 酶切 用不用 双酶切 碱性磷酸酶 磷酸化]……
如题，讨论交流一下：因为好多载体酶切一次是可以用好多次的，大家酶切载体的时候回收完了用之前用不用碱性磷酸酶处理啊？我一般不用的，除非平端或单酶切。回复我都处理的，呵呵。反正也花不了几十分钟，防止双酶切不彻底的那部分单酶切产物自连。回复
我都处理的，呵呵。反正也花不了几十分钟，防止双酶切不彻底的那部分单酶切产物自连。 之前不用处理是因为一是觉得麻烦，二是做连接也很少出现假阳性，但是最近做克隆有点不顺啊，谢谢交流回复双酶切从来不去磷酸化，太麻烦了。。。只有单酶切的时候去磷酸化回复避免两端都是平末端、避免单酶切，就避免用CIAP回复只有单酶切的时候怕载体自连才会去磷酸化处理回复一般单酶切或平末端需要处理，双酶切理论上不用处理。但我一般两个酶分开切，这样保险一点。
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电话：021-,你好,最近我用XcmI做了一个T载体,但是与带A尾的PCR产物却连不上, - 实验交流 - 生物秀
标题: ,你好,最近我用XcmI做了一个T载体,但是与带A尾的PCR产物却连不上,
摘要: [,你好,最近我用XcmI做了一个T载体,但是与带A尾的PCR产物却连不上,],你好,最近我用XcmI做了一个T载体,但是与带A尾的PCR产物却连不上,不知道是什么原因,而且后来双酶切载体和PCR产物后仍然连接效率不高,通过对照我已排除了转化效率的影响 推测会是什么原因呢?或者有没有可以改善的方法?回复:一般来说，单碱基突出末端和平末端的连接效率比黏性末端的连接效率低50倍左右。商业化的T载体试剂盒一般都提供连接酶，连接酶的浓度已经调整好了。建议你使用高浓…… [本文关键词:连接酶 碱基 黏性末端 酶切 外切核酸酶]……
,你好,最近我用XcmI做了一个T载体,但是与带A尾的PCR产物却连不上,不知道是什么原因,而且后来双酶切载体和PCR产物后仍然连接效率不高,通过对照我已排除了转化效率的影响.推测会是什么原因呢?或者有没有可以改善的方法?回复:一般来说，单碱基突出末端和平末端的连接效率比黏性末端的连接效率低50倍左右。商业化的T载体试剂盒一般都提供连接酶，连接酶的浓度已经调整好了。建议你使用高浓度的连接酶，50倍正常用量。另外，由于酶用量提高了，残余的杂酶活性也会提高，要防范外切核酸酶切除3‘末端的突出碱基。因此最好用高质量的连接酶。
很高兴看到你能自己制备T载体，请将好的经验和喜悦让大家共享。
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