离问题还有
(共有<span
style="color:#FF位秀友关注过此问题)
我第一次接触PCR，还请大家多多指教
在设计引物时使用Primer Premier 5设计时显示的Tm值两条分别是64.8℃，64.6℃
用Oligo6时显示出三种方法计算的温度，其中
nearest neighbor法 upper 76℃&&&& lower72.1℃
%GC法&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& upper&79.2℃ &lower 75.9℃
[2(A+T)+4(G+C）]法&&upper&70℃& &lower& 76℃
为什么相差这么多？我到底该相信哪个？
共有4位秀友回答　
提问者： [] [] []
欢迎您用专业知识为他人答疑解惑，花三五分钟，帮别人解决一个问题，快乐自己一天！
我为人人，人人为我，让我们一起努力共同打造一个专业的学术交流互助平台.
秀友回答 (4)
应该是Oligo6最可信，但这么高的Tm值没必要。你可以先按primer5的来，如果能扩出来但有非特异性条带，则每次升高退火温度度，直至能扩出清晰条带为止。
该回答共有1位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
Primer Premier 5设计Tm值不是退火温度，退火温度以软件中Ta& Opt&& 下提供的为参考标准，可以调节范围+10或-10
该回答共有0位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
Primer Premier 5参考的就好
该回答共有0位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
我习惯用（A+T）*2+(C+G)*4，用来估算PCR退火稳定没有问题，软件上的算法各异，我一般不用。
该回答共有0位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
回答字数在10000字以内
亲，您需要登陆后才能回答该问题
如果您在、、或任一系统注册过的话，
请用您注册的用户名和密码在下面的登陆框中登陆后再发布您的答案，
如果您在以上系统都未曾注册过，请点击"注册"按钮一分钟注册，谢谢！
找到"关于设计引物时的Tm值问题，请教各位高人"相关问题约0篇，用时0.062501秒
生物秀旗下专业的学术问答社区，为生命科学和医药领域的专业人员提供互帮互助的交流平台。秉承“人人为我，我为人人”的互助理念，让给予成为一种生活方式！
联系我们[Contact Us]：E-mail：
电话：021-
关于我们 [About Us]
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT(Biology Technology)的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和相关企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
生物秀旗下 [Website]&& 查看话题
发现一个问题，请教高人
有A，B 2个菌株，都有X基因，但是B菌株没有X基因的表型。因此推断B菌株中的X基因不表达或表达量不高(当然也可能有翻译后加工等其他原因，目前只考虑基因表达)。
于是想设计实验看看2菌株间基因的表达差异。很容易想到荧光定量PCR。但仔细想后，发现一问题：
要做荧光定量PCR，肯定要提取mRNA反转录为cDNA做模板，但提取的过程中，模板浓度会有人工操作上的偏差。在荧光定量PCR里，常用内参基因来消除这一偏差。但我这个实验的目的菌株是2个不同的菌株，内参基因的表达也是有差异的，因此不能用内参基因来消除模板浓度的偏差。那像这种实验需要用什么方法来消除模板误差呢？有或者说有什么其他的方法来判断菌株A和B之间X基因的表达差异呢？
