实验4 酵母菌的形态观察, 死活细胞鉴别,微生物测量技术,显微镜直接计数法_百度文库
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实验4 酵母菌的形态观察, 死活细胞鉴别,微生物测量技术,显微镜直接计数法
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【求助】关于细胞计数方法的讨论
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这个帖子发布于5年零136天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位战友，最近在整理一篇书稿时，想收集关于血球计数板使用的文献资料，在百度上很庆幸的收集到很多这方面的知识。但困惑随之而来。以前在做细胞实验进行细胞计数的时候，我们是按照数计数板上四周的4个大方格的细胞数，再乘以10的4次方及稀释倍数而得的。这个在园子里也有报道，随后我会附在帖子后面。 但今天收集来的文献显示（文献以检测微生物酵母菌为例），用于计数，即所谓计数室指的是中间的那个方格，这个方格中还被细分为25个小格，当然计数公式也不相同了？ 请园内专家给出一个答案，究竟是怎么回事呢？ 谢谢，随后我会跟帖把2种计数方法详细贴出来，其中第一个是在园子里搜到的，另一个是在百度中搜到的。 急盼回复，指点！
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vero战友，2003年发帖细胞计数与存活测试 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形， 其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方 盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计 数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞 数目。 1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细 胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细 胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。 2. 材料： 2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL ) 2.2. Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 2.4. 计数器(counter) 2.5. 低倍倒立显微镜 2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步骤： 3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于 1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml *每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/243﹦92.6 %
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关于血球计数板的使用及问题讨论摘要：《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，该实验需要测定酵母菌细胞数量，教材采用显微镜直接计数法，需要学生学会使用血球计数板进行准确计数。但是该计数方法，对高中教师来说，比较陌生，对学生而言，使用的难度较大。本文通过结合《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》这一实验，对血球计数板的使用原理和操作步骤、方法等进行详细地介绍，并分析有关血球计数板的命题。关键词：血球计数板 使用原理、方法 问题讨论《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新课标教材“必修3：稳态与环境”中的学生分组实验，该实验通过探究培养液中酵母菌种群数量的变化，尝试建构种群增长的数学模型并用数学模型解释种群数量的变化，说明制约种群个体数量变化的种群外部环境因素和种群内部因素。在该实验中，需要测定酵母菌细胞数量。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等，教材采用的是较为简便、快速、直观的显微镜直接计数法。因此，学会使用血球计数板进行准确计数，是该实验成功与否的关键。虽然不同版本的教材推荐使用的血球计数板的规格不同，人教版建议使用2mm×2mm×0.1mm方格，苏教版推荐使用1mm×1mm×0.1mm方格，但是血球计数板的使用原理和方法是相同的。笔者通过近年来对该实验的摸索，对血球计数板的使用和命题方面存在的一些问题进行了分析总结。一、血球计数板的使用原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数的一种方法。血球计数板是常用的计菌器之一。血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板；大方格的长和宽各2mm，深度为0.1mm，其容积为0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。计数室通常也有两种规格：一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。1．16×25型的计数板 将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数2．25×16型的计数板 中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用（见图三）。一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数c d血球计数板的构造（三）（25×16）a．顶面观 b．侧面观 c．放大后的网格 d．放大后的计数室二、血球计数板的使用方法步骤使用血球计数板计数时，按照如下的实验步骤进行：1．镜检计数室。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数；2．加样品。将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的酵母菌悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。多余培养液可用滤纸吸去；3．计数。稍待片刻（约5min），待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察、计数并记录。三、血球计数板的使用注意事项《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》实验是一个历时较长（7天左右）的实验，事前一定要做好周密的计划，定程序、定时间、定人员。每天采用抽样检测法使用血球计数板对酵母菌进行计数，在计数时应从以下几方面注意。1．每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观察7天。2．从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得的培养液中的酵母菌数量误差小。3．如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于酵母菌的计数。具体方法是：摇匀试管，取1mL酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释n倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有4—5个酵母细胞为宜。特别是在培养后期的样液需要稀释后计数。4．活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。5．对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数；如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。