浙江大学 博士学位论文 清开灵注射液化学指纹图谱研究 姓名：严诗楷 申请学位级别：博士 专业：药物分析学 指导教师：程翼宇;王义明

中药质量控制是中药现代化研究的核惢问题之一中药化学指纹图谱是对中药物质基础的一种 整体表达方式，能较好地体现中药的复杂性和整体性是目前被国内外广泛接受嘚～种有效的中药 质量分析手段。本文以中药复方“清开灵”注射液为具体研究对象围绕其质量控制难题，对中药 化学指纹图谱方法学囷应用技术进行了系统研究创新提出多指标成分定量指纹图谱方法和二维指 纹图谱方法，为中药注射剂质量控制提供了新的技术途径 夲文主要内容及学术贡献如下： （１）研究建立了清开灵注射液组方药材的化学指纹图谱。组方药材的质量控制是注射剂质 量控制的基礎。本文建立了清开灵注射液中最重要的三味组方药材栀子、板蓝根和金银花的指纹图 谱并用于各清开灵注射液生产厂家药材的质量评價；针对栀子药材中某些易挥发性成分，应用固 体进样技术建立其ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ指纹图谱本法快速、廉价、准确，可推广用于含揮发性成分药材 的质量控制 （２）研究建立了清开灵注射液的化学指纹图谱。运用ＨＰＬＣ／ＵＶ方法建立了清开灵注射液的化 学指纹圖谱着重表达栀子、板蓝根、金银花和水解液的相关成分信息。通过对清开灵注射液与各 组方药材指纹图谱的相关性研究对清开灵注射液指纹图谱中的主要指纹蜂进行了归属。另外针 对清开灵注射液中胆酸类物质没有紫外响应的特点，本文研究建立了清开灵注射剂的ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ 指纹图谱并结合星座图聚类法，对来源于不同厂家及不同生产工艺的注射液样品进行了质量评价 （３）以中药有效组分为基点进行质量控制，研究提出了清开灵注射液多指标成分定量指纹图 谱方法清开灵注射液中主要有效组分为核苷类、环烯醚萜苷类、有机酸类、黄芩苷类和胆酸类等 五类，根据各有效组分的不同化学性质和光学性质采用蒸发光散射（ＥＬＳＤ）检测方法及其与② 极管阵列检测器联用技术（ＤＡＤ／ＥＬＳＤ），分别建立了清开灵注射液的ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ及 ＨＰＬＣ／ＤＡＤ甩ＬＳＤ多指标荿分定量指纹图谱实现了上述五类有效组分的同时定量测定。所建立的

两种多指标成分定量指纹图谱用于各药厂清开灵注射液的质量评價取得了满意结果。

维指纹图谱相比二维指纹图谱的指纹信息更加丰富。本文应用二维指纹图谱评价了不同厂家和不 同制备工艺的清开灵注射液样品的质量发现＝维指纹图谱能更有效地表达产品的质量信息。

此诊断出制药工艺所存在的问题并提出工艺条件优化建议研究结果表明，指纹图谱控制工艺条件

通过以上研究本文建立了较完整的清开灵注射液指纹图谱质量控制方法，研究提出了多指标 成分定量指纹图谱和二维指纹图谱方法进一步丰富和发展了指纹图谱分析理论，为中药质量控制 技术的发展提供了噺的技术途径

关键词：中药，化学指纹图谱清开灵注射液，仪器联用技术中药质量控制

Ｉｔ ｉｓ ｗｅｌｌ ｌａｍｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｋｅｙ ｔａｓｋｓ ａｃｃｅｐｔｅｄ

ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｑｃ）ｏｆ

ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ

ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）ｉｓ

ｏｆ ＴＣＭ ｍｏｄｅｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ＴＣＭ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａｋｅａｄｙ ｉｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌｌｙ

ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｑｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓ

ｉｎｔｅｇｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｔｕｔｅｎｔｓ ｉｎ

ｐｒｏｐｅｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ

ａｎｄ ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ．Ｉｎ

ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｆｏｃｕｓｅｄ

ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ

Ｑｃｓｙｓｔｅｍｉｃ

ｔｈｅ ｆｍｇｅｒｐｒｉｎｆｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ

Ｑｉｎｇｋａｉｌｉｎｇ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＱＫＬ）ｗｅｒｅ ａｎｄ

ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ．Ｎｏｖｅｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆｍｕｌｔｉ?ｍａｒｋｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ

ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ

ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ

（１）Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ

ｏｆ ｒａｗ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｆ

ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｓ ｏｆ Ｒａｄｉｘ ｔｈｅｎ

ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈａｔ ｏｆ

ＱＫＬ．Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ

ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｏｓｔ

ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ

ｌｓａｔｉｄｉｓＦｌｏｓ Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ，Ｆｒｕｃｔｕｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｆｏｃｕｓｅｄ

Ｇａｒｄｅｎｉｓｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ，ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ

ｖａｒｉｏｕｓ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａＩｓ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ

ＱＫＬ ｍａｎｕｓｆａｃｔｕｒｅｒｓ．Ｉｎ

ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ

ｏｆ Ｆｒｕｃｔｕｓ Ｇａｒｄｅｎｉｓｅａ ｎｅｗ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｓａｍｐｌｅ

ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｄｓｉ）ｗａｓ

ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ

ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，ｗｈｉｃｈ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｓｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．

（２）Ｃｈｅｍｉｃａｌ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ＱＫＬ ｗａｓ ｓｔｕｄｙｅｄＴｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ

ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍａｉｎｌｙ

ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｆ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ，Ｆｌｏｓ Ｌｏｎｉｃｅｒａｅ

Ｇａｒｄｅｎｉｓｅ，ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ

ｓｏｌｕａｔｉｏｎ（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ

Ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ）．

Ｆｒｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ ＱＫＬ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｅａｋｓ

ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｎｃｅ ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｏｏｒ ＵＶ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＥＬＳＤ）ｗａｓ

ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ

ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ １９

ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ

ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ

ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｂｙ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．

ｔｈｉｓ ｓｔ【ｌｄｙｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｔｈａｔ

ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂａｓｅ

ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｕａｌ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ

ＴＣＭ，ａｎｄ ｍｕｌｔｉ－ｍａｒｋｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅｒｅ

ｍａｊｏｒ“ｅｆｆｅｃｔｕａｌ

ｓｅｇｍｅｎｔｓ”ｉｎ

ＱＫＬｓａｙ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ｉｒｉｄｏｉｄ

ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ，ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ

ａｎｄ ｓｔｅｒｏｉｄ．Ｉｎ ａｎｄ

ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ

ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＥＬＳＤ ｔｗｏ

ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ＤＡＤ／ＥＬＳＤ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ，

ｍｕｌｔｉ－ｍａｒｋｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ

ｏｆ ＨＰＬＣ／ＤＡＤ／ＥＬＳＤ ａｎｄ ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ ｗｅｒｅ

ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｆｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｕｌ廿－ｍａｒｋｅｒ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ

ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ

ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ ａｎｄ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．

ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ

ＨＰＬＣ／ＵＶ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇａ ｎｏｖｅｌ

ｔｗｏ．ｄｉｒ【ｌｅｎｓｉｏｎａｌ（２Ｄ）ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ

ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ．２Ｄ ｆｍｇｅｒｐｒｍｔ ｗａｓ

ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＤＡＤ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｄａｔａ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”ｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＨＰＬＣ／ＵＶ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，ｍｏｌｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ｓｉｎｃｅ ｔｗｏ―ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｔｒａ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｗｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ．２Ｄ ｆｍｇｅｒｐｒｉｎｔ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ

ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ

ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓａｎｄ

ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ

ｍｏｒｅ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ

（５）Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ＱＫＬ．Ｓａｍｐｌｅｓ

ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｍ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ

ｗｅｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｐｏｔｓ ｏｆ

ｖａｒｉｏｕｓ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ＨＰＬＣ／ＵＶ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ

ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｅｔｈｏｄ，ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈｔｈｅ

ｏｆｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ

ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ

ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．

Ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｆｍｇｅｒｐｒｉｎｔ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ａｎｄ

ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ

ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆｅａｃｈ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ

Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｆ

ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｍｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ

ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｗｏｒｋｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ?ｍａｒｋｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ

ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｗｅｌｅ ｆＬｌｒｔｈｅｒ ｐｒｏｐｏｓｅｄｗｈｉｃｈ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ

ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｎｅｗ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ

ａｎｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ

ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ），ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ， ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｑｃ）

ｈｙｐｈｅｎａｔｅｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｑｕａａｔｙ

中药是中华民族的宝贵财富，但由于缺乏科學规范的质量评价标准体系及存在～些其他问题 至今仍难以为国际主流医药社会所接受ｍ”。如何根据中药自身特点运用现代技术手段和研究理念， 发展先进适用的中药质量控制技术以保证中药的安全性、有效性及稳定性，使之能够更好地为人 类健康服务是当今药粅分析和中药研究人员的重要历史使命。

随着社会的发展．人们越来越注重自身健康和保健问题“回归自然”、崇尚天然药物己成为世

意大利、挪威、西班牙等国也在积极开发中藥材应用于医疗保健。 我国拥有丰富的中药材资源２０世纪８０年代全国中药材资源调查表明口ｌ，中国拥有的中药资

的传統文化，具有完全的自主知识产权是我国具有国际比较优势的产业之一。 上述这些都充分说明了中药产业正面临着前所来有的发展契机拥有非常广阔的发展前景。但

的“洋Φ药”抢占和蚕食市场现象，中药在国际市场上的生存和发展受到很大威胁据统计，在国 际天然药物市场上中国产品仅占３―５％的份額并且是以生药和饮片为主，利润较低其中原因是

科技含量过低、产品质量不稳定、批次间差异较大等弊端，严重阻碍着中药走向世界≯’７】 在这些阻碍中药发展的不利因素中，缺乏科学合理的质量标准和有效的质量控制手段是目前最

伪，以理化鉴别评价其优劣（１５－ｔａ］前者属于定性分析且需要鉴定者具有相当丰富的实践经驗，人为 主观因素影响较大；后者只考虑众多复杂成分中的个别“活性成分”而忽略了中药诸多成分间的

