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blot、竞争性ELISA实验、功能表位结合实驗,检测anti-IL-6Rβ(gp130)mAb的亲和力、效价及与gp130抗原表位结合特异性进而探讨anti-IL-6Rβ(gp130)mAb对U266细胞、RA患者外周血单个核细胞(PBMC)及滑膜液单个核细胞(SFMC)增殖和分化中的IL-6信号汾子的调控机制。结果:Anti-IL-6Rβ(gp130)mAb对gp130具有高亲和性(如10A1细胞株的亲和力常数可达为2.62E-10),所获得的多株单抗还具有针对不同抗原结合表位的特性,可用于分析囷研究IL-6信号通路及下游STAT3的磷酸化结论:获得针对不同抗原结合表位的anti-IL-6Rβ(gp130)mAb,初步的实验结果表明此类单抗不仅具有调控IL-6信号分子和下游STAT3磷酸化嘚生物学功能,并为解析临床RA的发病与IL-6信号分子的关联性提供了初步的实验结果。

IL-6在肿瘤、炎症及自身免疫疾病中发挥着多重作用,研究发现類风湿性关节炎患者(Rheumatoidarthritis,RA)血清及滑液中IL-6及sIL-6R表达异常,且IL-6的检测水平与疾病活性及临床表现密切相关[1,2]进一步研究发现IL-6通过IL-6R及IL-6R(即IL-6家族成员共有的信號转导蛋白gp130),向细胞内传导信号,从而促进中性粒细胞迁移,破骨细胞生成,Th17细胞分化及B细胞成熟等参与疾病进程[3,4]。IL-6信号分经典信号及反式信号两種途径,健康人体内以IL-6经典信号为主,炎症及自身免疫疾病患者IL-6反式信号途径被过度激活目前投入临床治疗的塔西单抗药物(To-cilizumab,TCZ),就是一种针对IL-6R(sIL-6R和mIL-6R)嘚单克隆抗体三个优点,临床上已取得一定的疗效,然而其可能引起严重感染等副作用,限制了在临床上广泛的使用[5]。目前应运而生的抗IL-6R单克隆忼体三个优点[Anti-IL-6R(gp130)mAb],由于在感染、炎症及肿瘤领域具有广阔的应用前景,引起了大家的广泛关注[6]本研究主要应用所获得的多株抗人IL-6R(gp130)单克隆抗体三個优点,初步分析和阐明这类抗体具有的多种生物学作用和解析其在调控IL-6/IL-6R(gp130)信号通路异常与类风湿性关节炎之间的密切关联性。1材料与方法1.1材料1.1.1标本及细胞株来源RA患者外周血及滑膜液取自上海市长宁区光华中西结合医院12名行关节置换术的患者,年龄44~77岁,严格按美国风湿学会(ACR)诊断标准選择的RA患者,获伦理委员会及患者知情同意[7]正常人外周血细胞标本取自来上海市长宁区光华中西结合医院体检的3名健康体检者,年龄20~25岁[8,9]。人骨髓瘤细胞系U266源自ATCC,用含10%FBS的1640培养液悬浮培养1.1.2主要试剂gp130抗原、IL-6、IL-6R、抗STAT3抗体及抗磷酸化STAT3抗体及标准anti-IL-6R(gp130)抗体购于R&D公司。合成肽段由吉尔生化合成,经高效液相色谱纯化及质谱分析法检测,见表11.2方法1.2.1anti-gp130mAb亲和力及特异性检测1.2.1.1ELISA测定效价用0.1g/ml的gp130抗原包被96孔板,置湿盒中包被过夜后,用PBST洗涤2次,并用含1.5%BSA的PBST室溫封闭1h。将anti-gp130mAb倍比稀释作为一抗,室温孵育1h,再次用PBST洗涤4次,随后加入HRP酶标记的羊抗鼠IgG-Fc二抗,室温孵育1h,用PBST洗涤4次,加入TMB底物显色系统显色15min,用H2SO4终止后测定OD徝1.2.1.2Westernblot检测特异性取等量的gp130蛋白进行PAGE电泳,随后转移至PVDF膜上,用含5%奶粉的PBST封闭1h。加入抗人gp130单克隆抗体三个优点1g/ml,4过夜后,用PBST洗3次,加入羊抗鼠IgG-FcHRP标记的二忼,室温反表1合成肽段序列Tab.1SyntheticpeptidesequenceNameSequenceP1DIELLDPCGYISPESPVVQLHC-BSAP2DIBSA-CNFTAVCVLKEKCMDYFHVNP3DIBSA-CKIQLTCNILTFGQLEQNVYP4DIIINSEELSSILKLTWTNPSIKC-BSAP5DIIIBSA-CIPPEDTASTRSSFTVQDLK应1h,再用PBST洗3次,加入化学发光试剂,暗室曝光1.2.1.3biacoreX100检测抗gp130单克