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hushuibuyun 18:09一、基本资料(提示：将*号填上数字，◇号填上文字)hushuibuyun&1.性别：男；2.年龄：41岁；3.体重/身高：71公斤/1.75米；4.手术时间：2004年10月；5.手术医院：*总医院；6.供肾来源：尸体7.血压：90/65；8.心率：68；9.尿量：3500ml左右。二、用药情况：1.免疫用药：(提示：将*号填上数字，服用国产吗替麦考酚酯、环孢素A、他克莫司、西罗莫司的请注明“生产厂家”，没有服用的药物空着不填，下列的免疫用药项目请全部保留不得删除！）A1.泼尼松：**/天(距本次复查日之前最后的一次调药：*年*月*日由**/天调为现在用量)；A2.美卓乐：4mg/天(距本次复查日之前最后的一次调药：日由2mg/天调为现在用量)；B1.骁悉：1.5g/天(早0.75g、晚0.75g。距本次复查日之前最后的一次调药：日由1.25g/天调为现在用量)；B2.米芙：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)；B3.布累迪宁：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)；B4.依木兰：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)；C1.新山地明：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)；C2.普乐可复：0.75mg/天(早0.5mg、晚0.25mg。距本次复查日之前最后的一次调药：日由1mg/天调为现在用量)；C3.雷帕鸣：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)；D1.来氟米特：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)；E1.雷公藤多甙：**mg/天(早**mg、晚**mg。距本次复查日之前最后的一次调药：**年*月*日由**mg/天调为现在用量)。2.辅助用药(根据自己的情况填写，勿漏填，用μg、mg、g，复方制剂用片、粒标注用量，新加药物注明添加日期)：a.百令胶囊：5g/天；b.科素亚：50mg/天；c.阿法骨化醇：0.25ug/天；d维生素c:2片/天；e.复合维生素b：4片/天；f.别嘌醇：0.2g/天；g.阿魏酸哌嗪：12片/天；h.多稀酸乙酯软胶囊：4粒/天i.螺内酯：10毫克/天......3.服药及用餐时间安排(根据自己的情况填写，勿漏填)：6:30 早饭9:00 &fk560 百令胶囊&9:30 骁悉 美卓乐 阿法骨化醇 多稀酸乙酯软胶囊vc 复合维生素b .别嘌醇&12:00 午饭18:00晚饭21:00 fk560 百令胶囊21:30 &骁悉 科素亚 阿法骨化醇 多稀酸乙酯软胶囊vc 复合维生素b;螺内酯......三、检查指标：(提示：术后没有检查过的项目请填“从未查过”，检查过的必须填写不得漏填；下列的“检查指标”项目请全部保留，可以增加检查项目但不得删除下列的“检查指标”项目！)1.药物浓度：(必须填写最后一次的浓度检查报告，没有服用的免疫抑制剂浓度空着不填)环孢素C0浓度：**ng/ml，(末次服用**mg，**小时后抽血，距本次更新资料时最近的一次检查：**年**月**日，◇◇医院检查)；环孢素C2浓度：**ng/ml，(末次服用**mg，**分钟后抽血，距本次更新资料时最近的一次检查：**年**月**日，◇◇医院检查)；他克莫司浓度：3.3ng/ml，(末次服用0.25mg，12小时后抽血，距本次更新资料时最近的一次检查：日，北京*医院检查)；西罗莫司浓度：**ng/ml，(末次服用**mg，**小时后抽血，距本次更新资料时最近的一次检查：**年**月**日，◇◇医院检查)；霉酚酸药时曲线下面积(MPA-AUC)：未查(早**g，晚**g，距本次更新资料时最近的一次检查：**年**月**日查，◇◇医院检查)。2.肾功：(距本次更新资料时最近的一次检查：日，北京*医院检查)肌酐：147(53-115)高；：：：括号内为参考值。尿素：12.67(1.43-7.14)；高尿酸：445(178-416)；高胱抑素C：未查(**-**)。3.肝功：(距本次更新资料时最近的一次检查：日)谷丙转氨酶ALT：23(0-40)；碱性磷酸酶：70(30-150)；总胆红素：21.3(3.4-20.4)；高直接胆红素：6.4(0-6.8)；总蛋白：74.9(60-80)；白蛋白：46.9(35-55)。4.电解质：(距本次更新资料时最近的一次检查：日)钾：4.56(3.5-5.5)；钠：141.(135-150)；氯：102(95-110)。钙：2.41(2-2.5)；镁：0.88(0.7-1.1)；磷：1.28(0.97-1.62)；二氧化碳结合力17.3(20-31)。5.血脂血糖：(距本次更新资料时最近的一次检查：日)血糖：4.55(3.92-6.16)。甘油三酯：1.58(0.57-1.7)；总胆固醇：5.54(3.9-5.2)；高高密度脂蛋白胆固醇：1.55(1.04-1.56)；低密度脂蛋白胆固醇：3.11(2.34-3.12)。6.血常规：(距本次更新资料时最近的一次检查：日)白细胞：10.41(4-10)；高中性粒细胞比率：80.2(50-70)；高中性粒细胞绝对值：8.36(2-7)；高淋巴细胞比率：15.6(20-40)；低淋巴细胞绝对值：1.62(0.8-4.0)；血红蛋白138(120-160)；红细胞：4.34(4.0-5.5)；血小板：229(100-300)。7.尿常规：(距本次更新资料时最近的一次检查：日)比重：1.015(1.003-1.03)；pH：5.0(5.5-8.5)；尿蛋白：+ 0.3；尿微量白蛋白：＞0.15；镜检红细胞：1个/hp(0-17)；镜检白细胞：2个/hp(0-28)。24小时蛋白：0.37（0―0.15）8.T淋巴细胞亚群(距本次更新资料时最近的一次检查)填写详细报告9.