血液检测艾滋病
艾滋病抗体检测医学原理：
HIV抗体检测用试纸系采用经胶体金标记的重组HIV抗原（Au-HIV-Ag)包被的玻璃纤维素膜、重组HIV抗原（HIV-Ag)和抗HIV单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜制成。采用胶体金免疫技术和层析原理，定性测定血清样本中的HIV1/2型抗体。检测阳性样本时，血清样本中HIV抗体与胶体金标记抗原结合形成复合物，由于层析的作用复合物沿纸条方向移动，经过检测线时与预包被的重组HIV-Ag结合形成“Au-HIV(1+2)-Ag-HIV-Ab-HIV(1+2)-Ag”夹心物凝聚显色，游离的胶体金标记物重组Au-HIV(1+2)-Ag则在对照线处与抗HIV单克隆抗体结核而富集显色。阴性标记物则仅在对照处显色，30分钟内观察结果即可。
免疫层析快速检测技术特点：
检测样品多样化，末梢血、静脉全血、血清血浆均可检测，检测准确可靠，可以单个测试，也可成批检测；操作简单，即用即检测，操作只需要1-2步骤，10-30分钟内分钟判读结果，且结果稳定（可最长到60分钟内判读）；
临床应用范围：
日常高危行为检测；急诊检测（外科手术、输血）；职业暴露；母婴筛查；就职和体检；偏远地区户外检测；自愿咨询与检测（VCT）。
艾滋病检测的采血方法和采血部位：
常用艾滋病检测试纸技术和操作综合说明
常规HIV(1+2)抗体血液检测试纸检测原理图
常规HIV(1+2)抗体血液检测试纸结构彩图
常规HIV(1+2)抗体血液检测试纸原理动画演示
常规HIV(1+2)抗体血液检测试纸检测操作简图：
艾滋病试纸检测操作步骤真人示范说明图：
检测的常规配套物品工具
消毒皮肤后往指尖部按摩把血集中在指尖
用自动采血针紧压皮肤刺破皮肤（采血针使用方法详见采血说明）
往试纸圆控滴入1至2滴血
血液滴入此处
再滴入稀释液一滴
完成后开始计时，30分钟内读取结果，超时无效：
阴性结果图
阳性结果图
检测结果说明：
阳性结果(+)：两条红色条带出现。一条带位于测试区内(T)，另一条带位于质控区内(C）。
阴性结果(-)：仅质控区(C)出现一条红色条带，在测试区内(T)无红色条带出现。
无效：质控区(C)未出现红色条带，表明检测操作无效,应换试纸重新检测。如果多次检测无效,属于试纸质量问题,请与供应商联系。
真人血液检测艾滋病操作视频
美国雅培Determine HIV人类免疫缺陷病毒抗体胶体硒法检测试纸介绍：
Determine HIV人类免疫缺陷病毒抗体胶体硒法试纸条是一种用层析法定性被检物质的测试。此产品的灵敏度为100%；特异性为99.8%。能检测出所有的HIV-1型、HIV-2和O亚型的样品。　
检测生物学原理：
HIV1/2快速测试试纸是一种用免疫层析法原理定性测定血样的HIV抗体。加样本入反应条，如果样品中含有HIV1/2抗体，抗体将会与硒胶体-抗原结合，被固相包被的合成肽和重组抗原所捕捉固定，形成一条红线。如果样品中不含有HIV1/2抗体，硒胶体-抗原结合物将不会与固相包被的合成肽和重组抗原结合，则没有一条红线形成。
为了确保结果有效，在反应中应含有质控条带。
Determine HIV胶体硒法试纸条的主要特点：
品多样化：末梢血、静脉全血、血清血浆均可检测
操作简单，即用即检测，操作只需要1-2步骤
双抗原夹心法可同时检出IgG和IgM。缩小了早期检测存在的“窗口期”。
纸条的捕捉位点包被有HIV-1，HIV-2和O亚型抗原，可最大限度的检测出感染者，最大限度的避免漏检。
采用“硒”标记HIV抗原，使层析的条带更为清晰。
可以单个测试，也可成批检测；15分钟判读结果，且结果稳定（可最长到60分钟内判读）；保存方便，无须另外的设备；试剂可室温保存12-14个月
灵敏度可达100%，临床特异性可达99.8%以上。
雅培检测试纸结构和检测操作方法：
雅培操作步骤和检测结果简图：
本站已开发出专业的艾滋病检测高可靠性操作方法，让你自助检测更准确.
