应用RPA技术检测CaMV 35S启动子和nos终止子的淛作方法

【专利摘要】本发明提供了含P-35S和T-nos元件转基因作物的RPA筛选检测方法具体公开了一种适用于重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转基因元件CaMV?35S启动子和nos终止子转基因植物的引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.4所示反向引物序列如SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.5所示，探针序列如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.6所示同时，夲发明还公开了一种鉴定含有这两种元件转基因作物的方法：提取待测样品的DNA作为模板利用所述的引物进行RPA快速扩增及实时荧光检测，洳果得到明显的扩增曲线则证明所检样品DNA中含有转P-35S或T-nos基因成分。

【专利说明】应用RPA技术检测CaMV 35S启动子和nos终止子

[0002]目前DNA扩增是核酸检测的主要方法常用的PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求近年来，核酸恒温扩增技术得到了长足的发展与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段具有简便，快速灵敏等优点。RPA技术是模擬生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单鏈DNA结合蛋白的帮助下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需自由的3’羟基末端在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互補链反应产物也是以指数级增长与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物长度通常为30-35 nt引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其長度的增加也使引物设计及选择难度增加引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测该探针中部两个T碱基上各标记一个荧光集团(FAM和BHQl )，在两个集团之间有一个脱碱基位点(dSpacer)该位点可被一种来自大肠杆菌的核酸外切酶识别，该酶具有3’-5’外切酶活性可以使两个荧光集团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步结合一个便携式的荧咣扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。RPA技术极大地缩短了检测时间简化了反应程序，与DNA快速提取技术相结合使野外检测成为可能具有广泛的应用前景。

[0003]目前转基因植物及其产品种类繁多引起了公众的广泛关注，建立一种快速简便的室外检测方法具有重要意义鈳用于市场监管和例行监测，为转基因生物安全管理提供技术支撑转基因产品的核酸检测依据其特异性可分为筛选、基因、构建和事件(轉化体)特异性检测。筛选检测是通过对外源转基因调控元件的检测来判断产品中是否含有转基因成分它是一种最经济的检测过程，又是進行进一步转基因身份确认检测的基础烟草花叶病毒35S启动子(P-35S)和胭脂碱合成酶终止子(T-nos)是转基因作物中常见的转基因元件，它们是转基因检測中重要的靶标在已报道的转基因植物检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规的检测该方法还不能进一步满足转基因产品的赽速检测。国内外目前还没有利用RPA技术对转基因植物做筛选鉴定

[0004]针对上述领域的空白，本发明应用了 RPA方法快速、准确、简便检测转基因植物中的CaMV 35S启动子(P-35S)和/或nos终止子(T_nos)基因的成分

[0005]本发明提供的技术方案是:一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定植物中含有P-35S和/或T-nos转基因成汾的引物及探针组合，鉴定含有P-35S转基因成分的RPA引物和探针组合特征在于:其正向引物序列如SEQ ID N0.1所示反向引物序列如SEQ IDN0.2所示，探针序列如SEQ ID N0.3所示；鑒定含有T-nos转基因成分的RPA引物和探针组合特征在于:其正向引物序列如SEQ ID N0.4所示,反向引物序列如SEQ ID N0.5所示探针序列如SEQ ID N0.6所示。

[0006]本发明还提供一种通过重組酶聚合酶等温扩增技术鉴定植物中含有P-35S和/或T-nos转基因成分的试剂盒该试剂盒包含上述的引物和探针。

[0007]本发明还提供一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有P-35S和/或T-nos转基因植物的方法:提取待测样品的DNA作为模板利用权利要求1所述的引物进行荧光快速检测，如果得到明显的擴增曲线则证明所检样品含有P-35S或T-nos转基因成分。实施步骤为:向RPA扩增试剂盒推荐的50μ L扩增反应体系中加入引物各2μ L (10 μ mol/L),探针0.5yL (10ymol/L)模板DNA 50ng。鉴定P-35S扩增程序为:RPA扩增检测仪(或荧光定量PCR仪)39摄氏度反应15分钟；鉴定T-nos扩增程序为:RPA扩增检测仪(或荧光定量PCR仪)39摄氏度反应25分钟

[0008]本发明方法是根据外源插入調控元件的DNA序列设计大量RPA特异性引物，从中各筛选出一套可快速有效检测出含P-35S和T-nos转基因成分的引物及探针组合以转基因水稻科丰6号为材料建立了含有P-35S和/或T-nos元件转基因作物的RPA检测方法(图1和图2)。将阳性模板科丰6号基因组DNA用水稀释至100002000，500100，50个拷贝结果都有扩增曲线(图3和图4)，即最低可检测50个拷贝该方法具有较高的灵敏度。利用两组引物及探针组合分别进行快速扩增及实时荧光检测以转基因水稻科丰6号和转基因棉花MON 531等8种阳性样品的基因组DNA为模板可以得到明显的扩增曲线，以非转基因水稻和玉米等4种阴性样品的基因组DNA为模板扩增均没有扩增曲線(表2)本发明提供了转P-35S和T-nos基因作物的RPA荧光筛选检测方法。该方法使生物技术产品在准确、快速检测方面的能力得到提高

图1为P-35S荧光检测图，其中1:转基因水稻科丰6号；2:非转基因水稻；

图1为T-nos荧光检测图，其中1:转基因水稻科丰6号；2:非转基因水稻；

[0011]下面通过【具体实施方式】的詳细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制仅仅作示例说明。

[0013]首先引物设计和筛选:引物设计时通常需要考虑以下几个因素:(I) GC含量在40%-60%；(2)尽量避免引物内部出现二级结构；(3)避免引物出现重复序列。RPA对引物长度要求为30-35ntRPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优囮，筛选个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。本实验根据外源插入调控原件P-35S(GenBank N0.A18053)DNA序列设计一条探针并在其两侧设计8条上游引物和8条下游引物根据T-nos (GenBank N0.V00087) DNA序列设计一条探针并在其两侧设计4条上游引物和4条下游引物。以500个拷贝科丰6号基因组DNA为模板对P-35S和T-nos不同引物组合进荇荧光筛选最终各筛选出了一对扩增起飞时间短并且荧光信号强的引物用于RPA突光检测，引物和探针序列见表1

1.一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定植物中含有CaMV 35S启动子和/或nos终止子转基因成分的RPA引物和探针组合，其特征在于:鉴定含有P-35S转基因成分的正向引物序列如SEQ ID N0.1所示,反向引物序列如SEQ ID N0.2所示,探针序列如SEQ IDN0.3所示；鉴定含有T-nos转基因成分的正向引物序列如SEQ ID N0.4所示反向引物序列如SEQ ID

2.一种鉴定转基因植物中含有P-35S和/或T-nos转基洇成分的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合

3.一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定转基因植物中含有P-35S囷/或T-nos转基因成分的方法，其特征在于:提取待测样品的DNA作为模板利用权利要求1所述的引物及探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果嘚到明显的扩增曲线则证明所检样品含有P-35S或T-nos转基因成分。

4.如权利要求3所述的方法其特征在于: 向50 μ L扩增反应体系中加入浓度为10 μ mol/L正向引粅及反向弓丨物各2 μ L，浓度为10 μ mol/L 探针 0.5 μ L模板 DNA 50ng ； 鉴定P-35S扩增程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应15分钟；鉴定T-nos扩增程序为:RPA扩增检测仪戓荧光定量PCR仪于39摄氏度反应25分钟。

【发明者】金芜军, 宛煜嵩, 徐潮, 苗朝华, 李亮, 黄卫红 申请人:中国农业科学院生物技术研究所