移植肾彩超(距本次更新资料时最近的一次检查：填写详细报告。四、病情补充说明(根据自己的具体情况填写，越详细越好)：中庸老师您好！最近在您的帮助下一直还算稳。昨天去北京检查了一下，资料已经上传。存在一些问题还需要老师的帮助 &最近在您的帮助下一直还算稳。昨天去北京检查了一下，资料已经上传。存在一些问题还需要老师的帮助&1、肌酐基本没变，但是尿素氮很高，螺内酯加了有几个月了，如果是螺内酯的副作用造成的偏高的话，对肾脏有实质损害吗？需要怎么处理？2、螺内酯10毫克（半片），科素亚50毫克血压90/65，24尿蛋白 0.37，没有降得明显，想把把螺内酯加到一天20毫克，怕血压太低，把科素亚降一些，加点螺内酯还是需要怎么调整一下？3、这次检查白细胞突然高，中性粒细胞绝对值高、中性粒细胞比率高、淋巴细胞比率低，春节前几天在当地查白细胞接近上线但没有超标。这次查高了。没有感冒。是什么原因呢？4、二氧化碳低了，医生让加点碳酸氢钠片，尿酸也有些超标怎么处理？中庸： 02:17:25【本回复纯属病友之间的交流，不可作为治疗依据，请与医生联系治疗方案：】hushuibuyun移友您好！1.. 螺内酯作用于肾小管，有可能会影响氮的排除，但不会影响肾功能。建议适当减少蛋白质的摄入量。2.. 不用调整，只要尿蛋白不明显增加，则可以。3.. 继续观察。4.. 其实没有必要处理。减少蛋白质的摄入量尿酸也会下降。hushuibuyun03-13 06:48感谢老师这么晚了还在为我们解答问题！您辛苦了！hushuibuyun03-13 10:42还有几个事请教老师：1、医生让做抗群体抗体（PRA）,说移植时间长的都应该做一下，您认为呢？2、肿瘤标志物，多久查一次，肾移植主要需要查哪几项？3、每年春秋季节交替的时候是否应该输一些疏通改善血管的药物，如需要输怎么用药？中庸： 00:27:17【本回复纯属病友之间的交流，不可作为治疗依据，请与医生联系治疗方案：】湖水不愠移友您好！1.. 做一下更好。2.. 原则上每年查最好，查糖类抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白。3.. 应该视具体情况而定，如果肌酐偏高，则可以每季输一点，建议前列地尔，每天10μg；盐酸川芎嗪，每天160mg。输2周。hushuibuyun03-16 08:36老师答复已经看到，确认的有些晚了抱歉！hushuibuyun 15:16中庸老师您好：我在网上偶尔看到肾脏病专用的低蛋白麦淀粉，含蛋白很低，可以减少植物蛋白摄入。我的肌酐、和尿素氮都偏高，以这个为主食，会延缓肾功能的下降速度吗？不知您对这个肾病辅助食品有什么看法？中庸： 00:31:18【本回复纯属病友之间的交流，不可作为治疗依据，请与医生联系治疗方案：】湖水不愠移友您好！凡是食物赋予了针对某种疾病的治疗或保健作用身价就倍增。“低蛋白麦淀粉”与其他纯淀粉对肾功能不全的治疗作用是相同的，因此可以选择的范围很大，如玉米淀粉、红薯淀粉、作菜用的芡粉、做水晶饺子用的澄面、市售的葛根粉、藕粉等都可以用。低蛋白质饮食配合α-酮酸效果更好。我正在受邀写关于《慢性肾衰营养治疗》的文章，预计1～2万字，会比较详细介绍这方面的情况。hushuibuyun03-18 06:54感谢老师的辛苦解答！您的知识确实很前沿，我们刚知道的事您已经关注和研究很久了。很期待您的 《慢性肾衰营养治疗》的文章早日写完，我们早日拜读。 以我目前的情况，主食尽量吃您所列低蛋白食品，蛋白以动物蛋白为来源；还是现在就开始低蛋白饮食配合α-酮酸呢？中庸： 23:41:09【本回复纯属病友之间的交流，不可作为治疗依据，请与医生联系治疗方案：】湖水不愠移友您好！您的情况，我认为如果能够保证每天每公斤体重0.7g左右的蛋白质(蛋白质保证优质蛋白质≥50%)，每公斤体重35千卡的热量(热量来源以低蛋白质碳水化合物为主，动植物油共25g/d)，保证蔬菜、水果，那就是完美饮食治疗方案了。hushuibuyun03-19 06:17感谢您的耐心指导！hushuibuyun 17:3024小时蛋白：0.47（0―0.15）（3月25日查）8.T淋巴细胞亚群(查)项目代号 & & & & & & &项目名称 & & & & & & & 结果 & & & & & &参考区间4/8Ratio & & & & & &T4/T8细胞比值 & & & & & &0.64 & & & & & &0.71-2.78CD3+CD4+% & & & & & T4细胞百分数 & & & & & & 36.9 & & & & & &27-51CD3+CD+8% & & & & & T3细胞百分数 & & & & & & 55.5 & & & & & &15-44&CD8 & & & & & & & & T8细胞绝对数 & & & & & & 980 & & & & & & 190-1140CD4 & & & & & & & & T4细胞绝对数 & & & & & & 625 & & & & & & 410-1590CD3 & & & & & & & & T3淋巴细胞绝对数 & & & & 1766 & & & & & &690-25409.移植肾彩超(距本次更新资料时最近的一次检查：填写详细报告。四、病情补充说明(根据自己的具体情况填写，越详细越好)：中庸老师您好！今天我又在当地新做了T淋巴细胞亚群和24小时蛋白尿。其他检查结果还是上次去北京检查的，为了便于您分析我重新传了一遍。资料已经发，我有几个问题好的辛苦老师：1、我的T淋巴细胞亚群结果怎么样？2、 &昨天从医院开了前列地儿，医生说在处方上直接写200毫升盐水，10微克前列地儿。我问她不是静推吗，她说咱们医院都是这样输的，剂量这么大静推不太安全。我已经输了两天了。这样输可以吗，对效果和副作用等会有影响吗？3、 &我看有的病友再吃维生素AD胶丸，我这种情况可以吃吗，吃这个主要起到什么作用？4、 &我还有什么需要调整改进的地方吗？问的很多，给老师添麻烦了，问一问您心里就踏实一些，再一次谢谢您！中庸： 01:37:11【本回复纯属病友之间的交流，不可作为治疗依据，请与医生联系治疗方案：】hushuibuyun移友您好！