关于艾滋病检测的重要提示：
1、请平放试纸进行检测，并在规定的时间内平视判读检测结果。当检测出现阳性结果时，必须排除假阳性的可能！阴性和阳性是各种医学检测实验结果的判别方式之一，称为定性检查，阴性的含义类似于“无”；而阳性的含义类似于“有”。但是由于试剂的技术、敏感性、质量等多种因素影响，任何医学检测都有出现假阳性的可能，所谓假阳性，是指检测试剂将阴性结果错误判读为阳性， HIV检测试纸在技术质量要求上通常是允许出现假阳性不允许出现假阴性，因此在窗口期后检测是阴性就可以排除HIV感染，但出现阳性不一定是真的阳性，需要使用另外的检测方法进一步检测复查，才能最终证实是不是真阳性结果，因此如果你此次检测出现阳性结果，请勿惊慌，请马上到当地的CDC（即中国疾病预防控制中心，以前是防疫站）做WB确诊实验进行复查，根据医疗法规和医学诊断标准，WB实验检测结果才是艾滋病的最终诊断结果。
2、如果滴入的血量过少，或者不加稀释液，可能会导致检测实验失败，如果你的血液粘稠度很低，检测时候不加入稀释液也可顺利进行检测。如果血液粘稠度比较高，不能顺利渗透完整个的试纸检测区,可在加血后1~2分钟内用吸管往加样区（孔）滴入1~2滴的稀释液(即缓冲液，随试纸配置)，以便让检测顺利进行。稀释液加入量一般为1~2滴左右，建议稀释液量不超过血液量，一般2-3滴血加入1滴稀释液进行HIV检测。
3、 据一些检测者反映，在检测判读时间内检测结果为阴性，但超出判读时间后在试纸T区（也叫病人条带或测试区）反应位置可能会出现非常轻微的显影线或其他线条（需要非常费力察看才看到），一些无经验的自测者很容易把显影误判为阳性反应造成心理恐慌，经过我们分析，我们认为这这种现象不是阳性反应结果，这种情况可能是有色标记物持续释放造成的，我们可以理解为标记物包埋线在湿润后的显影，往往是因为滴入过多的血液量检测导致，也可能和某些生产批次的检测试纸的吸附性能有关。真正的阳性反应线，是很清楚显现的，无须费力细看才能看到，而且显现后不会消失。在出现这种情况时候，请按照阴性判读，或者请把加入的血液量控制为一滴，重新进行检测。或者使用我们的微量高精度试管采集血液进行复查检测。
如果这种现象给你造成心理压力，请把检测结果拍照发到论坛（网址www.120x.net）或者我们的邮箱（）给我们进行专业分析,你也可以到医院进行复查，并以医院复查结果为准。
4、艾滋病检测试纸和缓冲液、相关的配套物品均无菌无毒，和身体发生接触是无任何危险性。
5、对于以上检测方法不能理解或者不能熟练掌握者，或需要更精确进行复查检测者，请使用我们的高精度微量试管采集血液进行检测操作，详情点此浏览。
邮寄血液检测艾滋病方法：
本方法是让检测者采血2～3滴滴入专用的特殊纸片里面，干燥后再把纸片密封邮寄给我们，然后我们使用专业的技术把干血中的抗体成分吸附出来进行检测，本方法耗时比较长，仅建议特殊情况下采用。
滴入2～3滴血液到专用纸片的圆心位置，干燥后邮寄给我们。
我们把渗透血液部分的圆心纸剪下。
我们把血液渗透的纸片粉碎。
把粉碎后的纸片放进试管，加入特殊的培养液缓冲液，提取血液的抗体成分进行检测。
那些行为需要检测艾滋病（高危行为）？
1、在无保护下和高危人群发生关系，称为高危性接触、高危性行为
2、在有保护下和高危人群发生关系，称为与高危性者发生安全性行为
3、在无保护下与普通人群（普通人、同学、网友等）发生性关系，称为一般性关系
4、在有保护下与普通人群（普通人、同学、网友等）发生性关系，称为安全性行为
5、在无保护下与普通人群发生舔阴、口交、乳交、手淫等，称为一般性行为
6、在无保护下与高危人群发生舔阴、口交、乳交、手淫等，称为低度危险的高危人群性行为 （男性被动方式口交、乳交、手淫罕见感染属一般性行为）
7、在有保护下与同性发生性行为，称为一般性行为
8、在无保护下与同性或同性高危人群发生性行为，称为高度高危行为
9、在无保护下与同性或同性高危人群发生舔阴、口交、手淫等，成为低危性行为
10、无伤口或有保护下触摸座椅、针头、伤口、小姐的手、内裤、分泌物等等，属于极度低危行为。
以上第 1、 6、 8 、9 项 有检测艾滋病毒的必要。只有对各种行为进行仔细分类与划分，才能正确的评估感染风险，并及时进行检测诊断，如果初筛检测阴性则可排除感染，如果初筛阳性，必须到CDC（疾控中心）采用WB法进行复查，排除假阳性可能，并最终确诊有无感染。
HIV检测“窗口期”及其计算
HIV检测“窗口期”
