靶向VEGF基因的siRNA和树突状细胞对乳腺癌MCF-7细胞作用的体外研究
优秀研究生学位论文题录展示靶向VEGF基因的siRNA和树突状细胞对乳腺癌MCF-7细胞作用的体外研究专　业: 病原生物学关键词: 树突状细胞 RNA干扰 VEGF 乳腺癌分类号: R737.9形　态: 共 99 页　约 64,845 个字　约 3.102 M内容阅　读:
内容摘要目的：血管新生和免疫受抑是肿瘤发生的重要生物学机制。肿瘤患者体内多存在免疫缺陷或功能受损，肿瘤细胞通过多种细胞和分子机制逃避机体的抗肿瘤免疫反应，其中树突状细胞(DC)分化异常和对T细胞刺激能力的下降是导致肿瘤免疫逃逸的重要因素。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的促血管新生因子，肿瘤细胞过量分泌的VEGF除了具有促血管新生活性外，还可通过抑制造血祖细胞来源的DC的分化而发挥免疫抑制作用。基于VEGF促血管新生活性和免疫抑制的双重作用，本研究拟应用siRNA阻断VEGF活性达到抗肿瘤血管新生的同时改善肿瘤免疫状态，同时应用体外诱导正常DC的联合抗瘤作用，观察这种联合是否能够增强体外抗瘤效果，为临床抗肿瘤血管新生联合DC免疫治疗提供实验依据。
方法：以MCF-7乳腺癌细胞为观察对象，体外设计合成靶向VEGF的siRNA，采用siRNA技术靶向抑制MCF-7细胞VEGF基因的表达，观察siRNA基因沉默效果及对靶细胞的影响；分离正常人外周血单个核细胞(PBMC)，在一定细胞因子组合下诱导、培养DC;模拟肿瘤体内环境，添加MCF-7乳腺癌细胞培养上清培养DC，观察MCF-7乳腺癌细胞培养上清对正常外周血单个核细胞诱导的DC分化、成熟及功能的影响，探讨肿瘤机体内DC的免疫抑制状态；观察VEGF下调后MCF-7乳腺癌细胞培养上清对正常外周血单个核细胞诱导的DC分化、成熟及功能的影响的变化，探讨阻断VEGF活性对于改善DC功能的作用；进一步探讨靶向MCF-7细胞VEGF基因的siRNA和负载肿瘤抗原的DC二者联合对MCF-7细胞的抗瘤效果。
结果：设计合成的siRNA转染MCF-7细胞后VEG.mRNA和蛋白表达水平明显减低，同时抑制了靶细胞的增殖；在体外应用粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-4（IL-4）及肿瘤坏死因子α(TNF-α)能有效培养人外周血单个核细胞来源的DC.MCF-7乳腺癌细胞培养上清能够明显抑制正常外周血单个核细胞诱导的树突状细胞的分化成熟及抗原提呈能力，CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达明显降低(p<0.01)，DC致敏的CTL对MCF-7细胞杀伤活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显降低(p<0.01)；干扰VEGF基因后MCF-7乳腺癌细胞，培养上清对DCs的影响明显降低，CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达显著升高，DC致敏的CTL对MCF-7细胞杀伤活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显升高(P<0.01)；靶向VEGF基因的siRNA和DC联合应用可显著抑制肿瘤细胞生长，细胞几乎完全溶解，细胞杀伤率达99%。
结论：体外设计合成的双链siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞VEGF基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡；MCF-7乳腺癌细胞上清明显抑制外周血单个核细胞诱导培养的树突状细胞的分化、成熟及抗原提呈能力。下调VEGF后的MCF-7细胞上清对DCs的分化、成熟及功能的抑制作用明显降低，从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用；应用siRNA联合负载肿瘤抗原DC能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长，为该课题进一步的体内实验和临床应用基因治疗联合免疫治疗提供理论基础..……
全文目录文摘英文文摘前言第一部分 siRNA对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF的影响1.