1.. 可能有一点免疫抑制过度，如果能够作霉酚酸暴露量则更能够确定。2.. 输的效果要差一点。3.. 可以，每天单位的1粒，对感染和肿瘤有一定预防作用。4.. 要适当限制蛋白质的摄入量。hushuibuyun03-26 07:15谢谢老师指导！hushuibuyun03-27 08:01中庸老师您好：有两个事还得辛苦您一下。1、我的白细胞最近几个月持续高和抑制过度有关系吗？2、骁悉暴露量当地、手术医院都查不了，我也从来没有查过。我下月初正好要去上海杭州去出差，您是否知道上海杭州那个医院、星期几可以抽血化验骁悉暴露量？，如果这两个城市做不了，我专门坐车去一趟南京军区总院也可以的，总院星期几化验骁悉暴露量，一般结果当天就可以拿上吗？我想提前安排检查时间和订票时间。实在不好意思因为这些问题，还占用您的时间！中庸： 00:24:00【本回复纯属病友之间的交流，不可作为治疗依据，请与医生联系治疗方案：】hushuibuyun移友您好！1.. 如果没有与感染相关的症状，白细胞升高则可能是骁悉加量引起的。2.. 浙一医可以作，具体要咨询开单医生(各医院要求不同)，您可以先与医院电话联系。hushuibuyun03-28 07:05非常感谢老师，我马上电话联系医院！
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于耐高温α- 淀粉酶高密度高表达发酵的条件优化的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：耐高温α- 淀粉酶高密度高表达发酵的条件优化 219※生物工程食品科学 2012, Vol. 33, No. 01耐高温α- 淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化胡建恩 1,曹茜 1,2,杨帆 1,2,房耀维 2,王淑军 2,*,吕明生 2,葛亮 3,李瑛 4(1.大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 .淮海工学院海洋学院,江苏连云港 .上海海洋大学食品学院,上海 .江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122)摘要:通过摇瓶实验对产耐高温α- 淀粉酶的重组菌 E. coli BL21 的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α- 淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖 0.5g/L,酵母粉 15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵 4h,诱导时间为 6h,IPTG 添加量为 0.8mmol/L,接种量为体积分数 3% 的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的 1.29 倍,酶活力达到 8.754U/mL,是原来的 1.55 倍,目的蛋白的表达量也为原来的 1.24 倍。关键(来源：淘豆网[/p-6883776.html])词:耐高温α- 淀粉酶;大肠杆菌 BL21;发酵培养基;发酵条件Optimization of Fermentation Conditions for High Cell Density Cultivation and High Hyperthermophilic α-AmylaseExpression in binant E. coliHU Jian-en1,CAO Qian1,2,YANG Fan1,2,FANG Yao-wei2,WANG Shu-jun2,*,LU. .Ming-sheng2,GE Liang3,LI Ying4(1. College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, C2. School of Marine Science ,Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, C3. (来源：淘豆网[/p-6883776.html])College of Food Science and Technology, Shanghai OceanUniversity, Shanghai 201306, C4. School of Biothechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)Abstract:In order to achieve high-cell-density cultivation and high expression of binant E. coli BL21 producinghyperthermophilic α-amylase, the position and shake flask fermentation conditions were optimized using orthogonalarray design. The optimal cultivation conditions for the production of (来源：淘豆网[/p-6883776.html])α-amylase were achieved by using a pH 6.5 posed of 0.5 g/L glucose and 15 g/L yeast extract and an inoculum size of 3%, and adding 0.8 mmol/L IPTG for 6 h inductionafter 4 h of fermentation. Under these conditions, the biomass of binant E. coli BL21 was increased by 1.29-fold, theα-amylase activity by 1.55-fold (reaching 8.754 U/mL) and the protein expression level by 1.24-pared to the pre-optimization results.Key words:hyperthermophilic α-E(来源：淘豆网[/p-6883776.html]). coli BL21;cultivation conditions中图分类号:O623.54 文献标识码:A 文章编号:12)01-0219-07收稿日期:基金项目:江苏省科技厅农业科技支撑计划项目(BE2008340);江苏省高校自然科学研究重大项目(09KJA170001)作者简介:胡建恩(1962 —),男,教授,博士,研究方向为生物资源利用。