是指人体感染HIV后对HIV病毒作出的免疫反应，即体内产生HIV抗体所需要的时间，医学上又叫“血清阳转”（seroconversion）。在窗口期内，虽然HIV感染者血液、精液（或阴道分泌物）、乳汁中可能已经有很高浓度的HIV，但血液内没有HIV抗体，此时在窗口期内进行血液HIV抗体检测，有可能查不到抗体造成漏查误诊，所以必须要过了窗口期才能准确检查艾滋病。据医学研究表明，人体感染艾滋病毒后，产生艾滋病毒抗体的时间短的为2-3周，长的为2至3个月，平均时间约为6周；如果使用比较先进的检测试剂，一般在感染2-6周后都可以检测到病毒抗体从而能及时发现病情。
窗口期计算方法：
窗口期的计算应从高危行为之时或是接受输血之时算起，也就是说，如果你是1月1号发生高危性行为或是接受输血，那么，你接受抗体检测的时间应该是从1月1号算起6周后，也就是2月12日，如果还需复查，那么需要从1月1号算起，3个月后进行复查检测。
关于艾滋病检测使用缓冲液（即稀释液）的作用：
功能：加入缓冲液有助于跑板，缓冲液也叫稀释液，是渗透压、PH值都和血液一样的缓冲溶液，它使红血球可以保持原来的形状，不会产生凝集和溶血现象，并维持持反应内环境稳定，屏蔽非特异性结合。从而使检测过程的顺利进行.，同一产品的不同批号的缓冲液可以通用，在一般情况下, 不用稀释液也能出结果，不过检测反应的速度会降低；如果血球浓度太大(血液太粘稠)或室温较低，这些情况可能会导致无检测结果出现，此时应加入稀释液，使检测顺利进行。
用法：正确的使用方法应该是先将血液滴入试纸，在几秒到一分钟之内加上一滴稀释液，促进反应。如果血液加样几分钟以后再加缓冲液，结果可能会不太好，因为血液将近凝固，缓冲液没有起到作用。如果稀释液太多了，造成人为降低标本浓度，可能降低试纸的灵敏度导致阳性率降低。但如果在气温较低(如冬天)、空气湿度较大的情况下检测，还是要加入稀释液，以免检测失败
注意：HIV试纸稀释液不能用别的液体来代替，如自来水、纯净水、生理盐水、蒸馏水等。
如果检测反应能够顺利进行，并不一定要加入稀释液。添加稀释液切勿加得太多，加入1滴即可，最多不能超过2滴。
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导读： 人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的检测指标主要有抗-HIV、P24抗原和HIV RNA，特异抗体和抗原的检测方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、免疫渗滤层析（胶体金或硒试纸条）、免疫荧光试验、化学发光免疫测定和蛋白印迹（WB）等。ELISA
作者：卫生部中心 李金明
人类缺陷病毒（HIV）感染的检测指标主要有抗-HIV、P24抗原和HIV RNA，特异抗体和抗原的检测方法主要有酶联吸附试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、免疫渗滤层析（胶体金或硒试纸条）、免疫荧光试验、化学发光免疫测定和蛋白印迹（WB）等。ELISA、PA、免疫渗滤层析和化学发光免疫测定均属于初筛试验。WB为HIV抗体的确认试验。HIV RNA的检测方法主要有实时荧光逆转录（RT）-聚合酶链反应（PCR）、基于核酸序列的扩增试验（NASBA）、分枝DNA（bDNA）等。HIV RNA检测亦可作为抗-HIV、P24抗原免疫测定呈阳性反应时确认试验。
一、HIV感染后外周血循环中特异抗原、抗体及核酸的出现
HIV为双正链RNA病毒，病毒外膜为来自宿主细胞的磷脂双分子层，其间嵌有病毒的gp120与gp41蛋白。gp120位于病毒表面，gp41是跨膜蛋白，gp120与gp41以非共价形式结合在一起。病毒衣壳则主要由p24蛋白组成。
自AIDS的病因发现为HIV后，上世纪80年代中期，人们要求有快速的HIV-1感染筛选试验主要有两个目的：（1）为献血员血液的筛查提供一个快速、可靠和价廉的手段，从而降低经感染HIV的危险性；（2）为HIV感染的诊断提供敏感的方法。第一代用于献血员常规检测的ELISA试剂盒出现于1985年3月。到目前为止，测定HIV感染的ELISA试剂盒，基本上都是测定HIV抗体，其依据主要是绝大多数HIV感染者在感染HIV后几周或数月体内即会出现对HIV的各种蛋白成份的抗体应答，仅有个别感染者抗体的出现明显迟后（达3年或更长时间）。受感染者的大量的血清学试验表明，其抗HIV抗体所针对的主要抗原基本上一致，尽管每个感染者间单个抗体的特异性及相对水平出现时间有所差异。HIV所编码的结构和调节蛋白有许多，但激发机体产生抗体并出现于血循环中的主要有三种：（1）膜（ewu）蛋白：前体膜糖蛋白gp160及其两个主要亚单位，gp120和gp140；（2）多聚酶（pol）蛋白：逆转录酶p66和核酸内切酶p31；和（3）核心（gag）蛋白：前体蛋白p55及其组成成份p24，p18和p15。