实验材料1.1细胞株及培养体系1.2药品与试剂1.3材料与仪器2.
实验方法2.1主要溶液的配制2.2细胞株培养2.3实验分组及处理2.4体外转录合成siRNA2.5转染方法2.6 MTT测细胞增殖2.7 Hoechst33258核染色2.8 RNA提取与RT-PCR2.9 Westblot检测MCF-7细胞VEGF蛋白表达2.10统计学处理3.
结果3.1 siRNA对肿瘤细胞生长抑制作用3.2 VEGF mRNA表达的变化3.3 VEGFsiRNA对MCF-7细胞靶蛋白表达的影响4.
讨论第二部分 人树突状细胞的培养及鉴定1.材料1.1材料1.2主要试剂1.3细胞因子的分装1.4实验仪器2.方法2.1树突状细胞的诱导与培养(采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法)2.2 DC鉴定3.结果3.1 DC的形态3.2流式细胞仪检测DC表面分子的表达4.讨论第三部分 乳腺癌细胞培养上清对DC分化、成熟及功能的影响1.材料和方法1.1材料1.2主要试剂1.3主要溶液的配制1.4主要仪器及耗材2.实验方法2.1 MCF-7细胞培养上清液的收集与不同诱导体系的制备2.2外周血来源树突状细胞(PBDC)的体外诱导培养2.3实验分组2.4细胞形态学鉴定2.5 FCM法检测DC特异性表面分子表达2.6 MTT法检测单向同种异体混合淋巴细胞反应2.7 ELISA法检测MLR上清中IFN-γ的分泌水平2.8 ELIsA法检测DC培养上清液中IL-12的分泌水平2.9
负载肿瘤抗原的DC和致敏CTL的制备2.10 MTT法检测树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应2.11 Hochest 33258荧光染色CTL靶细胞的凋亡2.12统计方法3.结果3.1树突状细胞形态3.2树突状细胞的免疫表型3.3树突状细胞致敏的CTL肿瘤杀伤效应3.4各组单向同种异体混合淋巴细胞反应水平检测3.5不同诱导体系培养DC上清液IL-12水平测定3.6各组MLR上清液中IFN-Y分泌量的测定4.讨论四部分应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突细胞的影响1.材料与方法1.1材料2.实验方法2.1靶向VEGF基因的siRNA设计合成2.2转染2.3 Western blotting检测VEGF蛋白的表达2.4 ELISA法检测MCF-7乳腺癌细胞培养上清VEGF蛋白水平2.5 MCF-7细胞不同诱导体系培养上清液的收集2.6外周血来源树突状细胞(PBDC)的体外诱导培养2.7实验分组2.8流式细胞仪检测树突细胞的成熟率2.9负载肿瘤抗原的CTL的制备2.10 MTT法检测树突细胞介导的CTL的肿瘤杀伤效应2.11 ELISA法检测IL-12检测2.12 ELISA法检测MLR上清中IFN-γ的分泌水平2.13统计学处理3.结果3.1培养上清中VEGF蛋白水平3.2 VEGF siRNA对MCF-7细胞靶蛋白表达的影响3.3树突细胞形态改变3.4树突细胞的成熟率3.5 MTT法检测树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应3.6 IL-12检测3.7各组MLR上清液中IFN-Y分泌量的测定4.讨论第五部分 VEGF联合负载肿瘤抗原的树突状细胞抗乳腺癌的体外研究1.材料与方法1.1试剂1.2主要实验仪器2.实验方法2.1 VEGF siRNA设计合成2.2外周血来源树突状细胞(PBDC)的体外诱导培养2.3负载肿瘤抗原的CTL的制备2.4 MTT法检测树突细胞介导的CTL的肿瘤杀伤效应2.5 Hochest 33258荧光染色CTL靶细胞的凋亡2.6统计学处理3.结果3.1 MTT法检测树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应()3.2 CTL肿瘤杀伤效应(Hochest33258)4.讨论结语参考文献综述综述一VEGF与肿瘤综述二树突状细胞与乳腺癌参考文献附录 英中文对照及部分缩略词
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细胞因子的结构和生物学特征
