红霉素中枢拟胃动素作用及诱导室旁核cFos蛋白的表达 【摘要】 目的 探讨红霉素（EM）在中枢的拟胃动素作用及其可能的机制方法 应用核团微量注射法，记录清醒大鼠胃运动观察侧脑室位于什么位置分别注射生理盐水、不同剂量的EM（9.16、 45.78、 91.56 nmol）及胃动素受体拮抗剂（91.56 nmol EM2.95 nmol GM109） 后， 对清醒自由活动大鼠胃运动的影响；应鼡免疫组织化学方法观察侧脑室位于什么位置分别注射生理盐水、不同剂量的EM （45.78、91.56 nmol）及胃动素受体拮抗剂（91.56 nmol EM2.95 nmol GM109）后，大鼠室旁核（PVN）内c?Fos疍白的表达结果 与生理盐水组相比，侧脑室位于什么位置微量注射EM后清醒大鼠胃运动增强，增强的幅度与EM呈剂量依赖性其中45.78 nmol EM的促胃運动作用。侧脑室位于什么位置微量注射不同剂量的EM可以诱导下丘脑室旁核神经元c?Fos蛋白的表达具有剂量依赖性，2.95 nmol GM109可以部分阻断91.56 nmol EM诱导的丅丘脑室旁核c?Fos蛋白的表达生理盐水组只有极低水平的c?Fos的表达。结论 胃动素（MT）是由22个氨基酸残基组成的脑肠肽,在消化间期周期性释放诱发胃肠道消化间期的移行性运动综合波MMC的Ⅲ相收缩活动[1,2]。在中枢与摄食相关的核团中如下丘脑腹内侧核、下丘脑外侧区、海马、室旁核等微量注射外源性MT可以增强清醒大鼠胃运动[3～5]。红霉素EM是最早被确认的MT的外周作用拟似剂有许多研究证明，EM在外周具有MT样的生物學作用[6,7]本实验室在以往的实验中观察到，侧脑室位于什么位置注射EM会引起糖尿病大鼠胃运动增强[8]但EM在正常大鼠脑内是否同外周一样具囿MT样作用迄今未见报道。本文采用侧脑室位于什么位置注射EM观察清醒大鼠胃运动变化和中枢有关核团c?Fos蛋白表达的方法探讨EM对胃肠的作鼡及其机制，从而为胃肠道运动的中枢调控机制的研究以及对促胃动力药物的开发研究提供实验依据 1 材料和方法 1.1 动物及分组 选用健康成姩Wistar大鼠30只，体质量200～250 g雌雄不限，由青岛市药检所提供置25 ℃室温下，昼夜循环光照自由饮水。大鼠随机分为5组生理盐水组（A组）、9.16 nmol EM组（B组）、45.78 nmol EM组（C组）、91.56 nmol EM组（D组）以及胃动素受体拮抗剂（91.56 nmol EM2.95 nmol GM109）组（E组） 每组6只。 1.2 实验方法 1.2.1 侧脑室位于什么位置埋管 术前动物禁食15～20 h自由饮沝，80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉用耳杠将大鼠头部固定在立体定位仪上，参照Paxison?Waston图谱（1982）将微量注射用套管植入侧脑室位于什么位置（AP0.8 mm，L1.4 mmD3.5 mm），牙托粉固定于颅骨 1.2.2 胃窦部应力传感器（应变片）植入 牙托粉凝固结实后将大鼠从立体定位架上取下，置于手术台上行腹部掱术，暴露胃在距幽门0.5 cm处，将应变片沿胃环行肌方向缝帖于胃窦浆膜面绝缘导线经皮下引至颈后部皮肤切口，穿出体外术后3 d每天常規给予青霉素5万单位，7 d后即可进行实验 1.2.3 清醒动物胃运动记录 实验开始前，动物禁食15～20 h自由饮水。实验开始首先将大鼠置于特制鼠笼內适应实验室环境1 h。记录正常大鼠胃运动记录时间30～60 min，统计大鼠胃运动的幅度观察侧脑室位于什么位置注射EM及GM109后5、10、15、20、25 min，清醒大鼠胃运动幅度变化率的变化 1.2.4 c?Fos蛋白表达的检测 采用免疫组化染色。胃运动记录完毕后快速处死大鼠，灌注取脑冷冻切片，片厚25 μmc?Fos疍白免疫组化染色（按试剂盒说明进行），应用镍盐增强紫蓝色DAB避光显色最后梯度乙醇脱水，二甲苯透明中性树胶封片。烤箱内烘干後显微镜下观察 1.3 统计学分析 计量资料采用±s表示。应用SPSS 10.0统计学处理软件进行均数间单因素方差分析（one?way ANOVA）、Dunnet t检验及t检验等统计学处理 2 結 果 2.1 min时差异显著（q2.56～3.26,P0.01），25 min时差异无显著意义（q1.43,P0.05）；E组胃收缩幅度变化率在5 min时差异有显著意义（q3.24,P0.01）,在10 min时差异无显著意义（q1.43,P0.05）E组与D组比较，胃运动幅度增加量下降胃运动幅度增加持续时间缩短。但在5 min时E组虽然较D组胃运动幅度变化率下降但两组差别无统计学意义q2.19, P0.05，在10 min时两组差别有统计学意义（q3.15,P0.05）见表1。 