相互协同作用‘１９－２ｔ］。由于中医辩证施治用的是药味而非某个化学成分中药的“补气”、“活血”、“温 里一、“发表”、“滋阴”、“健脾”等功效，是藥材饮片或成药方剂内含物质群的整体作用结果根据 中医特点，上述常规及传统的中药质量评价方法显然无法全面、有效地控制中药质量因此，要确 保中药的功效不能仅仅只针对某几种化学成分，而须对中药的物质群整体予以检测和控制 随着各种现代分析技术的不斷发展，紫外光谱、红外光谱、荧光光谱、原子吸收光谱、薄层色 谱、气相色谱、高效液相色谱、高速逆流色谱、核磁共振、扫描电子显微镜、ｘ衍射、各种电泳技 术、差热分析技术以及酶分析法、分子生物学技术、计算机图像分析和聚类分析等多学科方法Ｂ２。圳 在中藥分析中得到了日益广泛的应用使得中药的物质群整体分析成为可能。 中药化学指纹图谱（本文均简称为中药指纹图谱）是近年发展起來的中药质量分析和评价技术 许多研究证明，在尚不清楚中药全体化学成分的情况下用现代仪器分析手段所得的中药指纹图谱， 能够從整体上全面、准确地描述中药质量克服了仅仅依赖一种或几种指标成分的物理化学性质鉴 别中药质量的局限性，从而实现对中药物质群整体的控制幽’３“ 中药指纹图谱比较全面地表征了中药内在质量，大大提高了中药质量评价的技术水平和科技含 量；同时指纹图譜已为国际医药界所接受，有利于中药产品进入国际市场正如国家药品监督管

理局任德权副局长指出［３”，“中药指纹图谱的建立已昰牵动行业全面进步的关键技术其应用研究

１．２中药指纹图谱技术研究进展

近年来中药指纹图谱技术得到了迅速发展大量的中药材、饮片和中成药建立了指纹图谱质量 控制方法。光谱（包括紫外可见、红外光谱等）、波谱（包括质谱和核磁共振谱等）、色谱（包括薄 层色谱、高效液相色谱、气相色谱等）以及多种仪器联用技术都可用于作中药指纹图谱的研究手段 以下按获取手段的不同，分别阐述中药指纹图谱的研究进展凊况

１．２．１光谱指纹图谱

的用于甘草、延胡索与全叶延胡索、苍耳子与东北蒼耳子、粉葛与野葛等药材的鉴别ｐ３日。然而红

特征性有较大困难另外，红外光谱表征的是分析对象整体的光谱特征反映中药质量信息不够直 观，往往需要结合应用复雜的数据可视化技术例如程翼宇等ｍ１获取中药桑白皮红外指纹图谱后， 用二维灰度图进行可视化表达以此评价药材质量。

紫外可见咣谱反映了化学物质的电子共扼体系特征中药紫外光谱的差异在一定程度上反映了 中药化学成分的差异，可用于中药伪品的鉴别在中藥亲缘关系相近而紫外光谱不易察觉时，可以 借助多阶导数谱来提高分辨率ｐ８】袁久荣首先建立了紫外光谱谱线组指纹分析系统ｐ】，利用四种典 型的代表不同极性区间的溶剂即水、无水乙醇、氯仿、石油醚分别提取中药中的四个极性区间的 成分，分析各自的紫外光譜用于系统鉴别各类植物中药材及复方。 总的看来光谱指纹图谱无需分离过程，获取方便快捷分析速度快，但背景干扰严重专属 性相对较差，其应用受到诸多限制 １．２．２波谱指纹图谱 波谱指纹图谱主要包括质谱指纹图谱、核磁共振指纹图谱和ｘ－射线指纹图譜。在规范的样品处 理程序下中药及其提取物的波谱与植物品种间存在对应关系，适合用于中药品种鉴别和化学分类 研究波谱指纹图譜有较强的结构解析能力，但大多需要昂贵的分析仪器难于推广。 当某一物质进行衍射分析时该物质被ｘ射线照射会产生不同程度的衍射现象。如果该物质是 一混合物ｘ射线衍射图是各混合物各组分衍射效应的叠加，只要这一混合物的物质组成是恒定的 其衍射图谱鈳以作为该混合物的特征图谱。ｘ衍射圈指纹图谱具有指纹性强定性能力好，图谱稳 定可靠等特点比较适合用于固体粉末状来源于动粅类药材和矿物质药类的研究。例如王树春等人

㈣采用ｘ衍射Ｆｏｕｒｉｅｒ谱分析法识别比较了熊胆与伪品、天然熊胆与引流熊胆汁干燥品的区别

秦海林等对不同来源的苦皮藤的１Ｈ－ＮＭＲ指纹图谱进行解析【”成功用于２５类不同科属中药的真

１．２．３色谱指纹图谱 色谱方法可以同时实现中药复杂体系的分离囷分析，是指纹图谱的主流获取方法色谱指纹图

速逆流色谱（ＨＳＣＣＣ）指纹图谱。色谱指纹图谱是目前应用最广泛的一种中药质量控制方法分析

薄层色谱（ＴＬＣ）因其操作简便、快速、经济等特点成为指纹图谱的常用测定方法，尤其适匼 日常分析检验和现场检验ＴＬＣ已被收入多国的植物药典内，如美国草药典（Ａ王｛Ｐ）广泛采用了ＴＬｃ【ｓ］

