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Th1_Th2细胞亚群的特异性表面标志及其鉴定
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Th1Th2细胞检测方法.pdf19页
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Th1/Th2细胞检测方法 [- 1 - ]
Th1/Th2细胞检测方法
版本:第一部分 免疫学基础. 淋巴细胞概述
在免疫细胞中,执行固有免疫功能的细胞有吞噬细胞、NK细胞、B1-B细胞等等;执行
适应性免疫功能的是 T及 B淋巴细胞,并有抗原提呈细胞参与作用,这种免疫细胞均源于多
能造血干细胞(multiple hematopoietic stem cells,HSC)。HSC分化为髓系祖细胞(myeloid
progenitor)、淋巴系祖细胞(lymphoid progenitor)。髓系祖细胞分化产生粒细胞(中性、嗜
酸性、嗜碱性)、单核-巨噬细胞、巨核细胞、树突状细胞及红系细胞的母细胞;淋巴系祖细
胞分化产生 T细胞、B细胞、NK细胞及部分树突状细胞,如图 1。
T淋巴细胞(T lymphocyte)简称 T细胞,来源于骨髓的淋巴样干细胞,在胸腺发育成
熟为 T细胞,随后移行至外周淋巴组织,如图 1。T细胞在免疫应答调、免疫调节中担当着
重要的角色,不仅执行特异性细胞免疫应答,而且并在胸腺依赖抗原(thymus dependent
antigen,TD-Ag)诱导的体液免疫应答中发挥重要作用。因此,研究动物及人体 淋巴细胞
活化机理是免疫学及相关学科非常重要的领域。生物工程技术的发展使免疫疗法在肿瘤、自
身免疫性疾病、传染性疾病的治疗上有了很大的突破。免疫疗法的迅速发展,使得医务工作
者、医学科研人员有更多进行临床试验的机会,可以从临床试验中得到更多有用的数据,这
技术支持: 电子邮件:
免费电话:800
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Th1/Th2细胞检测方法 [- 2 - ]
样就有可能更好地建立评测 淋巴细胞功能的方法。
不同淋巴细胞亚群命名方法很容易混淆,不同的检测方法、不同的分类标准常常会出现
分类交叉的情况,如果按细胞表面分子标记(如
正在加载中，请稍后...人Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测(2)
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责任编辑：大汉昆仑王0
本文汇总了流式细胞术实验中常见问题 （无法标记、PE抗体检测...
在上世纪 30 年代，免疫组织化学（ Immunohistochemistry ，简称 IHC...
1． 固定：最好用 4% 的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固...
改良多聚－L－赖氨酸防脱片载玻片的制备 徐婷 （海门市人民医...
一、标本的收集和保存 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血...
在流式细胞仪分析中用到的荧光补偿这个术语是指修正荧光渗漏...细胞内细胞因子的流式检测实验方法---以Th1和Th2的检测为例
Time： PM 20:43　　Author:bioer　　Hits:　
　　随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limitingdilutionanalysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。&
　　随着多标记及标记细胞技术的出现，使对细的研究推向了一个新的阶段。
　　下面主要介绍胞内细胞因子细胞技术。
&&& 　早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-&&)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
&&&　 近年来，Jung与Picker采用了莫能霉素monensin、佛波酯PMA等药物预孵，用布雷菲（尔）德菌素Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
　　胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
二、仪器设备及耗材&
1．12&75mm有盖的Falcon管
2．37℃孵箱5%CO2（无CO2也可）&
3．混匀振荡器&
4．离心机&
5．加样枪、Tips(1ul,10ul,100ul,1000ul)&
6．FACS流式细胞仪及配套耗材&
三、所需试剂&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂
&& 依据实验需要选择特殊表面标志
&& CD45圈定所有淋巴细胞　　　　　　 CD3 圈定T淋巴细胞
&& CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群&　　　&& CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
&& CD19/CD20圈定B淋巴细胞&　　　　&&&CD56圈定NK淋巴细胞
&& CD14圈定单核细胞
2、的荧光标记的单抗试剂
　　依据实验需要选择特殊胞内标志。检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-& 。例如，双色标记IFN&-FITC/IL-4PE 与CD3PerCP 组合是同时研究Th1与Th2型免疫反应常用选择。
　　成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用BFA等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。BD在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。&&
3、FACS溶血素&
　　用于PBMCs、培养细胞与全血制备，主要有3个作用：a、全血制备时用于溶解红细胞；b、固定外表位；c、辅助通透剂。&&&&&&&
　　FACS溶血素使用前用无离子水10倍稀释（1倍溶血素原液加9倍的无离子水），勿用PBS或其它缓冲液。而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。必须新鲜配制。&
4、FACS 通透液&&
　　BD推出FACS通透液以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。（由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异）FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。&
&&&&　 FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水10倍稀释（1倍通透液原液加9倍的无离子水），勿用PBS或其它缓冲液。必须新鲜配制。&
a& 佛波酯(Phorbol12-Myristate13Acetate，PMA)储存液(1&g/&l)&
　　打开装有PMA 的小筒，打开包装，取出1mg 包装的小瓶，打开迅速加入1ml的DMSO或无水乙醇。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到100支1.5ml的EP管中，每管10&l，取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱。忌反复冻融。
　　每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：100稀释储存液，取适量体积，使PMA在全血中的终浓度为20-25ng/ml。注意新鲜配制，每次实验后的剩余液体不可保存再使用。&　　　