机体感染HIV后，血液中最早可检出的是病毒的RNA，大约在感染后的平均5～9天即可检出，约16天可检出P24抗原，约22天出现可检出的抗体。针对p24和病毒表面蛋白（尤其是gp160和gp41）为机体内最早出现的HIV抗体。在感染初期，即抗体出现之前，外周血循环中病毒核酸的含量最高，可达到10^6 IU/ml以上，出现抗体后，HIV RNA水平即下降，一般在10^4 IU/ml。
二、HIV感染的检测方法
抗-HIV ELISA作为一种HIV感染筛选实验，在测定的特异性和敏感性上，更为强调测定敏感性。因为一则有抗-HIV验证试验可对抗HIV ELISA阳性结果进行验证，二则抗-HIV测定如有漏检，可能会发生潜在的严重后果，如血站在筛选献血员时。
ELISA测定方法是HIV抗体检测最常用的初筛检测方法，其经历了从第一代到第四代的发展过程。第一代抗-HIV ELISA试剂盒是使用在体外培养的HIV裂解物作为抗原，而建立的间接抗体测定方法，但在不同的商品试剂盒中，病毒裂解物所含的每种主要HIV结构和表达蛋白可能有明显不同，尽管通常包括有外包膜糖蛋白（即gp120及其前体gp160）和gag衍生产物（尤其是p24和p17抗原）。间接ELISA测定方法所测得的抗-HIV抗体确切地说应是抗-HIV IgG，因为酶标二抗即抗人IgG，决定了这一点。使用HIV裂解物作为包被抗原所建立的ELISA方法所产生的假阳性主要是由于某些患者血清中针对某种共同HLA抗原（尤其是HLA-DR和其它Ⅱ类抗原）的污染物结合，其它如测定前对血清加热灭活、慢性血液透析患者、急性疟疾、麻疯分枝杆菌感染患者、系统性红斑狼疮等亦可致假阳性。
第二代抗-HIV检测试剂与第一代的不同点是，其采用基因工程重组抗原或合成肽替代培养病毒抗原，测定模式仍为间接法。由于基因重组抗原的应用，避免了因为HLA抗原所致的假阳性结果。
第三代试剂与第二代的不同点主要在测定模式上，其采用双抗原夹心法替代间接法。由于双抗原夹心法测得的抗-HIV，不仅是IgG类，还有IgM、IgA等，并且不用担心标本量大可能因为标本中非特异IgG干扰而出现假阳性结果，因为双抗原夹心的标本用量较间接法可大大增加。因此，第三代试剂与第二代试剂相比，测定敏感性大大提高。目前国产的抗-HIV ELISA试剂盒亦均为双抗原夹心法。
采用双抗原夹心一步法检测抗-HIV，需要注意的是由&钩状效应&所致的假阴性问题。HIV感染者中有些抗体滴度很高，采用可出现双抗原夹心一步法检测，可出现类似双抗体夹心一步法检测抗原的&钩状效应&现象。因此，为避免因&钩状效应&出现假阴性，在血站筛检献血员时，国产试剂盒均为二步法。
因此为改善抗-HIV ELISA测定的敏感性和特异性，人们将基因重组HIV抗原取代病毒裂解物作为包被抗原，基因重组HIV抗原不但纯度高，而且易于大量得到，亦能很好控制包被浓度和不同成分量的比例。但缺点是重组抗原可能在抗原决定基上有所损失，与天然蛋白相比由于糖基化的某些差异而可能有所不同。
所谓的第四代抗-HIV检测ELISA试剂盒，即为抗体和P24抗原联合检测试剂。用于献血员血液筛查可以缩短检测的窗口期。
蛋白印迹（WB）试验是抗-HIV的确认试验，其是将培养HIV裂解后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使各抗原组分得到分离，再转印至硝酸纤维素膜上。抗体检测时，将血清标本加入至硝酸纤维素膜上，温育后，标本中的特异抗体即可与膜上相应抗原结合，洗涤后，再加入酶标抗人IgG抗体，温育洗涤后，再加入底物显色。