E-mail:huje@dlfu.* 通信作者:王淑军(1965 —),女,教授,博士,研究方向为海洋微生物及其活性物质。E-mail:shujunwang86@α- 淀粉酶作为淀粉酶的一种,是目前一类最重要、最古老、应用范围最广的工业酶制剂之一,其中耐高α- 淀粉酶凭借其热稳定上的优势经占据很大的市场。用耐高温α- 酶代替普通α- 淀粉酶起到推动新工艺新技术的运用与研究,降低消耗、降低成本的作用。近年来,我国耐高温α- 淀粉酶的产量和出口量逐年增长,但生产成本愈来(来源：淘豆网[/p-6883776.html])愈高,利润空间日渐趋小[1-3]。因此如何能以最低投入,实现单位发酵液的最高目的蛋白表达量,成为发酵工业生产中研究的重点。us siculi HJ21,该菌株分泌的耐高温α- 淀粉酶的最适作用温度为 95℃,在 100℃仍有 60% 的酶活力,酶的最适作用 pH5.0,在 pH4.5 仍有 80% 的酶活力,酶在 90℃的半衰期为 5h,在 100℃作用 2h 仍有 40% 的2012, Vol. 33, No. 01 食品科学※生物工程220残余酶活力,酶的热稳定性不依赖 Ca2+,比较符合淀粉工业加工过程中所需要的条件。对超嗜热古 us siculi HJ21 α- 淀粉酶基因进行了克隆、表达和定向进化研究,获得了活性、热稳定性提高的突变酶[4-7]。本研究中含有超嗜热古菌 HJ21 α- 淀粉酶基因的突变基因工程菌产生的耐高α- 淀粉酶,不仅具有更高的作用温度和更低的作用 pH 值,而且具有比其野生菌更好的热稳定性。本研究以突变的大肠杆菌 BL21 工程菌为基础,通过对其发酵培养基和发酵(来源：淘豆网[/p-6883776.html])条件进行优化,以期提高其发酵液耐高温α- 淀粉酶酶活力,降低成本,为该酶工业化生产提供参考。1 材料与方法1.1 菌株与培养基含质粒 pET28-amy 的重组 E.coli 21,淮海工学院海洋微生物研究室保存。LB 培养基(g/L):蛋白胨 10、酵母粉 5、NaC1 10、卡那霉素 0.05,pH7.5,卡那霉素与异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均由 0.22μm 微孔滤膜法过滤除菌,其他培养基成分均在 121℃灭菌 20min。1.2 培养方法种子液制备:将活化的菌种以体积分数 1% 接种量接入含有 100mL LB 培养基的 250mL 三角瓶中,37℃、180r/min 摇瓶培养 12h,作为种子液。发酵培养:将种子液以 1% 接种量接入装有 100mLLB 培养基的 250mL 三角瓶中,在 37℃、180r/min 条件下摇床培养,当培养菌液 OD600nm 达到 0.5(约 4h)时,再加入诱导剂 IPTG(终浓度为 1mmol/L),诱导 4h。测菌液O D 6 0 0 n (来源：淘豆网[/p-6883776.html])m,酶活力及目的蛋白表达量。1.3 发酵培养基的优化1.3.1 碳源的选择以 10g/L 蛋白胨为氮源,添加 5g/L 的葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、糊精、可溶性淀粉作为碳源,筛选出最佳碳源。配制碳源 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/L 和 10g/L 的不同 LB 培养基,筛选出最佳碳源的最适质量浓度。1.3.2 氮源的选择以最适质量浓度的最适碳源为最佳碳源,添加10g/L 的蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、硫酸铵、***钠、尿素作为氮源,筛选出最佳氮源。配制氮源 5 、1 0 、15、20、25g/L 的培养基,筛选出最佳氮源的最适质量浓度。1.3.3 无机盐的影响在 LB 液体培养基中添加 KH2PO4 和 MgSO4 无机盐进行发酵试验,添加 KH2PO4 终质量浓度分别为 0、1.0、2.0、4.0、8.0、16g/L 和 32g/L,添加 MgSO4 使其终质量浓度分别为 0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2g/L,进行发酵培养,筛选出最佳无机盐添加量。1.4(来源：淘豆网[/p-6883776.html]) 发酵条件优化1.4.1 诱导温度的影响以 L B 培养基为基础,在 3 7 ℃条件下培养菌液使其 OD600nm 达到 0.5(约 4h)时,加入诱导剂 IPTG(终浓度为 1 m m o l / L ) ,再分别转移至 2 7 、 3 2 、3 7 、4 2 、 4 7 ℃的恒温摇床, 进行发酵培养, 筛选出最佳诱导温度。1.4.2 诱导 pH 值的影响以 L B 培养基为基础,加入下列不同的缓冲液(10mmol/L)[8],再分别用 NaOH 调节液体 LB 培养基的 pH值:pH5.5~6.0(2-(N- 吗啉代)乙磺酸缓冲液,MES),pH6.5~7.0(取代磺酸哌嗪缓冲液,PIPES),pH7.5~8.0(4- 羟乙基呱嗪乙硫磺酸,HEPES),进行发酵培养,筛选出最佳诱导 p H 值。1.4.3 诱导时机的确定以 L B 培养基为基础, 分别在接种后培养 2 、3 、 4 、 5 、 6 h 时加入 I P T G 进行诱导, 筛选出最适诱导时机。