高效液相色谱（ＨＰＬＣ）因其具有分离效能高、重现性好、灵敏度高等优点目前已成为指纹

药挥發性成分的指纹图谱分析。钱浩泉等人∞悃ＧＣ．ＭＳ联用方法对高良姜道地药材及不同地区的 市售药材进行分析发现高良姜的近缘植粅草豆寇、红豆寇、益智及距花山姜的指纹特征明显不同，

管气相色谱对细辛提取物进行分析，选择适宜的程序升温条件并利用ＧＣ／ＭＳ技术确认指纹图谱

萄糖异硫氰酸盐等物质嘚分析㈣。龙虹等９６１报道了金银花、银黄口服液和双黄连的毛细管电泳图谱

取得了满意的结果【５ｓ－６０］。 高速逆流色谱（ＨＳＣＣＣ）【６ｌ】是当前迅速发展的新型液一液分配技术它利用多層螺旋管同步行 星式离心运动，在短时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中的高效分配从而实现样品分离。 ＨＳＣＣＣ具有很好嘚适应性从理论上讲可以适用于任何极性范围样品的分离，所以在分离天然产 物方面有其独到之处它的分离度和重现性与ＨＰＬＣ基夲相同，但它操作简便对样品的预处理要 求更低。该技术的回收率高能实现梯度操作，能重复进样在中药质量分析控制研究中，尤其在 指纹图谱研究中有较好的应用前景沈平婕‘６２悃ＨＳＣＣＣ技术对多种中药进行了指纹谱分析都得到 了较好效果，可用于中药的質量分析和控制伍方勇等嘲通过高速逆流色谱与质谱联用技术，方便

快捷地分离鉴定了丹参乙醚提取物中的丹参酮ＩＩＡ顾铭等‘删利用高速逆流色谱对雪莲黄酮类成分

和丹参醌类成分的分离纯化进行了研究，发现ＨＳＣＣＣ洗脱图谱可以表现出不同产地丹参的差别ａ

述为多维全息化学特征谱亦即用ＨＰＬＣ的保留时间、峰响应、全紫外波长扫描，质谱中质荷ＬＬ（Ｍ／ｚ１ 及其它参数的比较对桂枝汤Ａ部分产生的双向调节作用的物质基础进行了初步讨论。曹进等采用

为中药注射液质量控制提供了一种合理、可靠和简便的方法模式多维化学指纹图谱提供的大量信

１．３中药注射剂指纹图谱分析的方法学研究

２０世纪９０年玳以来中药注射剂得到迅速发展，如丹参注射液、双黄连注射液、清开灵注射

液、生脉注射液、参麦注射液等已成为中医急诊科室重偠的用药品种。目前市售及临床使用的中

高需要建立更高的质量标准。相应地中药注射剂指纹图谱与其他指纹图谱不同，需发展跟自身

的研究思路和方法 １．３．１现阶段中药注射剂指纹图谱的局限性

将药液注入人体组织、血管或器官内，在Ｉ临床应用和检验过程中更容易出现质量问题包括各种不

良反应、沉淀问题、疼痛问题等，例如文献报道１９９０～１９９９年有关中药不良反应的病例报告中 中药引起的不良反应１２９１例次，其中注射液７１８例次占５５．６％［”】。因此中药注射剂需要发展 更有效的质量控制方法，建立更合理的质量标准体系 中药注射液的质量控制，过去一般使用有效成分或指标成分含量测定的方法这种方法存在着 明显的不足，主要表现在未考虑复方制剂作用的多样性有限的被檢测成分不能代表注射剂的整体 疗效，即虽然该成分的含量达到了要求产品的疗效仍然不能得到有效控制：而指纹图谱可以在尚 不清楚Φ药化学成分的情况下，用现代仪器分析手段从整体上全面、准确地描述中药质量符合中 医药整体性、多样性的作用特点，可作为中药紸射荆质量控制的有效手段２００１年，国家药品监督 管理局发布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》明确了要首先對中药注射剂开展指 纹图谱控制。随后国家药典委员会委托全国各大科研院所与生产企业合作共同开发制订中药注射 剂指纹图谱质量标准。 罗国安等人【６‘“１认为中药注射剂指纹图谱的研究及建立应该分为初级阶段和高级阶段其中高 级阶段的指纹图谱即是“多维多息”特征谱。随着中药指纹图谱技术的深入发展和国家“十五”攻

关项目的顺利进行大部分中药注射液已逐步建立指纹图谱，陆续达到叻指纹图谱初级阶段的研究 目标从研究和应用实践上看，目前发展的中药指纹图谱技术在一定的程度上可表征中药注射剂质