Western Blot试验结果的判断可按如下原则进行[中国疾病预防控制中心《全国检测技术规范》（2009年修订版）]，如为下述情况可判为阴性：①在整条膜上未出现任何显色条带；②未出现与已知分子量病毒蛋白相应的条带。在进行Western Blot试验中，常见膜上出现与已知分子量HIV抗原无关的条带，这些条带的出现通常与HIV抗原中混有某些可与HIV抗体产生交叉反应的蛋白所致。这种交叉反应条带的出现，不同厂家生产的试剂盒或同一厂家不同批号的试剂盒均不相同。Western Blot试验的阳性判断标准为:①在抗-P24、抗gp41和抗gp160／120三条带中，出现至少两条以上的阳性；其所依据的标准是由美国the Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors在1988年建立的，并于1989年为美国CDC( the Centers for Disease Contro1)所采用；②符合特定试剂盒提供的阳性判断标准，不能判断为阴性或阳性的Western Blot结果，可定为&不确定&。其主要表现在膜上出现与已知的HIV蛋白相关或其它未知蛋白(可能为非病毒蛋白)的反应条带，最常见的是抗-P24条带单独阳性和／或抗-P55条带阳性。其它常出现的非特异反应条带大部分可能是由于病毒裂解物内混杂有具交叉反应的HLA I类和Ⅱ类抗原所致，使用重组的HIV抗原替代病毒培养裂解物制备Western Blot硝酸纤维膜抗原条带，无疑将大大减少此类&不确定&结果的出现。&不确定&结果如果具有临床症状或HIV高危接触史的患者，则应立即对原样或新鲜样本(可能的话)重新检测，如仍为&不确定&，则可测定病毒核酸，或在数月内再次检测，此时如仍未出现明确的阳性，则基本上可以排除HIV感染的可能性。
Western Blot之所以不适用作HIV抗体筛查试验，主要是因为这种&不确定&结果的出现频率太高。有研究表明，在使用ELISA和PCR方法测定为阴性的同性或双性恋患者血清中，有20～30%使用Western Blot方法检测可出现一个或更多的条带，而且，在一年多的跟踪检查中，仍有70%抗HIV ELISA、HIV RNA RT-PCR测定阴性和Western Blot可疑的同性恋患者在做Western Blot时出现一条或多条带。对低危人群的研究，同样发现有这种情况。因此，Western Blot只适合作ELISA或其它抗HIV筛查试验阳性的确认试验。
HIV RNA检测在国内目前主要采用实时荧光RT-PCR方法。疾控部门和国内一些传染病医院，在进行HIV载量检测时，较多使用进口的bDNA试剂。临床检测病毒载量，目的是监控抗病毒治疗效果。血站献血员血液筛查则为定性检测，目前国内外均使用实时荧光RT-PCR和转录介导的扩增（TMA）方法。病毒核酸检测是到目前为止，能最大程度缩短检测窗口期的最有效方法。
(责任编辑：admin)
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即送15丁当
【请教】双抗原夹心法
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这个帖子发布于10年零233天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
在用双抗原夹心法检测抗体时，分别会用到包被抗原和标记抗原。我现在不明白的是，当样品中的抗体与包被抗原结合后，抗体上的结合位点就被占用了，那标记抗原是如何与抗体结合的呢？
不知道邀请谁？试试他们
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抗体是Y型的，分子量大于抗原，所以结合包被抗原用了一个丫叉，还剩一个可结标记抗原。
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这个不一定的，万一一个抗原分子的两个丫叉都结合抗原了，那标记抗原也结合不上的。不可能说每个抗体分子都只用一个叉来结合一个抗原分子的，而把叉头的另一个位点空着，做不到这样均匀的，尽管理论上是存在“只结合了一个抗原的抗体分子”
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为了便于理解，看下面的示意图：绿色代表样品中的抗体；红色代表“包被抗原”，与样品结合；蓝色代表“标记抗原”，与红色的“包被抗原”结合。例如：样品是小鼠a蛋白，就是绿色的部分；包被抗原是兔抗小鼠IgG，就是红色部分；标记抗原是荧光素标记的羊抗兔IgG，就是蓝色部分。
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这个示意图很明确了就是包被抗原与抗体分子的Fab片段结合，标记抗原与抗体分子的Fc片段结合。不过好象能与Fc结合的抗原不多，象金黄色葡萄球菌的A蛋白是可以结合很牢固的
