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激光扫描共聚焦显微镜与图像半定量的优点
激光扫描共聚焦显微镜与图像半定量分析相比，具有以下优点：&&&& 1．更精细、精确度更高。激光扫描共聚焦显微镜对免疫荧光组织化学染色样品做定量分析时，利用激光聚焦和系统软件分析对组织进行深层扫描，不破坏组织结构，可深层次准确定位并精确定量。而一般图像分析只是以荧光灰度的差别变化进行半定量分析。&&&& 2．激光扫描共聚焦显微镜一般有两个以上不同波长的激光管，只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析两种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，精确而又方便，这一特点是一般图像分析无法比拟的。&&&& 3．激光扫描共聚焦显微镜可根据需要提供纯荧光、白光以及荧光&与白光合成图像等多种图像，远远优于一般图像分析。&&&& 4．以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，用石蜡切片在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强影响观察结果。而石蜡标本来源广泛，适用于回顾性研究。激光扫描共聚焦显微镜可扫描石蜡切片的荧光染色，可避免因背景非特异性荧光过强而影响观察结果，从而可获得清晰图像，这也是激光扫描共聚焦显微镜的优势所在。
（来源：上海一研科研产品订购网）
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激光扫描共聚焦显微镜在海洋动物发育生物学上的应用激光扫描共聚焦荧光显微镜_百度百科
激光扫描共聚焦荧光显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器。主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
激光扫描共聚焦荧光显微镜历史
·1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
·1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
·1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
·1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
·1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
·1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。
·随后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜，产品的性能不断改进和更新，应用的范围也越来越广。
激光扫描共聚焦荧光显微镜共聚焦扫描显微镜的成像原理
采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个横切面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。
激光扫描共聚焦荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜基本结构
激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦荧光显微镜（1）扫描模块
扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。
激光扫描共聚焦荧光显微镜（2）荧光显微镜系统
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由。
激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。
激光扫描共聚焦荧光显微镜（3）常用激光器
激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：
半导体激光器：405nm（近紫外谱线）
氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（蓝绿光）
氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器）633nm （红光—氦氖红激光器）
UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光）
激光扫描共聚焦荧光显微镜（4）辅助设备
风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片。
激光扫描共聚焦荧光显微镜相对普通荧光显微镜的优点　（1）：LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理：（2）LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；（3）由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径：（4）LSCM除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能，前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定；后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及技术、荧光漂白后恢复技术等。
激光扫描共聚焦荧光显微镜激光扫描共聚焦荧光显微镜的缺点
标记染料的光漂白：为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度；而高强度的激光会使染料在连续扫描过程中迅速褪色。
光毒作用：在激光照射下，许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素。限制扫描时间、激发光强度，以保持样品的活性。
激光扫描共聚焦荧光显微镜样品要求
1，样品经荧光探针标记； 2，固定的或活的组织； 3，固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上； 4，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片；
5，载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右
6，标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发； 7，尽量去除非特异性荧光信号； 8，封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
中国电子学会（Chinese Instit...
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企业信用信息知道激光共聚焦显微镜的分辨率吗?到底比普通显微镜高多少?
真实色共焦显微镜与激光扫描共焦显微镜,二者在成像原理上基本是一样的,最大不同之处是照明光源不同.1、激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜的照明光源是激光,即单色光.其实际成像过程是根据被观察物体对该单色激光的反射光的强弱来成像的.由于是单色光照明,不能分辨颜色,对于在同一试样的同一视场内,颜色不同,但对该单色激光反射光强度相同的不同组织或成分不能分辨.容易产生同相异色,同色异相的现象,不利于对微观组织和成分的正确分辨.2、真实色共焦显微镜真实色共焦显微镜的光源是氙光源,即白光.其实际成像过程是在白光照明的条件下,对物体形貌（包括颜色）进行综合的成像.由于是多色光照明和成像,真实色共焦显微镜能够更真实的反应物体的颜色和形貌,避免了激光扫描共焦显微镜产生的同相异色,同色异相的现象发生,观察者可以通过颜色,分辨和判断试样的成分和组织.在这方面,其分辨率远强于激光扫描共焦显微镜综合分析：在有颜色差异的试样的观察条件下,真实色共焦显微镜避免了激光扫描共焦显微镜产生的同相异色,同色异相的现象发生,观察者可以通过颜色,分辨和判断试样的成分和组织.在这种条件下,真实色共焦显微镜的分辨率高于激光扫描共焦显微镜.在单色试样的观察条件下,分辨率才接近各自的技术指标.然而,在实际观察的试样中,绝大多数不同的组织和成分都是有颜色差异的.对应于没有颜色差异或颜色差异小的试样,可以通过人为的染色（例如腐蚀处理）,提高图像的分辨能力.在这一方面,激光扫描共焦显微镜是无能为力的.另外,分辨率是在特定条件下所能达到的一项技术指标,当在实际使用中,不满足该技术条件时（实际是常常不能满足）,其分辨率是达不到所给出的数值.下图是镍铬合金在普通单色激光共聚焦显微镜中的成像,以及使用真实色共聚焦显微镜所成图像的对比,其中红圈内是不同的化合物掺杂,可以清楚看到用单色激光共聚焦显微镜所成的图像,仅凭灰度是无法准确反应其中化合物掺杂的区别的,而真实色共聚焦却可以清楚区分他们的不同.
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