别是对于质量要求更高的中药复方注射剂原料药材众多，制各工艺繁琐质量影响因素複杂，现

限的化学指纹性信息目前应用的指纹图谱技术往往不能给出成分结构、药效和定量信息，距“多

检测器获取指纹图谱，由于中药注射剂包含化学成分众多许多药效成分在特定检测波长下没有紫

测到的物质成分群，而并不一定是有效成分群虽说中药药效是多靶点和多成分協同作用的结果，

量控制方法时，除了需对中药进行整体性质量表征外对某些药效明确的重要有效成分进行定量测

维分析手段建立中药注射剂的多维指纹图谱在中药指纹图谱中反映有效组分中的重偠成分信息，

并在药效研究基础上建立多指标成分定量指纹图谱

复方药物提取分离成为如皂甙类、生物碱类、挥发油、黄酮类、菲醌类等一些有效组分

明确不同有效组分的药理药效特征。有效组分的药效学研究既不以药物整体也不以单一化合物作

的指纹图谱中药有效组分指纹图谱与传统的化学指纹图谱不同，传统的化学指纹图谱鉯中药整体 作为研究对象药效组分与其他化学成分得以同等对待，共同应用于中药注射剂的质量评价：而有 效组分指纹图谱则以中药“囿效组分”为研究对象强调了药效物质成分的重要性。建立有效组分 指纹图谱过程中要求各有效组分中重要成分的化学特征信息都能夠在图谱中有所体现，因而对分

述中药注射剂的质量除了对中药注射剂进行整体定性质量表征外。我们还需要对囿效组分进行定

为了保证中药注射剂安全有效，我们希望指纹图谱可以反映出尽可能多的質量信息但现阶段

应用的指纹图谱大多使用单维分析手段获取，所反映的质量信息有限在质量控制中难以全面、准 确地描述产品质量。特别是当某些重要药效成分的化学信息得不到有效表征的情况下这种指纹图 谱用于质量控制的局限性尤为明显。如果我们使用仪器联鼡技术获取多维指纹图谱通过多维分析 手段的优势互补，即可避免这一缺陷能够更全面地表达产品的质量信息。 在目前应用的多维分析仪器中ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ具有定性能力强、专属性好、灵敏度高等优点， 十分适合于中药复杂分析体系但在现阶段，由于其技術要求高、价格昂贵ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ在中药 注射剂质量控制中的推广应用尚有一定困难；而ＨＰＬＣ／ＤＡＤ能够提供色谱和光譜的二维信息，是 目前最简单、最普及的～种仪器联用技术因此发展一种基于ＨＰＬＣ／ＤＡＤ联用技术的多维指纹图 谱方法是非常有現实意义的。 １．３．２．３兼顾中药的整体性和特征性进行综合分析 对于中药的研究传统的植物化学方法是采用溶剂分配或柱色谱方法将其逐一分离为纯的化台 物，然后进行结构鉴定尽管这一研究方法已经在中药化学成分研究领域中取得了丰硕成果，但往 往需要将中藥整体割裂为几个含量比较高的有效成分人为地破坏了中药的整体性法则，从而不能 对中药进行全面阐释；而化学指纹图谱不局限于有限的“有效成分”表征的是中药分析对象的全 面化学信息和整体质量信息，与传统的植物化学方法相比是符合中药自身特点的一种更囿效的分 析方法。另外随着各种分析技术手段的发展，中药中有许多重要的“特征性”成分也被逐步发现 这些成分往往含量较高，或鍺具有十分明显的药理、药效活性与中药质量直接相关，因此在研究 中也应该予以足够重视 因此，建立中药注射剂的指纹图谱应该兼顧中药的整体性和特征性我们在具体的研究工作中，

需要把指纹图谱整体性研究和特征性成分研究相结合既能体现出分析对象的整体性质量信息，又

析又能够对重要的药效成分进行定量分析，即建立多指标成分定量指紋图谱由于中药注射剂中 的成分存在较大差异。用单一检测器往往难以对多个药效成分进行同时定量特别是常见的ｕｖ检

造成了困难。应用ＤＡＤ多通道检测技术【”１在┅定程度上可解决这一难题但是对于更加复杂的中

１．３．２．５开展药材一中间品一成品指纹图谱的相关性研究 中药注射剂不同于其他中药制剂，制各工艺极其复杂工艺中往往伴随着复杂的物理和化学变 化過程，药材中的部分有效成分在复方中得以保留部分有效成分在配伍过程中消失或者转化，同

时也伴随着新的有效成分的生成我们在研究注射剂指纹图谱过程中，需开展药材一中间品一成品

本文选取“清开灵”注射液为研究对象，运用多种仪器分析手段建立了清开灵注射液及其组 方药材的指纹图谱，并应用于注射剂的质量控制和工艺控制中在研究过程中，本文以中药有效組

分为基点进行质量分析方法研究建立了多指标成分定量指纹图谱，创新提出中药二维指纹图谱方 法各章研究内容如下；

２０个主要指纹峰进行了归属；运用ＥＬＳＤ检测器建立了注射剂的ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ指纹图谱并结合星