我觉得用内参来进行相对定量，没有问题啊，都是目的基因相对于内参基因的倍数变化，相对定量并不是说，两个比较的东西，内参表达水平就是一样的啊 我觉得可以做绝对定量，取一样数量的细胞提RNA，然后比如取出相当于1000个细胞的RNA做模板，逆转录，定量PCR（可以用一步法），知道每个菌种的RNA拷贝数高低，通过重复试验来保证结果准确，然后做统计确定两者的差异有没有统计学意义。 : Originally posted by gyesang at
我觉得用内参来进行相对定量，没有问题啊，都是目的基因相对于内参基因的倍数变化，相对定量并不是说，两个比较的东西，内参表达水平就是一样的啊 谢谢gyesang兄的回答。
但是，内参水平如果不一样的话，就算知道了x相对与内参基因的变化，那x基因的表达差异也是不知道的啊，因为内参表达量本身就不一样的。
而且，我的理解是：相对定量不是指目的基因相对于内参的变化，而是目的基因在某一条件下相对于另一条件下的表达变化。内参只是用来消除模板差异的。 : Originally posted by ccharlien at
我觉得可以做绝对定量，取一样数量的细胞提RNA，然后比如取出相当于1000个细胞的RNA做模板，逆转录，定量PCR（可以用一步法），知道每个菌种的RNA拷贝数高低，通过重复试验来保证结果准确，然后做统计确定两者的差异 ... 谢谢ccharlien的建议。
你的意思是不是不断重复实验，只要样本量够大，能通过统计学分析来判断差异，从而消除模板不同带来的误差。
是不是用目标基因PCR回收产物的不同稀释度做标准曲线，细胞浓度做梯度提取RNA反转录再荧光，是不是会好一些呢？ : Originally posted by zuoyue911 at
谢谢ccharlien的建议。
你的意思是不是不断重复实验，只要样本量够大，能通过统计学分析来判断差异，从而消除模板不同带来的误差。
是不是用目标基因PCR回收产物的不同稀释度做标准曲线，细胞浓度做梯度提取RNA反 ... 这种试验一般做三次独立的就行了，不用不断重复啊。
没试过用PCR回收产物做标准品，一般用质粒。
我觉得提RNA时候细胞的量太少误差会更大，还是以一定多的量提了再稀释比较好吧。您还未登陆，请登录后操作！
请教高一生物
癌变受基因控制。致癌因子损伤细胞中的DNA，使原癌基因和抑癌基因发生突变，导致正常细胞的生长和分裂失控而变成癌细胞
大家还关注您（@）目前可用积分：1756185跟帖回复
共获得打赏：
凯迪微信公众号扫描二维码关注发现信息价值
| 只看此人
| 不看此人
12:34:40 &&
更多质疑――[原创] 帝国崩解时的男儿：八一九将军和科尔尼洛夫文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 科尔尼洛夫兵变（）发生于一九一七年，当时沙皇已被推翻，总司令K宣布军事裁。布尔什维克（共）帮助临时政府，摇惑军心，兵变失败。八一九事件（）发生于一九九一年，当时戈尔巴乔夫改革导致苏联即将解体，几个将军把戈抓起来，宣布紧急状态。叶利钦发动民众抗争，摇惑军心，兵变失败。很多国家在风雨飘摇之际，常有军人干政，即通过军事手段，解决政治问题。这些军头们往往都有骑士风度、男子汉气概，但结果就难说了。像八一九事件的将军们和科尔尼洛夫，就输得很惨。因为国家需要变革，而前述两伙人仍然希望一切都按老路走，骚乱起来了的百姓当然不答应了。八一九将军们与科尔尼洛夫的行为，与他们的目标是南辕北辙。可见男子汉的发挥要找准地方。像拿破仑将军那样，一举粉碎寡头体制，大胆实行军人裁，才能利己利人。&&&&&&&&
&&&&*.*.*.*&&
20:33:07&&&&&& &&悄悄话&&好友&&信息&&博客&&搜索&&回复&&本主题下所有发言&&&&&&&&&&&&第 2 楼