b& 离子霉素(Ionomycin)储存液(1&g/&l)&
&&& 　打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100 支1.5ml的EP管中，每支10&l，取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱，忌反复冻融。&
　　每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，取适量体积，使Ionomycin在全血中的终浓度为1&g/ml。注意新鲜配制，每次实验后的剩余液体不可保存再使用。）
c&& StaphylococcalenterotoxinB(SEB)
&&&& 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL&，4℃储存，SEB终浓度10mg/mL细胞悬液。
　　包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。
　　加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。&
6、阻断剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内
a& Brefeldin-A（BFA），液体试剂，分装为10ul/管，冻存于-20℃冰箱。忌反复冻融。&
　　每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：10稀释储存液, 取适量体积，使BFA在全血中的终浓度为10&g/ml。注意新鲜配制，每次实验后的剩余液体不可保存再使用。）
&&& 注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降!&&
b& Golgistop储存液处理&&&&&&&&&&&
&&& 0.7&l/106个细胞（或每6ml细胞混合液加4&l，混合液的细胞浓度为106/ml ）
c& Monensin&&
7、破膜剂：含1%皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。
8、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液。
9、PBS，1640，无水乙醇，DMSO&&&&&&&&&&&
四、常用的标本类型和处理方法
　　全血：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐使用肝素钠抗凝的真空采血管采血。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞，可能会混淆实验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
　　自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs) ：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
　　组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs) ：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，调节细胞浓度为2&106细胞/ml。
&&& 　细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2&106细胞/mL于新鲜培养基中。
&&&　 冰冻全血与PBMCs：使用1&红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，-70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2~3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
五、细胞培养和刺激的基本方法&
　　细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。&
　　　　　表1　细检测推荐的阳性对照活化方法
检测细胞因子&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&阳性对照刺激方法
&检测细胞因子&&
&阳性对照刺激方法
&人IFN-&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法2(4-24h)
&人Fractalkine/CX3CL1&
&人TIMP-1&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-8/CXCL8&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)
&人TNF-a&&&&
&方法7(6h)
&人MCP-1&/CCL2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)
&人IL-1&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(6h)
&人MIP-1&/CCL3&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24 h)&
&人IL-1b&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)
&人MIP-1 /CCL4&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)&&
&人IL-2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法2(4-24h)
&人RANTES/CCL5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-4&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IL-2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IL-4&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&单核细胞：方法3(6-12h)
&T细胞：方法6
&小鼠IL-5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-10&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IL-6&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-12&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IFNg&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法9or 方法12
&人IL-15&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠TNF-a&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
　　为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6h，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&表2　细胞因子活化方法
&只使用转染细胞检测
&人的PBMCs使用PMA(10ng/ml) 和Ionomycin(1uM) 刺激4-24h.