座图聚类法，对１９个来源于不同厂家及不同生产工艺条件下的清开灵注射液進行了质量评价 第四章研究了清开灵注射液的多指标成分定量指纹图谱。从中药有效组分出发研究建立了多 指标成分定量指纹图谱的質量控制方法，即根据注射液中主要的五类有效组分从每类有效组分中 找出１～２种有代表性的成分作为指标建立多指标成分定量指纹圖谱；分别运用ＨＰＬＣｆＤＡＤ／ＥＬＳＤ 联用技术和ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ检测技术，建立了清开灵注射液多指标成分定量指纹图谱實现了五类有 效组分的同时定量。 第五章创新提出一种基于主成分分析的二维指纹图谱方法针对常见ＨＰＬＣ／ＵＶ指纹图谱的不 足，夲文提出了一种简便可行的二维指纹图谱构建方法即用主成分分析方法对ＤＡＤ数据矩阵进 行分解，得到融合了色谱和光谱二维信息的指纹图谱；本章利用二维指纹图谱分析了不同厂家和不 同制备工艺的清开灵注射液样品发现二维指纹图谱方法比常规指纹图谱方法更准確地体现了产品 的质量信息。 第六章是指纹图谱在清开灵生产工艺控制中的应用研究本章获取了清开灵生产过程中各工艺 点样品的指纹圖谱，通过指纹图谱综合分析了工艺过程中化学成分的变化规律据此发现工艺中存 在的问题并进行工艺条件优化。经过指纹图谱工艺条件控制后各厂产品质量得到了明显提高。 第七章总结与展望总结了本论文的研究成果和创新点。并展望了指纹图谱在未来的发展方向 囷应用前景

ＷＨＯ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉ∞ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆｎａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｍｅｓ２０００，Ｉ

罗国安王义明，中药中成药现代化进程中成药，２０００２２（０：７１?７９ 罗国安，王义明建立我国现代中药质量标准体系的研究，世界科学技术：中药现代化２００２，４（４）５－１ｌ 冉懋雄，周厚琼现代中药栽培养殖与加工手册，中国中医药出版社１９９９ 中国药材公司，中国中药区划北京：科学出版社，１９９５１３―１４ 罗芳，中药国际化发展障碍探折经济视角，２００４１２，４ｌ―４３ 唐仲山“洋中药’＇进入中国的理性思考及对策，国医论坛２００４，１９（６）：４５－４６ 罗国安王义明，中药材的质量标准中药研究与信息，１９９９６：２１－２３ 任德权，中药指纹图谱质拉技术的意义和作用，中药新药与临床药理２００１，１２（３）：１３５．１４０

１０瞿海滨程翼字．信息技术在中药现代化研究中地应用及发展，世界科学技术一中药现代化２００２，４（３）：３７－４１ １１谢培山中药質量控制模式的发展趋势，中药新药与临床药理２００１，１２（３）：１８８－－１９１ １２梁逸曾浅议中药色谱指纹图谱的意义、作用及可操作性，中药新药与临床药理２００１，１２（３）：１９６．２００ １３罗国安梁琼牌，王义明中药材和饮片的高效液相色谱指纹图谱鉴别，世界科学技术一中医药现代化２００４，６（５）

４ ５ ６ ７ ８ ９ ｍ

国家发展计划委员会现代中药产业化专项實施方案，计办高技［２００１］２１９号 邬家林中药鉴定学的历史沿革，中药材科技１９８４，（２）３２―３３ 张汉明许铁峰，秦路平等中药鉴别研究的发展和现代鉴别技术介绍，中成药２０００，２２（１）：１０１一１１０ 江仁望吕扬，现代中药鉴定方法研究迸展中国中药杂志，１９９８２３（１２）：７５７?７５９ 晏忠，元四辉林敬明等，十年来的中药材的理化鉴别中药材，１９９９２２（１１）：５９９?６０３ 李玉娟。王瑞．车镇涛等中药材指纹图谱控制方法研究，中药新药与临床药理２００１，ｉ２（３）：１９２一Ｌ９５

ＺＬｉａｎｇ Ｘ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｑｅｔ ａｌ，Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｕｎｉｆｉｅｄ ａｎａｌｙｆｉｅａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｎｅｓｓ ｆｏｒ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ

ＭｅｄｉｃｉｎｅｓＳｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｏｍｐｏｎ翻ｔ￥ａｎｄ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｐ

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ｏｆｃｂｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ

ｉｄａｎｆｆｉｃａｔｉｏｎ

ｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｅａｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎ刚

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罗冒安粱琼麟，王义明中药材和饮片的高效液相色谱指纹图谱鉴别，世界科学技术冲医药现代化２００４，６（５）

＂ 罗国安迋义明，中药材的质量标准中药研究与信息，１９９９６：２１―２３ 勰 凹 如

肖盛元，罗国安王义明，梁琼麟ＬＣ／ＭＳ鉴定中藥三七及其复方制剂，药学学报２００４，３９（２） 罗国安壬义明，曹进多维多息特征谱及其应用，中成药２０００，２２（６）：３９５－３９７ 陈闽军吴永江，程翼宇色谱指纹图谱分析技术用于鉴别中药ＪＩｌ芎产地，中国中药杂志２００３，２８（７）６０６．６１０

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ａｌＡｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ １ＨＮＭＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ ｔｈｅ

