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奶牛口蹄疫免疫接种的方法和体会口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体制备、抗原位点鉴定及竞争ELISA方法的初步建立--《新疆农业大学》2015年硕士论文
口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体制备、抗原位点鉴定及竞争ELISA方法的初步建立
【摘要】：为了获得Asia-1口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以Asia-1型FMDV JS/05毒株RNA为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a载体,进行原核表达及纯化。以Asia-1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4-6周龄的Balb/c雌鼠,经过4次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按5:1进行融合,用间接ELISA方法对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释,阳性细胞扩大培养后腹腔注射小鼠,制备腹水,并对制取的腹水进行亚型鉴定,反应原性和效价鉴定。将3B蛋白拆分,并构建pGEX-4T1载体,融合GST标签表达,通过间接ELISA验证3B抗体的反应特性,并通过口蹄疫3ABC检测试剂盒筛选临床阳性和阴性血清,利用本实验获得的3B抗体建立竞争ELISA方法,用于检测临床样品中口蹄疫3B蛋白的抗体。结果表明,获得一株稳定分泌抗口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体亚类为IgM,腹水效价为1:12800,通过Western boltting和间接免疫荧光实验鉴定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。SDS-PAGE结果表明,成功表达和纯化3B截短融合GST标签的重组蛋白,间接ELISA结果表明,本实验获得的抗体和3B1蛋白特异性反应。通过口蹄疫3ABC检测试剂盒,筛选出临床4份阳性血清,和4份阴性血清,利用本实验获得的3B抗体建立竞争ELISA方法,检测口蹄疫3B抗体,结果显示4份阳性血清显示出不同程度的抑制率,且具有剂量依赖性,4份阴性血清无抑制作用,无剂量依赖性,表明此竞争ELISA方法和3ABC检测方法符合率100%。
【关键词】：
【学位授予单位】：新疆农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S852.65【目录】：
摘要4-5Abstract5-8英文缩略词表8-9第1章 绪论9-25 1.1 口蹄疫病原学9-11 1.2 口蹄疫的流行现状11-14
1.2.1 世界范围内的流行11-12
1.2.2 国内流行现状12-14 1.3 口蹄疫的防控措施14-20
1.3.1 口蹄疫的预防15-19
1.3.2 口蹄疫的检测19-20 1.4 口蹄疫病毒抗原表位20-22 1.5 单克隆抗体22-24 1.6 研究目的及意义24-25第2章 口蹄疫病毒 3B单克隆抗体制备与鉴定25-43 2.1 实验材料26-27
2.1.1 毒株、细胞、动物、质粒26
2.1.2 主要试剂26
2.1.3 实验与设备26-27 2.2 实验方法27-36
2.2.1 3B基因扩增与构建27-29
2.2.2 3B蛋白表达与纯化29-31
2.2.3 动物免疫与效价检测31-32
2.2.4 间接ELISA筛选方法的建立32
2.2.5 杂交瘤细胞株的建立32-35
2.2.6 腹水的制备35
2.2.7 单克隆单体亚型鉴定35
2.2.8 单克隆抗体效价检测35
2.2.9 单克隆抗体的Western-blot检测35-36
2.2.10 单抗的间接免疫荧光检测36
2.2.11 单抗的中和抗体效价检测36 2.3 实验结果36-41
2.3.1 pET-30a-3B表达载体的构建36-37
2.3.2 pET-30a-3B原核表达37
2.3.3 pET-30a-3B可溶性分析37-38
2.3.4 pET-30a-3B纯化38
2.3.5 Western blotting检测38
2.3.6 免疫效价检测38-39
2.3.7 间接ELISA方法条件的确立39
2.3.8 阳性杂交瘤细胞的筛选39
2.3.9 腹水制备39-40
2.3.10 单克隆抗体亚类的鉴定40
2.3.11 抗体效价的检测40
2.3.12 抗体Western blotting检测40-41
2.3.13 抗体间接免疫荧光检测41
2.3.14 抗体中和效价检测41 2.4 讨论41-43第3章 3B单抗的表位鉴定43-47 3.1 实验材料43-44
3.1.1 质粒、菌种43
3.1.2 主要试剂43
3.1.3 实验相关设备43-44 3.2 实验方法44
3.2.1 3B蛋白的拆分，重组质粒的构建44
3.2.2 重组蛋白的表达与纯化44
3.2.3 反应原性鉴定44 3.3 实验结果44-45
3.3.1 3B拆分蛋白的纯化44-45
3.3.2 反应性鉴定45 3.4 讨论45-47第4章 口蹄疫 3B蛋白竞争ELISA方法的建立47-51 4.1 实验材料47
4.1.1 主要试剂47
4.1.2 实验相关设备47 4.2 实验方法47-48
4.2.1 FMDV血清的筛选47
4.2.2 阳性血清和 3B拆分蛋白的反应性鉴定47-48
4.2.3 竞争ELSIA方法的建立48 4.3 试验结果48-49
4.3.1 临床FMDV血清筛选48
4.3.2 阳性血清和 3B拆分蛋白反应性鉴定48-49
4.3.3 竞争ELISA方法的建立49 4.4 讨论49-51第5章 全文结论51-52附录52-54参考文献54-59致谢59-61作者简介61
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