&人的PBMC 使用LPS(0.5-1ug/ml) 刺激24h.&
&人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA(10ng/ml) 和Ionomycin (1uM)刺激6h&&&
&CD4+T细胞使用PHA(10ng/ml) 刺激4days
&T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1&(Lorre,etal.,1994,ClinImmuno Immunopath70:1)
&使用PMA(50ng/ml) 和Ionomycin(500ng/ml)刺激
&PBMCs细胞使用重组人IFNg (10ng/ml) 刺激2h，然后使用IFNg (10ng/ml)+LPS(1ug/ml) 刺激22h或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2ug/ml)+PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml) 刺激6h&&&&
&CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25ug/ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10ng/ml）和IL-4（50ng/ml）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5ng/ml)、Ionomycin(500ng/ml)和monensin刺激6h。
&小鼠ip巨噬细胞使用Mouseip1ug/mlLPS 刺激24h
&小鼠脾细胞使用PMA(5ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激6h
六、实验样品组的激活与染色：（以Th1 和 Th2 的检测为例）
&&& CD3-PerCP&&&&&&&&&&&&CD69-PE&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& CD4-PerCP-Cy5.5&
&&& CD8-APC&&&&&&&&&&&&&& IFN-r-FITC/IL-4-PE&&&&&&&&&& IgG2a-FITC/IgG1-PE&&
&（一）分组与对照&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&空白对照组
激活对照组
阻断对照组
实验检测组
全血+1640（各500ul）
1、实验检测组：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&& 取1支有盖的Falcon管，取全血或PBMCs（细胞数在 0.5-1&106）500&l，加入500&l RPMI1640进行稀释一倍，管中加入下述刺激剂，混匀。(顺序是1640+刺激物+血)& 最后在全血中的终浓度：PMA：20ng/ml；离子霉素：1&g/ml；BFA：10&g/ml。
2、空白对照组：检测未做人工干预时细胞状况。500ul混匀全血+500ul的1640，与刺激血共孵育，37℃4h。&
3、激活对照组：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。&&
　　取500ul混匀全血+500ul的1640，加PMA+Ionomycin（PMA和Ionomycin的用量同实验检测组）。但是不加莫能霉素或BFA（抑制分泌试剂如BFA）会影响CD69表达，需去除以进行表面标志检测。
4、阻断对照组（未刺激对照）：&
&&& 　检测做人工刺激，但加入 Golgistop（或 BFA）时细胞分泌因子状况。500ul混匀全血+500ul的1640，加入Golgistop（或BFA）与刺激血共孵育[用量同实验组]，37℃4小时。
　　激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
　　正确的系统对照可以减小误差。&&&
&&& 　有些实验室此时将细胞外的抗体与刺激剂同时加入（抗体加入量根据各实验室及不同实验而定），实验效果也很好，但注意培养时要避光。将所有刺激剂（及抗体）加好后（包括各对照组），混匀，松盖，37℃5%CO2（或避光）孵育4-6h（有的实验室采取过夜孵育，或孵育4-6h后放入4℃（或避光）保存，第二日再进行下面的操作。&
（二）激活检测&&&
1、各组按照下表进行染色，检测标本激活情况。试剂用量请依照说明书。&&
&空白对照组
&激活对照组
& 阻断对照组&&&&&&
&实验检测组
&同型对照管
&IgG1-PE&&&&&
&CD3-PerCP&
&CD3-PerCP