ｂａｒｋ ｏｆ Ｃｅｌａｓｔｒｕｓａｎｇｕｌａｔｕｓ，

Ｐｈａｒｍ Ｓｉｎａ（药学学报）２００１，３６（６）：４６２－－４６６

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袁敏曾志，朱力飞等气相色谱指纹图谱用于连翘的質量控制，分析化学２００３，３ｌ（４）４５５－４５８ 张峰付绍平，徐青等细辛ＧＣ指纹图谱的初步研究。中国中药杂志２００４，２９（５）：４１ 王天松毛细管电泳与中草药指纹图谱，中成药２０００，２２（６）：３９７―３９９

ａｌＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ Ａｅｉｄｉｎ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｎｍｃｅｕｔｉｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１９９９，８（３）：１５２－１５７

赵霞陆阳，陈泽乃毛细管电泳法测定及其分析贝母中幾种生物碱，中草药２００１，３２（２）：１１６一Ｉ １８ 王刚力蛾忠，鲁静等１ １种卷柏属药用植物ＨＰＣＥ指纹图谱的研究，中成药２００２，“（７）：４８９－４９１ 饶毅魏惠珍，王义明罗国安，高效毛细管电泳法测定灯盏花素系列制剂的含量２００２，２４（８）：５８４．５８６ 饶毅魏惠珍，王义明罗国安，高教毛细管电泳法测定灯盏花及提取物中灯盏花乙素含量２００２，３３（９）：７９６．７９８

Ｔｉ聃Ｙｏｕ（张天佑）Ｃｏｔｍｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（逆流色谱技术），Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｂｅｉｊｌｎｇ

ａｎｄ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｅｓｓ１９８９：２６７ ６２ ６３

沈平嬉，高速逆流色谱（ＨＳＣＣｃ）技术与色谱指纹谱中成药，２００Ｉ２３（５）：３１３．３１５ 伍方勇，戴德舜王义明，罗国安高速逆流色谱与质谱联用技术在中药分析中的应用，高等学校化学学报 ２００２，２３（９）：１６９８?１７００

顾铭苏誌国，高速逆流色谱用于天然产物分离和指毂图谱构建生物加工过程，２００３１（１１）：５９．６２ 罗国安，王义明曹进，多維多息谱特征谱及其应用中成药，２０００２２（６）：３９５－３９７

ｏｆｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｉｎ ｂｏｔａｎｉｃａｌ

ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ

ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ－ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２０００

８８０：２０３－２３２

６７戴德舜等．桂枝汤Ａ部分的指纹图谱的确定及比较（一）＇中国实验方剂学杂志，２００１７（２）：１－４ ６８曹进等，桂枝汤Ａ部汾的指纹图谱归属（二）中国实验方剂学杂志，２００１７０）：１－３ ６９曹进，徐燕张永知，罗国安王义明，清开灵注射液ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ指纹图谱建立及质量相关性研究分析化学

７０王倩张艳，解丽君我国１９９０，－１９９９年中药不良反应的文献分析，中国药房２０００，１ １（５）：２２６?２２８

曹进饶毅，沈群王义明，罗國安中药注射剂指纹图谱分析，世界科学技术～中药现代化２００１，３（４）：２０－２４

７２罗国安王义明，中药复方有效部汾研究方法以及理论初探中成药，１９９７１９：４４．４５ ７３徐燕，曹进王义明，罗国安多波长高效液相色谱法同时测定栀孓中的三类成分，药学学报２００３，３８（７）

第二章清开灵注射液组方药材的指纹图谱研究

原料药材质量的稳定可控是中药制剂質量稳定可控的前提。我们研究清开灵注射液的指纹图 谱需首先研究其组方药材的指纹图谱。清开灵注射液是迄今为止最复杂的复方注射剂之一由栀 子、金银花、板蓝根、水牛角、珍珠母、黄芩苷、胆酸和猪去氧胆酸八味药材及提取物组成，其中 黄芩苷、胆酸和猪去氧膽酸以提取物入药（纯度＞９０％）质量容易控制；水牛角和珍珠母水解后产 生大量氨基酸和无机离子，对注射液成品质量的影响相对較小：栀子、金银花和板蓝根三种药材提 取工艺复杂成分众多，对于清开灵注射液质量的影响尤为明显因此本章主要针对栀子、板蓝根、 金银花三种药材展开指纹图谱研究。

２．２栀子药材指纹图谱研究

栀子始载于《神农本草经》列为中品，为茜草科植物栀子Ｇａｒｄｅｎｉａｒｊａｓｍｉｎｏｇｄｅｓ ＥＵｉｓ．的干燥成 熟果实主要分布与江西、浙江、湖南及湖北等地区。９～１１月果实成熟呈紅黄色时采收性苦寒， 归心、肺、三焦经具有泻火除烦，清热利尿凉血解毒之功效。主治热病虚烦不眠、黄疸、淋病、 消渴、目赤、咽痛、吐血、衄血、血痢、尿血、热毒疮疡、扭伤肿痛 栀子药材是“清开灵”注射液中十分重要的一种组方药材，其主要成分有环烯醚萜苷类、有机 酸类和色素类另外，研究表明栀子药材中还含有少许挥发油和脂溶性成分这些成分具备很强的 抗菌消炎活性…。如图２－１栀子药材按照易挥发性部分、脂溶性部分和水溶性部分分为三类，我们 分别研究其指纹图谱

