71琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定
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71琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定
琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与DNA长度的关系；?日；?1,527views；分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同；胶回收DNA注意事项；①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的；②主要还是DNA的浓度,如果DNA浓度不够,想胶；③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净；④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收
琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与DNA长度的关系 ? 日 ? 1,527 views ? ?分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表。 胶回收DNA注意事项①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH值，以增加洗脱得率。⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。关于胶回收切胶的一点注意事项1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。 胶回收一. 提高胶回收量的办法：1) 增加电泳时的上样量。2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。二. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤1) 普通胶回收如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。2) 从低熔点凝胶回收DNA纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。3) 扩增特异性好的PCR回收如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。三. 不需胶回收就可直接连接的方法1) 低温冷冻析出法跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。2) 酶切后的直接连接在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的.四、一些注意事项1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。3.关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果你戴树脂眼镜就可以了。4.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。6.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。7.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。 附注：1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋&线性DNA）2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状&线状DNA&单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)7)电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。包含各类专业文献、应用写作文书、中学教育、专业论文、文学作品欣赏、71琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定等内容。　
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1．实验目的： （1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； （2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术； 2．实验材料及用品 （1）实验仪器（apparatus） ： 恒温培养箱 （Constant temperature incubator） 恒温摇床 、 （Constant temperature shaking table） 、 高速离心机（High speed centrifuge） 、漩涡振荡器（Vortex mixer） 、超净工作台（Bechtop） 、 高压灭菌锅 （Autoclave） 微量加样器 、 （Pipettes） 烧杯 beaker） 量筒 （graduated cylinder） 、 （ 、 、 玻璃棒（stir bar） 微波炉（microwave） 天平（Pan balance） 、 、 、电泳梳子（ comb） 、电泳 槽 （electrophoresis tank） 电泳器 （Electro-phoresis System） 紫外灯（Ultraviolet 、 、 transilluminator ）
3） 、材料与试剂（Reagents） ： ①溶液 I（Solution Ⅰ） ： 50mmol/L 葡萄糖； 25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷 （Tris） Tris-HCl pH8.0） 10mmol/L 乙 （ ； 二胺四乙酸（EDTA） pH8.0 溶液 I 可成批配制，每瓶约 100ml，10 磅高压蒸气灭菌 15 分钟，贮存于 4℃。 ②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ） ：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用 10mol/L 贮存液现用现稀释） ；1% SDS （可用 10％贮存液稀 释配制）注意：SDS 易产生气泡，不要剧烈搅拌。 ③溶液 III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL 5mol/L KAc， 11.5mL 冰醋酸， 28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为 3mol/L，醋酸根离子浓度为 5mol/L） ④TE 液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） mmol/L EDTA（pH8.0） ；1 ⑤70% 乙醇； ⑥平衡酚：氯仿 1：1： 将量取 25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后， 移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 ⑦LB 培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 15g pH 7.0 ⑧琼脂糖（Agarose） ； ⑨1 liter（升）5×TBE 备用溶液（stock solution） ： 54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid） ，20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0； ⑩6×凝胶加样缓冲液：
0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue） ，40% 蔗糖（sucrose in water） ； 另外还有的试剂是：胰 RNA 酶、DNA Marker、硼酸、Gelview 试剂 （2）实验材料：含有 pUC19 质粒的大肠杆菌等。 3．实验原理： 1）质粒 DNA 的提取： （1）关于质粒： 质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外 （细胞质中） 呈游离状态的双链、 闭环的 DNA 分子。 质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、 耐受重金属等重要性状的 基因。细菌质粒的大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依 赖于染色体而进行独立自主复制。 一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制， 而较大的质粒 则自身携有复制与编码的有关酶。 （2）一般分离质
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【求助】请教，1%琼脂糖凝胶电泳中所需的溶液，以及配制？
【求助】请教，1%琼脂糖凝胶电泳中所需的溶液，以及配制？
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这个帖子发布于9年零136天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教，有哪位大侠知道1%琼脂糖凝胶电泳中所需的溶液，以及配制？急用！！！！！！！！！！谢谢了！
sword20000 edited on
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一般用0.5×TBE，5XTBE稀释十倍后用；5×TBE的配方：54gTris，27.5g硼酸，20ml0.5MEDTA，加蒸馏水至1000ml，用时稀释10倍即成0.5×TBE，一定要用时稀释，否则易沉淀，沉淀后胶凝固较难！取上清好一些，最好现稀释现用。注意；配0.5MEDTA时一定要加碱，调PH值到8.0，否则很难溶解，偶第一次配时不知道，放了半个月也没溶解好，惭愧啊！
jessie2003 edited on
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我们用1×TAE,50×TAE稀释500倍备用:50×TAE配方: Tris 242g
冰乙酸 57.1mL
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液EDTA-2Na(pH8.0) 100mL
灭菌双蒸水 加至1 000mL
用时用灭菌双蒸水稀释500倍使用Agarose0.2g,加20ml的1×TAE,加5ulEB要在微波炉溶开的
小儿神经内科
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我们实验室用10XTBE稀释20倍后用；5×TBE的配方：Tris 108 g EDTA 9.3 g 硼酸55 g. 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释20倍。做胶的多少看你的电泳槽的大小。琼脂糖（g）/0.5TBE(ML)=0.01即可。核酸染色可用EB,量多少看自己喜欢，一般50ml加3ul，缺点是诱变剂；也可以用goldvew，50ml加3ul。
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问题提出时间： 00:57:16
如何做血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳？
我最近在做脂蛋白电泳，但学校里没人做过。做的过程有很多问题，想请教做过这方面电泳的朋友指点一下，谢谢!