&实验检测管
&CD69-PE&&&&&&&&
&CD69-PE（胞内）
&CD69-PE（胞内）
&CD3-PerCP
&CD3-PerCP&&&&&&&&&
&CD3-PerCP&
&CD3-PerCP
&2、染色过程
&（1）胞外染色&
　　按照上述表格将抗体（胞内抗体除外）加入到相应的管中，分组加入不同的刺激好的标本，200&l/管。避光20 min。&&&
&（2）裂解红细胞&
　　每管加入10倍稀释后的溶血素2ml，室温避光10 min。取出，1200转，离心5 min，弃上清。（因刺激后的血较难溶血，可适当延长溶血时间，溶血后的溶液有浑浊，且离心后会有红色的沉淀产生。）&
&（3）破膜&
　　各管加入 0.5ml 10倍稀释后的通透剂，室温避光10 min。加入 2ml的PBS，1500转（500g），离心5 min。弃上清。
&（4）胞内染色&
　　实验检测组管中和阻断对照组管中加入胞内染色的抗体（CD69PE）。混匀，室温避光30 min。加入2ml的PBS，1500转（500g），离心 5 min，弃上清。每管加入500ul的PBS，待上机。&
&（5）检测并鉴定&&
　　激活对照阳性率大于90%为标本激活的基本标志。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。&&
　　实验检测组通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。&
&& 　用CD3-PerCP 来进行圈门并设置域值，检测CD69的阳性水平。
&& A、空白对照组（不加PMA，离子霉素和BFA）&
&& B、激活对照组（只加 PMA 和离子霉素）
&& C、阻断对照组（只加BFA）&
&& D、实验检测组（加PMA，离子霉素和BFA）&
&&& 　若激活情况不理想，建议寻找原因并重新进行实验。请勿进行以下实验。
（三）胞内细胞因子分泌检测
1、各组按照下表进行染色，检测标本激活情况。&&
　　根据机器状况，常用为三色法和四色法。&&
（1）三色法：&&
&阻断对照组&&&
&试验检测组
&同型对照管
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE（内）
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE （内）
&CD4-PerCP-Cy5.5&&&&&
&CD4-PerCP-Cy5.5&
&实验检测管&&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE （内）&&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE&&& （内）
&CD4-PerCP-Cy5.5&&&&
&CD4-PerCP-Cy5.5
　　如果用CD4做表面标记，由于PMA刺激后淋巴细胞表面的CD4结合位点在胞外会特异性减少（多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调），所以培养时间不能太长，4-6h为宜，否则CD4下调影响分析。在机器条件允许的情况下，建议使用四色法。
（2）四色法：&&&&
&阻断对照组&&
&实验检测组
&同型对照管
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE（内）
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE（内）
&CD3-PerCP&&
&CD3-PerCP
&实验检测管&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE（内）&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE（内）
&CD3-PerCP&&&&&&&&&&&&&&&&&
&CD3-PerCP
&2、染色过程
（1）胞外染色&
　　按照上述表格将抗体（胞内抗体除外）加入到相应的管中，分组加入不同的刺激好的标本，200&l/管。避光20 min。&&&
&（2）裂解红细胞&
　　每管加入10倍稀释后的溶血素2ml，室温避光10 min。取出，1200转，离心5 min，弃上清。（因刺激后的血较难溶血，可适当延长溶血时间，溶血后的溶液有浑浊，且离心后会有红色的沉淀产生。）&
&（3）破膜&
　　各管加入 0.5ml 10倍稀释后的通透剂，室温避光10 min。加入 2ml的PBS，1500转（500g），离心5 min。弃上清。
&（4）胞内染色&