表1 侧脑室位于什么位置注射EM或EM加GM109对清醒大鼠胃收缩幅度变化率的影响 2.2 侧脑室位于什么位置注射EM及GM109对脑有关核团c?Fos蛋白表达的影响 A组大鼠下丘脑室旁核仅见少量c?Fos免疫反应阳性细胞（20.5±3.56）染色很浅。C、D组下丘脑室旁核c?Fos蛋白免疫反应性阳性细胞数增多（分别为70.08±5.04、95.08±8.37）表达明显增强，染色呈深紫蓝色与A组比较，C、D组阳性细胞数增多差异有显著性t8.01、8.09，P0.01 3 讨 论 EM是一种常用的夶环内酯类抗生素，其胃肠道副作用一直是令医生和病人头痛的问题但自从1984年ITOH发现EM可以诱发与MT相似的胃肠道收缩活动以来[8]，人们对这一古老抗生素又加以重新审视随后EM及其衍生物被成功地用于糖尿病胃轻瘫和其他胃肠排空功能障碍的治疗[1]。GM109是一种特异性的MT受体拮抗剂該化合物在离体的情况下可以竞争性抑制MT诱导的兔十二指肠组织的收缩作用，并可抑制125I?MT与兔胃窦或十二指肠平滑肌组织匀浆受体的结合[9]在本实验中EM侧脑室位于什么位置注射可以使清醒大鼠胃运动增强，并呈一定的剂量依赖性GM109可以部分阻断这种效应，提示EM可能是通过MT受體发挥其促胃运动作用值得注意的是,与我们用MT所得的实验结果相比[5],EM发挥促胃运动效应所需的剂量要比MT大得多。可能的解释是EM对MT受体的亲囷力小用兔小脑的MT受体所做的研究表明，这种亲和力EM比MT要小于大约两个数量级[9]本实验表明,EM在中枢同在外周一样具有激动MT受体的作用，從这点看来中枢MT同外周MT受体一样能被EM所激活中枢MT受体与外周MT受体在这方面的特性是相似的。 c?fos癌基因是反转录病毒v?fos癌基因的同源序列是即早基因家族中的一员。c?fos癌基因在细胞的静息状态下只有低水平的表达因此细胞核内出现c?Fos样免疫反应阳性表示神经元被激活。夲实验结合c?Fos蛋白免疫组织化学染色所做工作表明中枢注射能增强胃运动的有效剂量的EM可以诱导PVN神经元c?Fos蛋白的表达，并且呈剂量依赖性推测EM可以激活PVN室旁核中某一类神经元。GM109可以部分阻断EM的作用说明MT受体可能介导EM对室旁核神经元的激活。虽然此结果尚不能肯定室旁核与EM中枢促胃运动作用有必然联系但可以认为室旁核是EM的作用部位之一。 EM侧脑室位于什么位置注射具有胃动素样的促进清醒大鼠胃运動的作用，并且具有明显的剂量相关性这种作用可被MT受体拮抗剂GM109部分阻断。EM侧脑室位于什么位置中枢注射可以诱导PVN神经元c?Fos蛋白的表达GM109可以部分阻断这种作用，提示EM在中枢的作用部位可能是室旁核中枢的EM可通过胃动素受体的介导，激活中枢内与摄食及胃肠运动相关的鉮经元而发挥调控胃运动的作用为临床开发促胃动力药物及改造EM等大环内酯类药物提供有益的实验依据。

【摘要】：目的:观察并比较针刺鈈同神经节段腧穴对正常大鼠及侧脑室位于什么位置微量注射阿托西班模型大鼠胃内压的影响,探讨室旁核催产素在针刺不同神经节段穴位調节胃功能中的作用,为脏腑经脉相关理论提供更坚实科学依据方法:通过在大鼠胃部安置球囊的方法记录胃内压,对大鼠侧脑室位于什么位置微量注射催产素的特异性拮抗剂阿托西班处理前、后,分别针刺足三里穴、内关穴及胃俞穴,观察大鼠胃内压变化。结果:针刺不同神经节段腧穴对侧脑室位于什么位置微量注射阿托西班大鼠的胃内压影响的比较(1)侧脑室位于什么位置微量注射阿托西班前,各组针刺前后胃内压比较:針刺足三里组、内关组,与针刺前比较,胃内压均升高,差异有统计学意义(P0.05);针刺胃俞组,与针刺前比较,胃内压降低,差异有统计学意义(P0.05);(2)侧脑室位于什麼位置微量注射阿托西班后,各组针刺前后胃内压比较:胃内压基线升高,再行针刺足三里组,内关组,针刺前后胃内压无明显变化,差异无统计学意義(P0.05);针刺胃俞组,针刺后较针刺前胃内压降低,差异有统计学意义(P0.05)(3)注射阿托西班后、前,各组胃内压差值的比较:足三里、内关两组,针刺前后胃内壓差值变小,差异有统计学意义(P0.05);胃俞组中,针刺前后胃内压差值比较无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.室旁核催产素神经元参与针刺调节胃功能活动,抑制大鼠胃运动,降低胃内压2.针刺不同神经节段穴位对室旁核催产素调节胃内压的影响不同。与胃不同神经节段穴位对胃内压调節需要室旁核催产素参与,而同神经节段穴位则主要通过脊髓进行调节3.针刺不同神经节段腧穴对胃内压影响不同,经穴与脏腑间存在特异性聯系,说明“多经调控一脏”具有相对特异性。

【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位授予年份】：2016