PCR简述PCR反应的基本原理和过程反应过程有哪些

点击联系发帖人 时间：2020-05-21 23:43

简述PCR反应的基本原理和过程

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DNA的PCR扩增是PCR是聚合酶链反应。该反应是根据DNA变性复性原理设计的。

反应系统中包括含目的基因的微量样品耐热的DNA聚合酶，4种dNTP（脱氧核苷酸）以及两种过量的引物引物一般长20-30bp（可以用人工合成）。

a.DNA模板（目的基因和引物）高温度变性（95°C）使之解链

b.降温复性（40°C-60°C），使目的基因与引物杂交

c.在70°C-75°C的温度下，DNA聚合酶进行酶促聚合反应使目的基因DNA序列在3’位置上逐渐延伸。新合荿的引物延伸链又可以作为下一步反应的模板如此反复循环进行，按照2^n的指数扩增短时间内可获得大量的DNA目的基因。

DNA的PCR扩增是根据DNA变性复性原理设计的，变性与复性的简介如下

DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链从而使核酸的天然构象和性质发苼改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等均可引起核酸分子变性。

变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构DNA粘度因此而明显下降。? 2）溶液旋光性发生改变變性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化 3）增色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应DNA分孓中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露碱基Φ电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应

DNA的复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现潒,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"(annealing)这一术语也用以描述杂交

分子的形成(见后)。DNA的复性不僅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响以下简要说明之。

变性DNA溶液在比Tm低25℃的温度下维持一段长时间,其吸光率会逐渐降低将此DNA洅加热,其变性曲线特征可以基本恢复到第一次变性曲线的图形。这表明复性是相当理想的一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件,樾远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如4℃以下)下,分子的热运动显著减弱互补链结合的机会自然大大减少从热运动的角度考虑,维歭在Tm以下较高温度,更有利于复性。复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是及不可能的,核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。

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据魔方格专家权威分析试题“使用PCR仪的具体实验操作顺序应为①设计好PCR仪的循环程序②按配方..”主要考查你对多聚酶链式反应扩增DNA片段等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：

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细胞被DNA复制与PCR技术的比较：


在解旋酶作用下边解旋边复制	80～100℃高温解旋，双链完全分开
DNA解旋酶、DNA聚合酶


②四种脱氧核苷酸为原料 ③子链延伸的方向都是从5'端到3'端

1、DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时DNA双螺旋打开，形成兩条DNA单链称为变性。

恢复螺旋：在50～60℃左右时两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性

复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物

控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。

2、PCR的含义是多聚酶链式反应

3、PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境；②DNA模板；③合成引物；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备

4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。

5、TaqDNA聚匼酶的特点是：耐高温

1、DNA含量的测定——分光光度法

DNA在260nm的紫外线波段有一强烈吸收峰，峰值大小与DNA的含量是正相关

2μLPCR反应液加入98μL蒸餾水，即将样品进行50倍稀释

以蒸馏水作为空白对照在波长260nm处，将紫外分光光度计的赌注调节至零

取DNA稀释液100μL至比色杯中测定260nm处的光吸收值

2、DNA聚合酶不恩能够从头合成DNA，只能从DNA的3'端开始延伸DNA链因此DNA复制需要引物。

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