6．计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。按公式计算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌个数。7．血球计数板的清洁血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。四、关于血球计数板的命题由于实验《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新教材新增加的实验，在各地各类命题中都关注了这一实验，并对血球计数板的使用进行了命题设计。从近年来的各类试题来看，试题考查的角度不同，大多数是关于细胞数量的计算，也有关于使用原理和方法的考查，但有的试题明显与血球计数板的实际使用不相符合。例1 在用血球计数板（2mm×2mm方格）对某一稀释50倍样品进行计数时，发现在一个方格内（盖玻片下的培养液厚度为0.1mm）酵母菌平均数为16，据此估算10mL培养液中有酵母菌 ▲ 个。（参考答案： 2×107）例2 在“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”实验中，某同学用显微镜观察计数，统计发现血球计数板的小方格(2 mm×2 mm)内酵母菌数量的平均值为13个。假设盖玻片下的培养液厚度为0.1 mm，那么10mL培养液中酵母菌的个数约为 A．5.2×104 B．3.25×105 C．5.2×103 D.3.25×104 （参考答案：B）解析一：例1例2两题，均将整个计数室2mm×2mm方格作为实验计数的空间，并按照公式：a/4×105（×稀释倍数）来计算10mL培养液中的酵母菌的数量（a为所计数酵母菌的平均数）。与血球计数板的实际操作不相符，特别是例2中将2mm×2mm的计数室当成一个小方格了，存在有科学性错误。例3 通常用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若计数室为1mm×1mm×0.1mm方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多，难以计数，应先 ▲ 后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有 ▲ 个。（参考答案：稀释；2×108）解析二：例3设计了血球计数板的规格，还考查了血球计数板的使用方法，较例1例2更科学合理。根据公式：5×400×1×108 。例4 检测员将1 mL水样稀释10倍后，用抽样检测的方法检测每毫升蓝藻的数量；将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取少许培养液使其自行渗入计数室，并用滤纸吸去多余液体。已知每个计数室由25×16＝400个小格组成，容纳液体的总体积为0．1 mm3。 现观察到图中该计数室所示a、b、c、d、e 5个中格80个小格内共有蓝藻n个，则上述水样中约有蓝藻 ▲个／mL。 （参考答案：5n×105 ）解析三：从例4来看，是按照血球计数板的原理进行设计试题的，还添加了相应的图示，题意一目了然。按照前面所述的公式，不难得出正确答案：酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数＝n/ 80×400×1n×105 。例5（2008江苏高考31．）（4）在整个实验过程中，直接从静置的培养瓶中取培养原液计数的做法是错误的，正确的方法是 ▲ 和 ▲ 。（5）实验结束后，用试管刷蘸洗涤剂擦洗血球计数板的做法是错误的，正确的方法是 ▲ 。（参考答案（4）摇匀培养液后再取样 培养后期的样液稀释后再计数（5）浸泡和冲洗）解析四：例5为2008年江苏省高考试题第31题的第（4）、（5）两小问。试题的设计从血球计数板的实验方法入手，需要对实验操作的正误进行判断，比起以前关于数量的计算的试题，更增强了操作性。实际上，对血球计数板的使用，不少学校并没有真正做，而是教师讲解，学生死记硬背，造成学生只知其一，不知其二，这也是导致学生答题失分的主要原因。综上所述，通过对血球计数板的使用和复习答题，我真切体会到，要认真对待新课程中的每一个实验。《课程标准》倡导探究性学习，力图促进学生学习方式的变革，引导学生主动参与探究过程、勤于动手和动脑，着重培养创新精神和实践能力。要发展学生的科学探究能力，对生物学实验的操作就显得尤其必要。所以我们要转变观念，让学生真正做实验，而不是背实验。让学生在做中领悟实验的原理，在做中体验实验的方法，在做中感受实验的得失，在做中发展探究的能力，这样才能真正提高学生的科学素养。
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第二种计数方法中，原文的图，刚才没有附上
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我把上述2种方法简单做了一个示意图，欢迎专家指点迷津！！！
关于丁香园微生物大小的测定及显微镜直接计数法_中华文本库
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微生物学实验报告
姓 名 科目 微生物 年 级 班 级 组 别 一 题目 微生物大小和数量的测定 仪器编号 组 同 组 者
一、目的要求 目的要求 1． 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。 2． 了解血球计数板的构造、明确其计数原理。 3． 学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。 二、基本原理 基本原理 l． 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜 测微尺两个部件。镜台测微尺全长 1mm，等分为 100 格，每格 0.01mm。用 于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有 50 等分或 100 等分的 小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺 每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物细胞的长度. 目镜测微尺每格长度（μm）=（两重合线间镜台测微尺格数 x10）/两重合线间目镜测微尺
2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示 μm
图一：测微尺的校正 3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计 数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌 孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得 罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或 Hawksley 计数板。三种计数板的原理 和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不 能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。 中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数 区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为 16 个中方格，而每个中方格又 分成 25 个小方格；另一种是一个计数区分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。计数区由 400 个小方格组成。每个大方格边长为 1mm，其面积为 lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为 0.1mm，所以每个计数区的体积为 0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平 均值，再乘以 25 或 16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成 1 毫升菌液 中微生物的数量。设 5 个中方格中的总菌数为 A，菌液稀释倍数 B，则：
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