1.4.4 诱导时间的确定以 L(来源：淘豆网[/p-6883776.html]) B 培养基为基础,分别诱导 2 、4 、6 、8 、1 0 h ,筛选出最适诱导时间。1.4.5 诱导剂量的确定以 LB 培养基为基础,加入 IPTG 至其终浓度分别为 0 . 6 、0 . 8 、1 . 0 、1 . 2 、1 . 4 mmo l / L ,筛选出最适诱导剂量。1.4.6 接种量的确定以 LB 培养基为基础,分别按接种体积分数为 0.5%、1 % 、 2 % 、 3 % 、 4 % 进行发酵培养, 筛选出最适接种量。1.4.7 装液量的确定以 LB 培养基为基础,分别按 25、50、75、100mL和 125mL 的装液量(总体积 250mL)进行发酵培养,筛选出最佳装液量。1.5 正交试验优化发酵条件在上述各单因素试验的基础上,选取碳源、氮源、pH 值、诱导时机、诱导时间、IPTG 添加量、接种量几个主要影响因素,同时以菌体生物量、酶活力、目的蛋白表达量为考察指标,利用 L18(37)正交试验对以上单因素进行优化组合试验,筛选出最佳高密度高表达的试验方法。表 1 为正交试(来源：淘豆网[/p-6883776.html])验水平表。221※生物工程食品科学 2012, Vol. 33, No. 011.6 分析方法1.6.1 菌体生物量测定测定不同培养时期发酵液在 600nm 波长处的光密度值,用 O D 6 0 0 n m 表示。1.6.2 酶活力测定将发酵液于 10000r/min 离心 5min,弃去上清液,用50mmol/L、pH7.0 磷酸缓冲液重悬菌体,在 1280psi(1psi=6.895kPa)条件下超高压破碎,12000r/min 离心10min,收集上清液作为粗酶液。将 10μL 酶液加入到190μL 1% 的可溶性乙酸钠缓冲溶液(50mmol/L,pH5.0)中,在 95℃水浴中反应 30min,用 3,5- 二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖[9]。酶活力单位定义:在上述反应条件下,每分钟催化产 1μmol 麦芽糖的酶量为一个酶活力单位, 记为 U 。1.6.3 目的蛋白表达量的测定按照 1.6.2 节方法制备粗酶液,用考马斯亮蓝染色法(Bradford 法)测定粗酶液中的总蛋白质含量[10]。用 15%分离胶和 5% 浓缩胶对粗酶液进行 SDS-PAGE 电泳,电泳完毕后的凝胶一半用考马斯亮蓝染色 30min 后用甲醇-乙酸脱色液脱色,另一半在 90℃水浴里反应 30min 后用碘- 碘化钾进行染色[11]。用 Bandscan 分析 SDS-PAGE 电泳图[12],测定目的蛋白表达比例,结合总蛋白含量计算出目的蛋白表达量。2 结果与分析2.1 培养基成分对重组菌生长和目的蛋白表达的影响2.1.1 碳源的影响碳源菌体生物量(OD600nm) 酶活力/(U/mL)葡萄糖 0.529 4.418甘油 0.509 3.869麦芽糖 0.484 3.758蔗糖 0.447 3.919糊精 0.424 2.908可溶性淀粉 0.461 3.901表 2 不同碳源对菌体生物量和酶活力的影响Table 2 Effect of carbon source on cell density and amylase activity由表 2 可知,葡萄糖对重组大肠杆菌的高密度高表达发酵中效果最好,可见,大肠杆菌对糖类的利用,单糖优于双糖,这与普通微生物对碳源利用的规律一致[13]。虽然有报道以甘油代替葡萄糖作为细菌生长的碳源可减少代谢抑制物质——乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达[14],但是在本研究中甘油效果仍然不及葡萄糖。如图 1 所示,在葡萄糖质量浓度为 1.0g/L 左右时大肠杆菌菌体生物量和目的产物表达量都达到最高。而当葡萄糖质量浓度大于 10g/L 时,细菌生长以及其产物的表达受到明显的抑制。2.1.2 氮源的影响氮源菌体生物量(OD600nm) 酶活力/(U/mL)酵母粉 0.744 6.937蛋白胨 0.427 3.858豆饼粉 0.213 1.913尿素 0.002 0.000硫酸铵 0.094 0.145***钠 0.012 0.001表 3 不同氮源对菌体生物量和酶活力的影响Table 3 Effect of nitrogen source on cell density and amylase activity氮源是细胞生长、繁殖和酶生产必不可少的营养物质。因此,在微生物产酶发酵中,氮源是必不可少的重要原料。以 1g/L 的葡萄糖为碳源,考察 10g/L 的酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、尿素、硫酸铵、***钠对细菌高密度高表达的影响。结果如表 3 所示:重组大肠杆 BL21 在分别以蛋白胨和酵母粉为氮源的培养基中生长良好,在硫酸铵和***铵为氮源的培养基中略有生长,***钠和尿素不能作为其生长利用的氮源,因此选取酵母粉作为最适氮源。图 1 葡萄糖质量浓度对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig. 1 Effect of glucose concentration on the growth, amylase activityand protein expression of binant E. coli1.000.950.900.850.800.750.70菌体生物量(OD600nm)葡萄糖质量浓度/(g/L)04020相对酶活力/%0.80.70.60.50.40.30.20.10.0目的蛋白表达量/(g/L)OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量0 2 4 6 8 10水平A碳源质量 B氮源质量C pHD诱导时 E诱导时 F IPTG 添加量/ G接种浓度/(g/L) 浓度/(g/L) 机/h 间/h (mmol/L) 量/%1 0.5 10 5.5 3 2 0.6 12 1.0 15 6.0 4 4 0.8 23 1.5 20 6.5 5 6 1.0 3表 1 正交试验因素水平Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimiza-tion parameters tested in orthogonal array design2012, Vol. 33, No. 01 食品科学※生物工程222如图 2 所示,酵母粉质量浓度达到 15g/L 时,酶活力和目的蛋白的表达都较高,随着酵母粉质量浓度逐渐增大,菌体的生长增长不明显,酶活力和目的蛋白表达量都有所降低。