文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 [原创] 雄风之下，当然“更无一个是男儿”文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 花蕊夫人是蜀国故伎，凄凉来舞宋宫前，对太宗说：君王城上树降旗，妾在深宫哪得知；十四万人齐解甲，更无一个是男儿。本毛左对这首批评man而不manly的诗，如i在喉。西方人最重视的是“荣誉”“男子汉气概”，中国秦代之後，最珍视的品质却是守“礼”。也不是中国人天生懦弱，先秦史料也记载了许多慷慨轻生之士。但轻生的多了，天下未免“争城以战，杀人盈城；争地以战，杀人盈野”。如此，蜀後主孟昶投降宋国，也不失为识时务的人。因为蜀地历来抗不住中原进攻。至于其他蜀国将士，投降了更不失荣誉――因为他们原来就没有荣誉。古代士兵通常待遇很坏，“战士食糟糠，贤者处蒿莱”是常事。要他们讲点男子汉气概，去保护花蕊夫人这些养尊处优的宫伎，未免过份。 假如宋兵攻破成都，後蜀军民的利益会受到极大侵害，军民也不会“更无一个是男儿”。宋灭北汉时，即发生“薛王出降民不降，屋瓦乱飞如箭簇”。可见，仅靠荣誉感来激励士气，是靠不住的。尤其在古中国，君王一人占尽雄风，其他人吹的都是雌风，平常军民早就荣誉扫地了。只能顺应天下潮流，善待战士，善待百姓，才能指望军人奋战。他们不但在报效君王，更是在保护自己的家。
&&&&*.*.*.*&&
20:38:35&&&&&& 悄悄话&&好友&&信息&&博客&&搜索&&回复&&本主题下所有发言&&&& 第 3 楼
文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 [原创] “烹小鲜”随想文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 会员阅读 【凯迪网络】 　　忽然想到，“远庖厨”的本毛左其实是有过“烹小鲜”的经验的。那是在集体宿舍的时候，有一舍友回家，临行前留给我一堆几寸长的小鱼。我花了好半天的时间来收拾它们，刳肠刮鳞，差点吐了。没有炒锅，只有电饭锅，稍加作料，就把小鱼煮起来了。结果令人懊恼：小鱼都彻底煮“飞”了，成了一锅煮，无法用筷子夹，用匙舀吃不行，因为有刺，只好倒掉了事。　　考虑到秦汉之际“烹”意为“煮”，如“必欲烹尔翁，则幸分我一杯羹”等，《老子》所谓的“治大国若烹小鲜”的“烹小鲜”，即指“煮小鱼”。　　很惭愧，本毛左没有治过国，尽管屡有好好教育教育治国者的冲动。再加上仅有的“烹小鲜”经历以失败告终，所以在这里阐释“治大国若烹小鲜”的道理未免是强作解人。但毕竟有所体验，有所思考，如鲠在喉，不吐不快。　　遥想老邑封君、习总司令，当年的第一次烹小鲜操作也未必成功吧。“烹小鲜”欲成功，猜想关键在于火候，千万不能过度。应该文火慢煮，煮沸即止。治理大国也一样，如果政策稍有偏差，百姓就会流离失所。北宋改革家王安石，建立民兵制度，但根据梅尧臣《汝坟贫女》的记载，发生如下悲剧：　　时再点弓手，老幼俱集。大雨甚寒，道死者百馀人。自壤河至昆阳老牛陂，僵尸相继。王安石建立国家贷款体系，官员就借以盘剥百姓，把很多人搞得倾家荡产。王安石推行改革搞“不换头脑就换人”，就提拔上来一班奸佞之徒。治理大国若过分追求政绩，一定想实现某些指标，肯定要出大问题。所以，《老子》的“治大国若烹小鲜”，应该与其“无为而治”是一个意思。　　小国家由于信息反馈及时，改辙易轨容易，治理起来就不必战战兢兢了。新加坡的李光耀，韩国的朴正熙，都大刀阔斧，迅速让国家面貌焕然一新。但是中国学韩国还勉强，学新加坡弹丸城邦，绝对是自寻死路。　　问题又回到：如何治理大国？其实《老子》《资治通鉴》等古籍已经说得很完备了，就是要懂得“新国富论”，要“为大于其细，为难于其易”，要把大乱消弭于无形，要“无智名，无勇功”。