　　实验检测组管中和阻断对照组管中加入胞内染色的抗体（IgG2a-FITC/IgG 1-PE或IFN-r-FITC/IL-4-PE）。混匀，室温避光30 min。加入2ml的PBS，1500转（500g），离心 5 min，弃上清。每管加入500ul的PBS，待上机。（若短时间内无法上机，请加入适当的固定剂，并4℃避光保存）&&
&（5）检测并鉴定&&&&&&&&&&&&
&&&& 上机检测：CellQuest 软件。&
&&&& 应用BD FACS 流式细胞仪分析。&
&&&& 使用CaliBRITE 标准微球，调节流式细胞仪PMT 电压、荧光补偿、灵敏度。&
&&&& 用CellQuest 获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10 万细胞。&
&&&& 设门圈定FL3+细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用CellQuest，Attractors分析数据。&
三色细胞因子检测图：
1、阻断对照组（只加BFA），细胞因子分泌情况&
&&&&&&&&&&
2、实验检测组（加PMA，离子霉素和BFA），细胞因子分泌情况&
&&&&&&&&&&&&&&&&&
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初学者请教Th1/Th2/Th17/Treg细胞的测定
各位前辈老师：我是初次接触流式，看了一些资料，许多概念不太明白，想请教几个问题，请不要见笑：
1.我需要测定外周血及腺样体组织中的Th1/Th2/Th17/Treg的绝对值及两两比值，我看了张明霞老师的PPT，理解这四个亚群可以用同一份标本，刺激后进行多种荧光标记后同时上机测定，是这样吗？
2.如果是，那么我疑惑的是其他文献中大多进行分别测定，Th17需要刺激培养，Treg可以不刺激培养，那么如果我一起都经刺激后染色，会不会对Treg有影响？
3.如果是，那么最少的外周血样本是多少呢，是不是5ml就可以够呢？
4.对Th1/Th2/Th17/Treg的测定，按张明霞老师的课件，我理解为用CD3，CD8标记细胞表面，INF-γ,IL-4，IL-17，Foxp3分别标记Th1/Th2/Th17/Treg，通过不同设门，进行分析各亚群比值，那么可以直接得到这四种细胞因子的定量吗？
1、只要你的机器可以检测的颜色数足够多，是可以放在一管的，当然，也可以放在多管里面测。
2、我印象中似乎也看到有文献说进行刺激后做TREG，应该没问题，具体出处有点忘了。
3、最少说不好，但是5ml肯定是够的。
4、如果做Treg，是不是应该再加上CD25？做细胞因子定量就还得加定量微球，可就复杂了。@Mia_day
1、只要你的机器可以检测的颜色数足够多，是可以放在一管的，当然，也可以放在多管里面测。
2、我印象中似乎也看到有文献说进行刺激后做TREG，应该没问题，具体出处有点忘了。
3、最少说不好，但是5ml肯定是够的。
4、如果做Treg，是不是应该再加上CD25？做细胞因子定量就还得加定量微球，可就复杂了。&&
niwanmao 发表于
1、只要你的机器可以检测的颜色数足够多，是可以放在一管的，当然，也可以放在多管里面测。
2、我印象中似 ...
谢谢老师！我明白了很多，我准备看看机器能不能一起做，不行就分两管做，Th1/Th2一管(用CD3，CD8，INF-γ,IL-4标记)，Th17/Treg一管（用CD3，CD25，CD8，IL-17，Foxp3标记）。倪老师，能不能弱弱的再问一下：如果这样分别测的话不知道还能得到Th1/Th17，Th2/Th17比值图吗？
jennykuner 发表于
谢谢老师！我明白了很多，我准备看看机器能不能一起做，不行就分两管做，Th1/Th2一管(用CD3，CD8，INF-γ ...
你所谓的“Th1/Th17，Th2/Th17比值图”是指计算两者之间的比例比？还是想将它们的直方图叠加？都是可以的啊。
niwanmao 发表于
你所谓的“Th1/Th17，Th2/Th17比值图”是指计算两者之间的比例比？还是想将它们的直方图叠加？都是可以的 ...
明白了，老师，谢谢老师！我需要再仔细研究一下上机测定。
jennykuner 发表于
谢谢老师！我明白了很多，我准备看看机器能不能一起做，不行就分两管做，Th1/Th2一管(用CD3，CD8，INF-γ ...
倪老师说的很详细哦~如果只想检测样本中Th1/Th2/Th17/Treg的细胞群比例像上述方法进行胞内染色就可以了~但是如果想要检测细胞因子的含量，要收取细胞培养上清或者病人/小鼠 血清，是需要使用BD CBA流式技术进行检测的（专门的Th1/Th2/Th17检测试剂盒），也是倪老师刚才提到的定量微球的技术
以下是CBA技术的简单说明，供参考
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