1）染色剂乙酰苏丹黑配法。资料有很多配法，我用最简单的，就把苏丹黑溶于无水乙醇至饱和，静置。资料写就会乙酰化，但染色不行，染料很多没溶解。如果谁配过能否告诉具体配法和操作步奏。
2）电泳缓冲液我用巴比妥钠缓冲液PH8.2离子强度0.082。但每次跑后阳极都有结晶析出，不知是否缓冲液有问题，是否应该换一种缓冲液？如果要换，换成哪种，则么配制？
行业分类：生物、医药
回答时间： 09:35:21
/wenzhang/998.html 有介绍：
许多生化实验指导书籍中也有描写，拟用聚丙烯酰胺凝电泳法。
血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳
以聚丙烯酰胺为支持介质，血清脂质用染料预染，使脂蛋白着色，经电泳后，一般可分出三条区带，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数，乘以总脂量，可求出三种脂蛋白的含量。
(二)试剂与仪器
(1)分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)18.3g,lmol/L盐酸24ml，加水至100ml(pH8.9)。
(2)丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺(Acr)15g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.4g，混匀。
(3)0.35%过硫酸铵(AP)
(4)四甲基乙二胺(TEMED)
(5)丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混匀。
(6)浓缩胶缓冲液：Tris 6g、1mol/L HCl。
(7)0.002%核黄素，48ml，加水至100ml，pH6.7。
(8)电极缓冲液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。
(9)1%苏丹黑B染色液：苏丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加温至溶，离心，去除沉渣，冰箱保存备用。
(10)40%蔗糖水溶液。
电泳仪、光密度扫描仪
(1)先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。
(2)配制5%浓度凝胶：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm，上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面，千万别冲散凝胶界面，使凝胶与空气隔绝。静置20～40min，等凝胶凝固后，除去上层水，再加上浓缩胶。
(3)浓缩胶制备：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀，加TEMED20μl混匀，迅速加入到分离胶上层约1cm高度，沿管壁仔细加蒸馏水覆盖，千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min，也可在强光下聚合，聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。
2.血清预染与加样
在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml，摇匀，于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣，取预染血清30μl，加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面，再加一滴40%蔗糖液，混匀，然后小心地在上面加满电极缓冲液，再装在电泳槽上。
将电极液加入上下电泳槽内，靠样品端的上槽接负极，下槽为正极，接通电源，调节电流为2-5mA/管，30～40min后，关闭电源。
从电泳槽上取下凝胶管，用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间，使凝胶与玻管内壁分离，再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪，凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。
电泳后凝胶一般出现三条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。
浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描，计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比，即为每种脂蛋白组份的百分比。
二、血清脂蛋白琼脂糖电泳法
以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预染，使血清脂蛋白着色，然后电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解，冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。
1.巴比妥HCl缓冲液(pH8.6，离子强度0.075)：称取巴比妥钠15.5g，加入1mol/LHCl12ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，此为电极缓冲液。
2.巴比妥-HCl缓冲液(pH8.6,离子强度0.05)：称取巴比妥钠10.3g,加入1mol/L HCI8ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，用于配琼脂糖凝胶用。
3.0.8%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.8g，溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml，置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。
4.1%苏丹黑B的石油醚-乙醇(1：4，V/V)溶液。
1.预染血清：吸血清0.2ml于一小试管中，再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管，2000r/min离心5min，以除去多余的染料。
2.琼脂糖凝胶板制备：将0.8%琼脂糖凝胶溶解后，吸2.5ml到载玻片上，趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。
3.点样与电泳：取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl，注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液，样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳，待预染血清电泳至最高或40min，切断电源。
(1)切割比色法：将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内，为空白管，各管放入沸水煮3min，琼脂糖溶解，待冷，以空白管调零点，于660nm处比色，记录吸光度，以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和，比各自区带的吸光度，求其百分比。这种半定量方法不够准确，误差很大。
(2)扫描定量：预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该病人的血脂总量，即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量，如图16-2所示。
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