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CIK（cytokine-induced killer，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞），是将人在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此,应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继的首选方案。CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中较少，仅1%—5%。[1]外文名cytokine-induced killer首&&&&例1991年用&&&&途用于多种肿瘤的治疗
CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%～5%，在体外经多因子培养28～30天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。实验证明，扩增出的CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56-T细胞，而非CD3-CD56+NK细胞。同时发现在CD3+CD56-的T 细胞中，除CD4+CD8-T细胞外，其余三种T 细胞亚群（CD4-CD8+、CD4-CD8-、CD4+CD8+）均可通过体外多因子培养而获得CD56分子的表达，而由于CD4+CD8+细胞和CD4-CD8-细胞在正常人外周血中含量极低而间接提示此CD3+CD56+细胞绝大多数来源于外周血中CD4-CD8+T细胞。而由于CD4-CD8-T细胞在培养1个月后有近56%的T 细胞同时表达CD56和CD3，表明其也是CIK细胞的重要来源。比较CD3+CD56+CIK细胞中表达CD8+和CD8-,的两群细胞其杀瘤活性没有显著性差异，提示CIK细胞的细胞毒性与CD3CD56表达成相关趋势，而与CD8的表达未表现出相关性。
1.CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强。
2.CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。
3.杀瘤谱广，可用于白血病、、、、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。
4.是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。
5.由于CIK细胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。CIK细胞能够通过三种途径杀灭和病毒感染细胞：①CIK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤：CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放/等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。
②CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤活性：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。
③CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白）通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。CIK细胞发挥作用的三种途径应用LAK细胞是当今较为普及的肿瘤治疗方案，广泛使用于黑色素瘤、、、肺癌和结肠癌。因LAK细胞扩增数量有限，杀瘤活性也较TIL等T 淋巴细胞为低，故虽然杀瘤谱广，但效果局限。相比较而言，TIL 细胞本身较LAK细胞具有更强大的抗瘤效力，但由于杀瘤谱窄，制备困难，及在收集过程中可能导致的功能改变而限制了其临床应用价值。与上述两种效应相比，CIK细胞具有独特的优势，列举如下。
1. 增殖速度快
CIK细胞在培养过程中加入IFN-γ、IL-1α、抗CD3、McAb、IL-2等多因子后，细胞增殖速度迅速加快，远超过LAK细胞。在培养第22天达顶峰，约增加100倍，其中CD3+CD56+细胞不仅绝对数量增加1000倍以上，且所占百分比也大幅上升，培养至28～30天时达，细胞毒活性亦达峰值，而LAK细胞培养前后数量没有明显增加。
2. 杀瘤活性高
