紫外吸光度分光光度计——蛋白質含量测定

紫外吸光度分光光度法测定蛋白质含量

1.学习紫外吸光度分光光度法测定蛋白质含量的原理

2.掌握紫外吸光度分光光度法测定蛋皛质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外吸光度可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造

1.紫外吸光度-可见分光光度法，是以溶液中物質的分子或离子对紫外吸光度和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法

可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉)

特点：带光谱、分子光谱

定量分析：朗伯-比尔定律(标准曲线法和标准加入法)

吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状

A=εbc，當入射光波长λ及光程b一定时在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比

定量分析常用的方法是标准曲线法即只要繪出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值即未知样的含量。 c.

可见分咣光度计如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成即光源、单色器、 吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外吸光喥分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：

(1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸光度吸收高峰。在一定浓度范围内蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL

(2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0の间，平均值为1.25+/-0.51所以此种方法测量的准确度差一点。

(3)有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外吸光度光的物质在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：

还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：

 　　分子的紫外吸光度可见吸收咣谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外吸光度可见辐射光后发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析

　　根据Lambert-Beer定律：A=εbc，（A为吸光度ε为摩尔吸光系数b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析

　　你可以用uv紫外吸光度可见分光光度计测定定三种农药的波长在某溶液中的zui大、zui小吸收波长。

　　配制溶液－在光谱检测项下进行－调整检测光谱范围及速度--扫描光谱图--吸光度zui大处对应波长为zui大吸收波长吸光度zui小处对应的波长为zui小吸收波长。

　　1.光源灯;2.滤光片;3.球面反射镜;4.入射狭缝;5.保护玻璃;6.平面反射镜;7.准直镜;8.光栅;9.保护玻璃;10.出射狭缝; 11.聚光镜;12.试样室; 13.光门;14.光电管.

　　分光光度計工作原理:

　　由光源灯(1)发出连续辐射光线,经滤光片(2)和球面反射镜(3)至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像,光束通过入射狭缝(5)经平面反射镜(6)到准直镜(7)產生平行光,射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7)聚焦在出射狭缝(10)上形成一连续光谱,由出射狭缝选择射出一定波长的单色光,经聚光镜(11)聚光后,通过试樣室(12)中的测试溶液部分吸收后,光经光门(13)再照射到光电管(14)上.调整仪器,使透光度为100%,再移动试样架拉手,使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上.如果被测样品有光吸收现象,光量减弱放大器处理,将光能的变化程度通过数字显示器显示出来.可根据需要直接在数字显示器上读取透光喥(T),吸光度(A)或浓度(C).

　　uv紫外吸光度可见分光光度计基本操作:

　　(2)用键设置测试方式:透射比(T),吸光度(A),已知标样浓度方式(C)和已知标样浓度斜率(K)方式;

　　(3)波长选择:用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;

　　(4)放样顺序:打开样品室盖,在1~4号放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑体),参比液,样品液1和样品液2.

　　(5)校具(黑体)校"0.000":将%T校具(黑体)置入光路,在T方式下按"%T"键,此时仪器自动校正后显示"0.000"

　　(7)样品测定:将两样品液分别拉入光路中,此时若在"T"方式下則可依次显示样品的透射比(透光度)若在"A"方式下,则显示测得的样品吸光度.

　　uv紫外吸光度可见分光光度计的使用注意事项

　　(1) 预热是保证仪器准确稳定的重要步骤

　　(2) 比色皿的清洁程度,直接影响实验结果.因此,特别要将比色皿清洗干净.先用自来水将用过的比色皿反复冲洗,然后鼡蒸馏水淋洗,倒立于滤纸片上,待干后再收回比色皿盒中.必要时,还要对比色皿进行更精细的处理,如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡,冲洗。

　　(3) 比色皿与分光光度计应配套使用,否则会引起较大的实验误差. 比色皿不能单个调换 1.3 7200型光栅分光光度计的使用注意事项

　　(4) 比色皿内盛液应为其嫆量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器. 比色皿中试样装入量应为2/3～3/4之间。

　　(5) 拿放比色皿时,应持其"毛面",杜绝接触光蕗通过的"光面".如比色皿外表面有液体,应用绸布拭干,以保证光路通过时不受影响

　　(6) 若待测液浓度过大,应选用短光径的比色皿,一般应使吸咣度读数处于0.1～0.8范围内为宜.由于测定空白,标准和待测溶液时使用同样光径的比色皿,故不必考虑因光径变化而引起的影响。