可能是由于过量的氮源是细菌的吸收营养物质的速度大于其利用速度,不利于其代谢。因此,酵母粉作为该发酵中氮源的最适质量浓度为 15g/L。2.1.3 无机盐的影响2.1.3.1 磷酸盐的影响大多数微生物发酵, 需添加磷酸盐、镁、锰、铁、钾盐和***化物以维持适当的离子强度和渗透压,虽然它们不是作为营养物,但有时对微生物的生长和产物生成会产生重大影响。尤其是无机磷酸盐,会阻遏次级代谢物的合成。图 3 结果显示适量的磷酸盐促进菌体生长和目的蛋白的表达,磷酸二氢钾质量浓度在 2g/L 左右时菌体生物量、酶活和目的蛋白表达量都达到最高,因此 2g/L 的磷酸二氢钾为最适的磷酸盐质量浓度。2.1.3.2 硫酸镁的影响镁以离子状态存在于菌体中,对多种酶的活性有促进作用。图 4 结果显示,添加硫酸镁可促进菌体生长和目的蛋白的表达,当硫酸镁质量浓度达到 1.0g/L 时,菌体生物量相对较高,相对酶活力和目的蛋白都达到最大,之后随硫酸镁质量浓度的继续增加菌体浓度虽略有增加,但相对酶活力与目的蛋白表达量均下降,综合考虑适宜的硫酸镁质量浓度为 1.0g/L。2.2 发酵条件对重组菌生长和目的蛋白表达的影响2.2.1 诱导温度的影响培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。如图 5 所示,重组大肠杆菌在 37℃生长较好,该温度也是菌体产酶和目的蛋白表达较好的温度,过高和过低都不利于菌体生长和蛋白表达。2.2.2 诱导 pH 值的影响微生物在一定的 pH 值环境中才能正常生长繁殖,如果 pH 值不适,不但妨碍微生物菌体的正常生长,还会改变微生物的代谢途径和代谢产物的性质。本实验采用加入缓冲液来保持培养基的 pH 值,以研究重组菌高密度和高表达的适宜 pH 值。如图 6 所示,重组菌的生长适宜 pH 值为 6.0~6.5,该 pH 值也利于菌株产酶,在图 2 酵母粉质量浓度对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig. 2 Effect of yeast extract concentration on the growth, amylaseactivity and protein expression of binant E. coli1.201.151.101.051.000.950.900.85菌体生物量(OD600nm)酵母粉质量浓度/(g/L)5 10 15 20 相对酶活力/%1086420目的蛋白表达量/(g/L)OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量图 4 MgSO4 质量浓度对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig. 4 Effect of MgSO4 concentration on the growth, amylase activityand protein expression of binant E. coli1.00.90.80.70.6菌体生物量(OD600nm)MgSO4 质量浓度/(g/L)0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.580相对酶活力/%1.00.80.60.40.20.0目的蛋白表达量/(g/L)图 5 温度对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig. 5 Effect of cultivation temperature on the growth, amylase activityand protein expression of binant E. coli1.000.950.900.85菌体生物量(OD600nm)温度/℃25 30 35 40 45 4020相对酶活力/%1.00.80.60.40.20.0目的蛋白表达量/(g/L)OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量图 3 KH2PO4 质量浓度对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig. 3 Effect of KH2PO4 concentration on the growth, amylase activityand protein expression of binant E. coli1.000.950.900.85菌体生物量(OD600nm)KH2PO4 质量浓度/(g/L)0 5 10 15 20 25 30 5908580相对酶活力/%1.00.80.60.40.20.0目的蛋白表达量/(g/L)OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量223※生物工程食品科学 2012, Vol. 33, No. 01pH 值为 6.5 时目的蛋白表达量占总蛋白的比例较高,综合各因素 pH 值为 6.0 较好。2.2.3 诱导时机的影响重组大肠杆菌通常在对数生长期进行诱导,其最佳的诱导起始时间需要针对不同的宿主菌及不同的质粒体系加以优化。