CIK细胞是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群，大量体内外实验证实CIK细胞较以NK细胞为主的LAK细胞具备更强大的杀瘤活性，而且其体内杀瘤细胞毒性的维持不必依赖大剂量外源性IL-2的持续给予。体外实验中，任欢和Lu等均发现在体外等数量的CIK细胞比LAK细胞对系的杀伤能力稍高或相近，但因CIK细胞在培养过程中CD3+CD56+效应细胞增长迅速，故CIK细胞的总杀伤单位（TLU）为LAK 细胞的73倍甚至更高，其杀伤效率显著高于LAK细胞。肿瘤克隆抑制实验显示，CIK细胞的瘤细胞抑制Log指数为2.5～3.5，较LAK细胞的瘤细胞抑制指数高2个Log。体内实验发现，对于在严重联合免疫缺陷小鼠身上构建的人类B 细胞淋巴瘤SU-DHL4模型，CIK细胞在清除荷瘤鼠体内肿瘤病灶，抑制转移，延长生存期等方面的作用均明显优于LAK细胞。
3. 杀瘤谱广
CIK细胞虽然以CD3+CD56+ T细胞为主要效应细胞，但却没有T 淋巴细胞杀伤时的MHC 限制性，故对于多种肿瘤细胞系（包括NK敏感的K562和NK不敏感的Hela、HL60、人T 细胞急淋白血病细胞系OCRF-CEM，人淋巴瘤细胞系OCI-LY8、LAM53，人结肠癌细胞系HT-29、CR75，人肾癌细胞系A704）和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。
4. 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感
Wolf用阿霉素和长春新碱诱导出多重耐药细胞系K562/DOX和CCRF-CEM-VBL，发现CIK细胞对敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活性，两者比较无差别。
5. 杀瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制剂的影响
Mehta观察到免疫抑制剂CsA和FK506虽然可以抑制抗CD3单抗介导的CIK细胞脱颗粒过程，却不影响诱导的CIK细胞脱颗粒，并且CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低。
6. 对正常骨髓造血前体细胞毒性很小
Seheffold通过CFU-GM形成实验检测CIK细胞对造血前体细胞的影响，发现CIK细胞对K562细胞的杀伤强度高达3级，但对GM-CFU仅有不足1级的抑制。
Holye也证实CIK细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响，只是对红系的生成显示出轻度抑制，这可能与CIK细胞自身分泌较高水平的IFN-γ有关。
7. 能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡
已证明过继免疫治疗失败的一个重要原因是过继效应细胞被肿瘤细胞表面表达的某些蛋白（主要是FasL）诱导凋亡，而CIK细胞虽然在Fas被占据后会引起少量细胞凋亡，但对其杀瘤细胞毒性没有明显影响。Verneris的实验提示CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如cFLIP、Bcl-2、Bcl-X1、DAD1和survivin的转录水平上调。同时发现CIK细胞具备合成FasL的能力，CIK细胞培养上清中可以检测到具生物学活性的水溶性FasL，表明CIK细胞可以对抗体内FasL 阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降甚至消失。1.外源性细胞因子的补充
CIK细胞的需要外源性细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12等的辅助，这些因子控制着人免疫系统内各种细胞的扩增及其生物学活性。外源性IL-2、IL-7、IL-12可以显著促进淋巴细胞的生长，尤其存在有IL-2和IL-7条件下CIK细胞的增殖率为高，而外源性, IL-2、IL-7、IL-12对CIK细胞的细胞毒活性没有影响。外源性IL-2和IL-7的刺激会降低CIK细胞表面相应受体的表达量，而CD28分子在IL-7存在条件下较IL-2时表达更高。IL-12会降低CIK细胞表面ICAM-1的表达，IL-7则会提高CD56的表达。与IL-2相比，IL-7可明显增加CD4+细胞的比例。虽然外源性IL-2、IL-7和IL-12培养过程中均可出现少量凋亡细胞，但有研究显示外源性IL-12的添加会增加CIK细胞中坏死细胞的比例。
抗CD3McAb不仅在CIK细胞培养过程中起着重要作用，在提高CIK细胞对及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。Lefterov将抗CD3McAb与靶细胞预先共同孵育可增加CIK细胞对其的杀伤敏感性，而且这种增强作用可以被抗FcR的抗体（如抗CD36、抗CD32）所部分阻断，间接证明抗CD3McAb引发的杀伤活性增高与FcR介导的抗体结合有关。