&&&&*.*.*.*&&
20:39:06&&&&&& 悄悄话&&好友&&信息&&博客&&搜索&&回复&&本主题下所有发言&&&& 第 4 楼
文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 [原创] 新国富论文章提交者：肃慎书室主人 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 　　什么叫国富呢？就是一个人民享有充裕的经济价值。这些经济价值包括三大类：（一）非货币化的天然资源，如空气、阳光、水、风景等；（二）物质货品，如食品、衣服、汽油等；（三）服务及固化的服务，如理发、邮递、运输、戏剧、影碟等。　　一个人民怎样才能实现国富？有五种途径。　　（一）拥有丰裕的自然资源。比如有石油的沙特等。再如美国未建国时，因为土地丰饶，就比英国更富裕了，後来更发现了西部金矿、南部油田。又如百年前的阿根廷，因为牧场广阔，也是世界十富之一。城市类比如鄂尔多斯，因为拥有“羊煤土气”，人均比香港还富。　　（二）政治军事掠夺。弄块殖民地或保护国，就可以掠夺那里的财富和服务了。比如麦克阿瑟占领日本，把美元定价极高，让士兵过得逍遥快活。美国攻打伊拉克，责令日本掏钱。英国打一战，也责令印度出钱（一亿英镑）出人。满洲征服朝鲜，勒取贡物。八国联军攻击清国，获利十亿两白银；日本攻击清国，获利二亿两白银。例子俯拾皆是。　　（三）本国人民的勤劳苦干。这是非常差劲的手段。中华民族素称勤劳，但从现在起上溯千年，都很难说比欧洲富裕。因为劳动损害健康，有时得不偿失。而且一些人玩命苦干，往往意味着另一些人的无所事事。　　（四）提高劳动生产率。比如美国内战之前，Eli Whitney发明轨棉机，“过去，一个奴隶，不管怎么逼，干十小时，只能拉出一磅无籽棉，而一台改进过的惠特尼轧棉机，一天就能拉出三百到一千磅无籽棉”。　　（五）利用信息、技术、地位不对称等优势，通过交易获利。比如“五马倒六羊”就赔了，但像欧洲人利用几个玻璃球就可以换得一个黑人俘虏就赚了。韩国三星、美国苹果的手机，新潮炫目，诱惑人不能不高价去买。有较高技术的人民，很容易地做些“不值钱”的玩艺，就可以换取落後国家大量的物资与服务。　　通过以上分析，可以知道中国人民底子本不丰厚，三十年的所谓经济发展又是南辕北辙，将来前途一片灰暗。具体就不多谈了。　　实现国富的天敌有三个。　　（一）政权被别国或权贵俘获，施政全然不顾及本国人民利益。　　（二）贫富差距大。穷人对干活没兴趣了，也没活可干；富人买外国东西，向外国输送财富。贫富之间不能形成国内市场，技术科学无从改进。社会动荡不安，人民求生不暇。　　（三）人民处于蒙昧状态，苟且偷生。比如印度人，安于贫穷。比如中国人，满足于养花、溜鸟、逗蟋蟀、虚拟游戏、网上论坛。　　（）我也没有什么特效药。首先是把政权从被外国与权贵的俘获下解放出来，让平民等能参与政治，让政权能部分地体现人民的意志。当然，权贵与外国是不会轻易放手的。说起割命，本毛左又没周七驴那个胆儿，这话儿谈也无益，还危险。那就只好未斗争先妥协了，就是“城市直选、党进议会”。以此为条件、基础，再把基尼系数降下来。就是收三税：房税财税遗产税。但现在听王石讲，如果房屋泡沫破裂，会引起割命，所以官家肯定也吓得不敢动了。总而言之，百病缠身，不是一粒两粒药可以治好了。动手术也难。八十年代的萎人，完全可以学韩国朴正熙实现真正国富。可惜总射击师尘欲太重，又笨又懒，把国家搞砸了。
&&&&*.*.*.*&&
22:01:16&&&&&& 悄悄话&&好友&&信息&&博客&&搜索&&回复&&本主题下所有发言&&&& 第 5 楼
文章提交者：拓跋桂 加帖在 猫眼看人 【凯迪网络】 已阅&&
| 只看此人
| 不看此人
0:23:23 &&