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通常的双抗原夹心法都是将待检测物和标记抗原同时加入已包被封闭好的酶标板上，不知这样的目的是不是为了让抗体同时和包被抗原、标记抗原结合？
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是可以这样得，但是两种抗原的结合率要一样，不然数据根本没说服力
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wuyuhere 通常的双抗原夹心法都是将待检测物和标记抗原同时加入已包被封闭好的酶标板上，不知这样的目的是不是为了让抗体同时和包被抗原、标记抗原结合？不是，两步法同样可以达到这个效果。将待检测物和标记抗原同时加入已包被封闭好的酶标板，这个是双抗原一步法，这只是在中国医院或其它使用者都希望使用操作简便以及快速的试剂盒，导致厂家都在研制一步法试剂盒，在国外基本都是两步法，且反应时间都比较长。其实无论是双抗体夹心法还是双抗原夹心法，都是两步法更为好和准确，不会产生在一步法中可能出现的钩状效应等问题。以现在HIV抗体检测为例，很多试剂厂商都在一开始推出一步法检测试剂盒，但由于国家药品监督管理局对艾滋病问题的重视，通过强制手段使得厂商不得不讲原来的方法改成两步法。
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谢谢各位的解答！那么，怎么样的抗原能与抗体的Fc结合呢？结合的特异性如何？
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我估计还是用蛋白A或G作为标记抗原，其实这样就不如说是间接法了
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jilar 为了便于理解，看下面的示意图：绿色代表样品中的抗体；红色代表“包被抗原”，与样品结合；蓝色代表“标记抗原”，与红色的“包被抗原”结合。例如：样品是小鼠a蛋白，就是绿色的部分；包被抗原是兔抗小鼠IgG，就是红色部分；标记抗原是荧光素标记的羊抗兔IgG，就是蓝色部分。看不懂. &包被抗原是兔抗小鼠IgG&? &标记抗原是荧光素标记的羊抗兔IgG&?-抗原抗体搞混了!
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双抗原夹心不应该是抗体是“心”，夹在抗原的中间吗？
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与待测抗体Fc段结合的指示抗原不需要特异性！
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关于丁香园为什么双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法?
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1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2） 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3） 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4） 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心复合物.类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2,图1-4）,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应（hook effect）,因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标.双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.
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