2.多种的转染
由于CIK细胞扩增对外源性细胞因子有依赖，因此通过基因转移方法将相关基因转入CIK细胞，不仅可减少外源性细胞因子的使用量，还可提高CIK细胞自身的抗瘤活性。
IL-7：Fitke利用改进的转基因系统将人IL-7基因转染CIK细胞，发现转染后细胞可以生成较高浓度IL-7，最多者可达1 100pg/106cell/24h。合成的IL-7具有明显的生物学活性，可以促进转染CIK细胞的增殖，显著高于未转染细胞。外源IL-7基因的表达同时改变了CIK细胞对其他细胞因子的分泌，其中尤以TNF-α分泌显著升高，这一现象在未转染CIK体外添加IL-7时并未观测到。虽然转染后CIK细胞表面各种与细胞杀伤活性相关的表面抗原，如ICAM-1 等与未转染CIK细胞相比无明显变化，但转染后CIK细胞在对多种肿瘤细胞系如肾癌、以及结肠癌的杀伤能力较未转染CIK细胞有明显增强。
IL-2：Lu等发现CIK细胞培养过程中CD56分子的表达是IL-2依赖性的，但单独IL-2的存在却会降低培养后CIK细胞的表型变化幅度。尽管有实验指出CIK细胞的体内治疗并不需要IL-2体外持续供给，但Zoll等的研究结果表明，体外培养中IL-2对CIK细胞的增殖和杀伤功能有促进作用。Schmidt-Wolf将包含人IL-2基因片段的重组质粒用电穿孔法导入CIK细胞治疗转移性实体瘤，发现转染后细胞可分泌较高水平的IL-2（330-1 800pg/106 cell/24h，平均达836pg/106 cell/24h ）。虽然转染前后CIK细胞表面各种膜蛋白表达并无显著变化，但体外检测转染后CIK 细胞在增殖率和细胞杀伤活性上均高于未转染细胞。CIK细胞制备流程抽取患者的外周血，在37℃，5%的二氧化碳培养箱中孵育2h，使用高速离心机分离，收集悬浮细胞，在体外（模拟），加入多种细胞因子如CD3单抗，IFN-R，IL-2等培养，每隔2-3天换一次培养液，第7、11、13、15天收集CIK细胞，CD3+和CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。1985年外科医生首次发现大剂量的IL-2在体外可以将培养成具有很强肿瘤杀伤作用的细胞，称为LAK细胞。以后发现在培养液中加入CD3单克隆抗体可以将这些细胞的肿瘤杀伤活性提高十几倍，扩增的数量也大幅提高，这种细胞称为CD3AK。在这个基础上再在培养液中加入INF-r、IL-1等细胞因子,得到表达CD3\CD8\CD56阳性的异质细胞群，这些细胞称为CIK，相比LAK细胞增殖倍数更多，杀毒活力更强。
1991年Schmidt Wolf等人首次报道了CIK细胞。早在1996年国内已有CIK细胞治疗技术临床应用的研究论文发表，目前国内已有超过百家的医疗单位开展了该项治疗技术的相关临床应用与研究。
根据国际国内细胞治疗临床应用的进展状况，日卫生部颁发执行的《医疗技术临床管理应用办法》将“”列为三类医疗技术。[2]
肝癌患者接受手术联合CIK治疗后1年、3年、5年的无病生存期比较,具体如图：
CIK细胞治疗属于过继，由于CIK细胞溶瘤作用是非MHC限制性的，即不受肿瘤组织类型的限制，因此对任何一种肿瘤均有杀伤作用，但对高抗原表达的癌症疗效最好，如：髓性白血病、黑色素瘤、、转移性肾癌、等。其它癌症如肺癌、、、、、大肠癌等，CIK细胞治疗亦有较好的疗效。CIK细胞治疗适用于任何一期的癌症患者，但对早期肿瘤患者或经过手术及放化疗后肿瘤负荷较小的患者效果好。它对于手术、放化疗或后患者体内的清除，防止癌细胞扩散和复发，提高患者自身免疫力，减少毒性反应等方面具有重要作用。某些不适合手术、不能耐受放化疗的中晚期肿瘤患者，CIK细胞治疗可以提高其生活质量，延长带瘤生存时间。
CIK 细胞通过直接杀伤、分泌多种细胞因子等直接抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡起到治疗作用。大多数执行杀伤功能的细胞在回输后立即执行其功能，半衰期约2一个月。回输的细胞中包括一部分，可存活几年至几十年，当遇到相应刺激后，迅速在体内活化，杀伤靶细胞。所以CIK细胞治疗的疗程间隔原则上为一个月，建议首先间隔一个月连续做三个疗程，以后每半年做一个疗程。CIK是一家公司的股票代码，是Credit Suisse Asset Mgmt Fd 的缩写。
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