如图 7 所示,菌体在摇瓶中生长 4h(菌体 OD600nm 达到 0.5 左右)时,对其进行诱导,相对酶活达到最高,目的蛋白得到最大表达,菌体生物量虽不断增大,但不利于耐高温α- 淀粉酶的表达。2.2.4 诱导时间的影响如图 8 所示,加入 IPTG 后分别培养 2、4、6、8h和 10h。随着诱导时间的延长,菌体浓度逐渐增大。酶活力与目的蛋白表达量先由迅速升高,而后略有下降趋势,分别在 4h 和 6h 时达到高峰。从经济角度及 IPTG 可能存在的副作用方面考虑,认为加入 IPTG 再诱导 4h,利于重组菌的生长和目的蛋白的表达,4h 为最适诱导时间。2.2.5 诱导剂添加量的影响诱导剂 IPTG 在培养基中不被利用,其浓度也比较稳定,但选择不同的诱导浓度对目的基因的表达存在较大的影响。如图 9 所示,IPTG 添加量对重组菌的产酶活性有一定影响,而对菌体的生长影响不大,高浓度的 IPTG 对目的蛋白的表达不利,添加 IPTG 适宜的浓度为 0.8mmol/L。2.2.6 接种量的影响接种量的大小对发酵周期的长短和产酶水平高低的影响较大,接种量过小则菌体生长缓慢,对数生长期延长,菌体培养时间延长,菌种活力降低,接种量过大,虽然缩短了培养时间,但菌种则容易衰老,酶活力不高,所以选择合适的接种量对产酶影响较大[15]。图10 结果显示,接种量为 2% 时,酶活力和目的蛋白表达量均达到达到最大,随着接种量的继续增加,虽然菌体生物量仍有所上升,但酶活力和目的蛋白表达量菌呈下降趋势,综合各因素考虑,最佳的接种量为 2 % 。图 8 诱导时间对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig.8 Effect of induction duration on the growth, amylase activity andprotein expression of binant E. coli1.41.21.00.80.60.40.2菌体生物量(OD600nm)诱导时间/h2 4 6 8 10相对酶活力/%目的蛋白表达量/(g/L)0.80.60.40.20.0OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量图 9 IPTG 添加量对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig.9 Effect of IPTG amount on the growth, amylase activity andprotein expression of binant E. coli1.00.80.60.40.2菌体生物量(OD600nm)IPTG 浓度/(mmol/L)0.6 0.8 1.0 1.2 1.相对酶活力/%目的蛋白表达量/(g/L)2.01.61.20.80.40.0图 10 接种量对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig.10 Effect of inoculum amount on the growth, amylase activity andprotein expression of binant E. coli1.000.950.900.850.800.750.70菌体生物量(OD600nm)接种量/%0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.7相对酶活力/%目的蛋白表达量/(g/L)1.00.80.60.40.20.0OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量图 6 pH 值对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig.6 Effect of pH on the growth, amylase activity and proteinexpression of binant E. coli1.000.950.900.850.800.750.70菌体生物量(OD600nm)pH相对酶活力/%1.21.00.80.60.40.20.0目的蛋白表达量/(g/L)5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量0706050图 7 诱导时机对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig.7 Effect of induction time point on the growth, amylase activityand protein expression of binant E. coli菌体生物量(OD600nm)诱导前培养时间/h2 3 4 5 相对酶活力/%目的蛋白表达量/(g/L)1.00.80.60.40.20.0OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量1.00.90.80.70.60.OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量2012, Vol. 33, No. 01 食品科学※生物工程 装液量的影响试验号 A B C D E F G OD600nm 酶活力/(U/mL) 目的蛋白表达量/(g/L)1 1 1 1 1 1 1 1 0.433 5.366 0. 2 2 2 2 2 0.964 7.728 0. 3 3 3 3 3 1. 0. 1 2 2 3 3 0. 0. 2 3 3 1 1 0. 0. 3 1 2 2 2 0. 0. 2 1 3 2 3 0. 0. 3 2 1 3 1 1.036 7.167 0. 1 3 2 1 2 0. 0. 3 1 2 2 1 0. 0. 1 1 3 3 2 0. 0. 2 2 1 1 3 0. 0. 2 3 1 3 2 1.001 6.717 0. 3 1 2 1 3 0.898 6.397 0. 1 2 3 2 1 0. 0. 