12:14:30&&的原帖：腐殖物被细菌分解释放出的养分是小毛虫们的美餐，就象是老母猪掉进了菜窖老鼠掉进了米缸一样尸位荤餐饱食终日安身无忧，小毛虫们只能吃点残渣死物聊以混 朝夕，食物链的低端啊，和大虫无法比的，大虫吃点鲜活的活体动物啥的，母大虫们还时不时的做点人肉包子啥的滋养那些奋勇争先进入的小蝌蚪们。第 29 楼
12:22:18&&的原帖：对极了!老虎、狗熊，这些“大虫”最爱吃活食了，动物园要经常放点活鸡、活羊给它们吃。据说对付狗熊的办法，就是装死，一动不动，狗熊以为死东西，就走了。嘿嘿，说到狗熊，觉得是美国本土印第安人的图腾神物了。类似于我们传统语境下的山神老虎了。有力，沉毅，有灵性，但是笨拙。一个人遇到狗熊，装死赖活，两个人遇到熊最好的办法就是看谁先系紧鞋带了，至于三人成众遇到熊的话，有部美国影片提供的法子好。智者激怒狗熊后，狗熊要两脚竖立起来咆哮示威，这个时候智者抓紧时机在狗熊的颈部下方支起了削尖的木棒，要学人样的直立动物最终还是在人类加工的木棒下考验自身的赘肉了。当然，懂得并把握时机的智者也算是英雄了。影片的名字给忘记了，倒是对于死于羞愧的同伴的理解印象深刻。
| 只看此人
| 不看此人
0:54:46 &&
丛林的生存法则嘛，只有感受死亡的时候才唤起了羞愧的感觉。
| 只看此人
| 不看此人
7:28:59 &&
12:14:30&&的原帖：腐殖物被细菌分解释放出的养分是小毛虫们的美餐，就象是老母猪掉进了菜窖老鼠掉进了米缸一样尸位荤餐饱食终日安身无忧，小毛虫们只能吃点残渣死物聊以混 朝夕，食物链的低端啊，和大虫无法比的，大虫吃点鲜活的活体动物啥的，母大虫们还时不时的做点人肉包子啥的滋养那些奋勇争先进入的小蝌蚪们。第 29 楼
12:22:18&&的原帖：对极了!老虎、狗熊，这些“大虫”最爱吃活食了，动物园要经常放点活鸡、活羊给它们吃。据说对付狗熊的办法，就是装死，一动不动，狗熊以为死东西，就走了。第 33 楼
0:23:23&&的原帖：嘿嘿，说到狗熊，觉得是美国本土印第安人的图腾神物了。类似于我们传统语境下的山神老虎了。有力，沉毅，有灵性，但是笨拙。一个人遇到狗熊，装死赖活，两个人遇到熊最好的办法就是看谁先系紧鞋带了，至于三人成众遇到熊的话，有部美国影片提供的法子好。智者激怒狗熊后，狗熊要两脚竖立起来咆哮示威，这个时候智者抓紧时机在狗熊的颈部下方支起了削尖的木棒，要学人样的直立动物最终还是在人类加工的木棒下考验自身的赘肉了。当然，懂得并把握时机的智者也算是英雄了。影片的名字给忘记了，倒是对于死于羞愧的同伴的理解印象深刻。好莱好莱坞的电影都神了，惊险到极点。
| 只看此人
| 不看此人
7:34:57 &&
引用古语法则：在温总理的说真话中，我们看到，他总是先报上古人或名人然后引用，这是对古人、名人的尊重，也是引用的法则。即使一时找不到古代出处，也可以说“古语有：”“古语道：”。。。不说出处，不说引用，让听的人以为是说话人的语言，如我就以为是一个新的生物学理论：清华生物学理论，呵呵。全国“人民”正认真学习此“讲话”精神，却不知是引用古人的话，古人的话靠不住，出错了!
| 只看此人
| 不看此人
7:47:48 &&
100多年前人们在腐烂变质的肉汤中发现大量的微生物。这些微生物是从哪里来的呢？当时，有些人推测：自然界中的微生物可能是由腐肉变成的。而法国生物学家巴斯德（）不认同这一看法，并提出了自己的假设：“……”。为了检验其假设，他设计并进行了如下实验：把新鲜肉汤分别装入甲、乙两个烧瓶里，把甲烧瓶的瓶颈烧软，拉成鹅颈状的弯曲、细长的瓶颈，乙瓶的瓶口则保持敞开。然后他煮沸甲乙两瓶内的肉汤。放置一定时间后，发现乙瓶内的肉汤开始腐败变质并出现大量的微生物；而相同时间内甲瓶的肉汤虽然仍可通过弯曲的瓶颈与外界相通，但却新鲜如初,且没有发现微生物。他反复做了几次类似的实验，都得到了相同的实验结果。据此，巴斯德认为纯净的肉汤是不会自然生出微生物的，使肉汤腐败变质的微生物来自空气。===================中学生物!