3 2 3 1 2 0. 0. 1 3 1 2 3 1.026 7.192 0. 2 1 2 3 1 0. 0.270k1 0.872 0.879 0.791 0.764 0.904 0.796 0.788菌体生物量 k2 0.896 0.895 0.881 0.964 0.884 0.937 0.890(OD600nm) k3 0.897 0.891 0.993 0.937 0.877 0.932 0.988R 0.025 0.016 0.202 0.200 0.027 0.141 0.200k1 7.026 6.907 6.342 5.664 6.743 6.872 6.210酶活力k2 6.554 6.785 6.705 7.380 6.428 7.077 6.721k3 6.634 6.525 7.171 7.177 7.045 6.268 7.286R 0.472 0.382 0.829 1.716 0.617 0.809 1.077k1 0.380 0.343 0.325 0.333 0.363 0.345 0.323目的蛋白 k2 0.362 0.373 0.367 0.377 0.362 0.370 0.365表达量 k3 0.343 0.368 0.393 0.375 0.360 0.370 0.397R 0.037 0.030 0.068 0.044 0.003 0.025 0.074表 4 培养基成分及发酵条件优化正交试验结果Table 4 Orthogonal array design and results培养过程中装液量决定了培养瓶中的溶氧量,溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧的参与,溶氧量对菌体的生长和产物生成影响很大,溶氧量过高或过低都会影响细菌的代谢。由图 11 可见,在 50mL/250mL 装液量时菌体生物量最高,但当装液量达到 75mL/250mL时,酶活力和目的蛋白的表达同时达到最高,综合各因素考虑,适宜的装液量为 75mL/250mL。2.3 培养基成分及发酵条件优化的正交试验结果如表 4 所示,根据极差分析,各因素影响菌体生物量的顺序为 C & D & G & F & E & A & B,最优条件组合为 A3B2C3D2E1F2G3,其中 A、B、E 因素影响不大,且当取得 C3D2F2G3 时发酵液菌体生物量最大;同理,影响酶活力的主次顺序为 D & G & C & F & E &A & B,最优组合为 A1B1C3D2E3F2G3,其中 B 因素影响最小,当取得 A1C3D2E3F2G3 时发酵液酶活力最大;以目的蛋白表达量为考察指标,影响其的主次顺序为 G &C & D & A & B & F & E,最优组合为 A1B2C3D2E1F2G3,其中 E 因素影响最不显著,当取得 A1B2C3D2F2G3 时发酵液目的蛋白表达量最大。为获得高密度、高表达的发酵结果,应同时考虑发酵液中菌体生物量、酶活力及目的蛋白表达量与各因素的关系,综合以上 3 个结果的组合,最终确定最优发酵条件为 A1B2C3D2E3F2G3,即葡萄糖 0.5g/L,酵母粉 15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵 4h,诱导时间为 6h,IPTG 添加量为 0.8mmol/L,接种量为 3%。经过优化,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的 1.29 倍,酶活力达到 8.754U/mL,是原来的 1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的 1.24 倍。图 11 装液量对重组菌生长、相对酶活力及目的蛋白表达量的影响Fig.11 Effect of medium amount in shake flasks on the growth,amylase activity and protein expression of binant E. coli1.41.31.21.11.00.90.80.70.60.5菌体生物量(OD600nm)装液量/(mL/250mL)25 50 75 100 125相对酶活力/%目的蛋白表达量/(g/L)1.00.80.60.40.20.0OD600nm相对酶活力目的蛋白表达量200225※生物工程食品科学 2012, Vol. 33, No. 013 结论通过摇瓶发酵试验对产耐高温α- 淀粉酶大肠杆菌重组菌 BL21 培养基和培养条件的优化,确定了该菌高密度高表达发酵方案:葡萄糖 0.5g/L 酵母粉 15g/LpH6.5,诱导时机为接种后发酵 4h,诱导时间为 6h,IPTG 添加量为 0.8mmol/L,接种量为 3%。经优化后,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的 1.29 倍,酶活力达到 8.754U/mL,是原来的 1.55 倍,目的蛋白的表达量也为原来的 1.24倍。该研究得到的高密度高表达的发酵参数可为发酵罐的放大实验和工业化生产提供理论参考。参考文献:[1] GUPTA R, GIGRAS P, MOHAPATRA H, et al. 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耐高温α- 淀粉酶高密度高表达发酵的条件优化 219※生物工程食品科学 2012, Vol. 33, No. 01耐高温α- 淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化胡建恩 1,曹茜 1,2,杨帆 1,2,房耀维 2,王淑军 2,*,吕明生 2,葛亮 3,李瑛 4(1.大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 .淮海工学院海洋学院,江苏连云港 .上海海洋大学...
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