| 只看此人
| 不看此人
9:29:56 &&
古代人说的，多数是错的!
| 只看此人
| 不看此人
12:10:20 &&
说错了，还要让大家学他这个 错误的“理论”，就很不厚道 了!
| 只看此人
| 不看此人
11:17:25 &&
&&&&“物必先腐而后虫生”。&& 这大概是说，细菌存在的范围比昆虫更普遍，细菌繁殖的速度比昆虫更快吧。&& 这算做‘清华生物学理论’？搞笑吧。
| 只看此人
| 不看此人
11:34:55 &&
6:37:59&&的原帖：但是我吃苹果，吃到一个虫，这个苹果并没“腐”啊，难道苹果不是物？这就是我对“物必先腐而后虫生”的疑惑，不理解啊!中国话是不能深究的，任何话语如果深究，都会显示出不严谨，只能做表面理解，不然你就会深陷逻辑矛盾之中。此外，有中学学历的人就应当知道什么“必要条件、充分条件和充分必要条件”。
共 6483 次点击，40 个回复&
本版块主题总数：2882677 / 帖子总数：
今日论坛共发帖：31216 / 昨日发帖：26009 / 最高日发帖：75754
跳转论坛至：
╋猫论天下&&├猫眼看人&&├商业创富&&├时局深度&&├经济风云&&├文化散论&&├原创评论&&├中间地带&&├律师之窗&&├股市泛舟&&├会员阅读&&├史海钩沉&&├舆情观察╋生活资讯&&├杂货讨论&&├健康社会&&├家长里短&&├旅游时尚&&├职场生涯&&├咱们女人&&├家有宝宝&&├消费观察&&├房产家居&&├车友评车&&├猫眼鉴宝╋影音娱乐&&├图画人生&&├猫影无忌&&├影视评论&&├网络剧场&&├音乐之声&&├网友风采&&├猫兄鼠妹&&├笑话人生&&├游戏天地╋文化广场&&├菁菁校园&&├甜蜜旅程&&├心灵驿站&&├原创文学&&├原创小说&&├汉诗随笔&&├闲话国粹&&├体育观察&&├开心科普&&├IT 数码╋地方频道&&├会馆工作讨论区&&├凯迪华南&&├凯迪西南&&├海口会馆&&├凯迪广州&&├凯迪深圳&&├北京会馆&&├上海会馆&&├河南会馆&&├苏州会馆&&├贵州会馆&&├杭州会馆&&├香港会馆&&├台湾会馆&&├美洲会馆╋凯迪重庆&&├重庆会馆&&├猫眼观渝&&├山城拍客&&├重庆教育&&├巴渝情缘&&├猫人游记&&├健康养生&&├重庆车友&&├两江房产&&├渝民新婚&&├麻辣吃货&&├渝财有道&&├时尚渝女&&├公益重庆╋站务&&├站务专区&&├企业家园&&├十大美帖&&├视频创作&&├商品发布
快速回复：[灌水] 请教猫眼高人一个清华生物学理论，不是很理解
本站声明：本站BBS互动社区的文章由网友自行帖上，文责自负，对于网友的贴文本站均未主动予以提供、组织或修改；本站对网友所发布未经确证的商业宣传信息、广告信息、要约、要约邀请、承诺以及其他文字表述的真实性、准确性、合法性等不作任何担保和确认。因此本站对于网友发布的信息内容不承担任何责任，网友间的任何交易行为与本站无涉。任何网络媒体或传统媒体如需刊用转帖转载，必须注明来源及其原创作者。特此声明！
【管理员特别提醒】 发布信息时请注意首先阅读 ( 琼B2- )：
；。谢谢！}