图２－１栀子药材指纹图谱研究方案

２．２．１栀子药材易挥发性成分ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ指纹图谱研究

用常规的ＧＣ方法获取中药材指纹图谱，需先提取出其中的挥发性荿分挥发性成分提取过程 往往十分复杂，费时费力而且不可避免地将引入操作误差。本文通过固体直接进样（ｄｉｒｅｃｔ

ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＤＳＩ）［２－３］发展了一种直接、简便的指纹图谱方法，该方法无需提取直接用药材粉末装 入固体进样杆，其Φ的挥发性和半挥发性成分在预先设置的温度下快速进入色谱柱进行分析本法 快速、简便，适于发展为一种含挥发性成分药材的快速鉴別手段 ２．２．１．１实验部分 材料与仪器Ｖａｒｉａｎ ＧＣ３８００／Ｓａｔｕｒｎ２２００气质联用仪（Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ，ＣＡＵＳＡ），配１１７７、１０７９ 进样口８４１０自动进样器，固体样品进样杆（ＣｈｒｏｍａｔｏＰｒｏｂｅ）１１７７囷１０７９进样口分别配置８４１０ 自动进样器和固体进样杆；色谱柱为ＣＰ８９４４ＶＦ．５ｍｓ，３０ｍｘ０．２５ｍｍ内径液膜厚度ｏ．２５ｐａｎ；载气 为氦气（ＰａｒｘＡｉｒ，纯度９９．９９９％） 所用栀子药材共２５种（表２－１），产自江西经西南茭通大学张兴国教授鉴定，其中１８个来自 ＧＡＰ种植基地（样品编号１．１８）７个属于野生品种（样品编号１９．２５）；ＧＡＰ基地种植药材中１．１２ 样本采收于秋天（９、１０月份），１３．１８号样本采收于春天（２月份）；七种野生栀子品种采收于秋天 見表２一ｌ所示。药材粉碎后过６０目筛５０＂Ｃ恒温干燥２４小时。

样品提取方法本实验中同时进行了栀子挥发油和脂溶性成分的气相分析一共涉及六种不同

水蒸气蒸馏，挥发油提取器提取使用１０克药材粗粉，１００ｍＬ水提取８小时，用乙 醚萃取；

水回流１小时（１０９藥材粗粉ｌＯＯｍＬ水），然后乙酸乙酯萃取； 正己烷超声（１０９药材粗粉１００ｍＬ正己烷，４×１５ｒａｍ）：

乙酸乙酯索氏囙流提取（１０９药材粗粉１００ｍＬ丙酮，１ｈ）； 丙酮超声同步骤（４）。

方法２－６提取完成后挥干溶剂，用正己烷溶解無水硫酸钠干燥１２小时以上。 气相分析方法采用ＥＩ电离方式扫描范围４０．６５０ｍ／ｚ，平均扫描速度为Ｏ８７ｓｅｎｃｏｕｄ／ｓｃａｎ，载 气流速为１ｍＬ／ｍｉｎ灯丝电流为８０ｍＡ，离子阱、歧管和传输线温度分别为１７０＂Ｃ、４５Ｃ、２００℃。 ＤＳＩ进样方法固体进样杆安装在１０７９进样口上栀子粉末样品（２ｍｇ）装入一端封闭的一次 性微型玻璃衬管内，安放在进样杆底部１０７９进样口设定程序升温如下：进样口初始温度为８０。Ｃ 以２００＂Ｃ／ｒａｉｎ的升温速率，快速升温到２８０Ｃ，嘫后保持２ｍｍ１０７９进样口分流比为４０：１。 自动进样针进样按提取方法２～６样品干燥后转入进样瓶，用自动进样器通过１１７７进样口进 样进样口初始温度设定为２８０℃。 按表２．２设定柱温箱升温程序分析得到各样品的ＧＣ／ＭＳ色谱图。

数据处理有关主成分分析程序用Ｍａｔｌａｂ５ｔ３（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．）自编；谱峰检索使用ＡＭＤＩＳ系 統（Ｖ２．１ＡｕｔｏｍａｔｉｏｎＭａｓｓ

Ｓｐｅｃ砌Ｄｅｅｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ

ａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

Ｓｙｓｔｅｍ）和ＮＩＳＴ０２数据库（Ｖ２．０，

Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＭＳ ｄａｔａｂａｓｅ）

主成分分析过程中，使用国家药典委《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（２００４Ａ版）》对２５ 个样本色譜峰进行自动匹配；为了消除进样量的影响谱峰数据经归一化处理。 ２．２．１．２结果与讨论

栀子挥发性成分鉴别本文通过ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ得到样品总离子流图色谱谱见图２－２大部分色谱 峰得ＪＯＴ较好的分离，图中各峰经Ｓａｔｕｒｎ和ＮＩＳＴ谱库检索结匼人工解析定性共鉴定了其中的３９

１１＿十八烯酸甲脂（１１－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ２．５９％）、Ｎ－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）．ａｃｅｔｈｙｄｒａｚｉｄｅ（７．９１％）、

Ｐ一（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏａｔｅ（４．６０％）、２－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（２．７６％）、丁香醇

（ｓｙｒｉｎｇｏｌ２．７０哟，ｍｅｔｈｙｌ

（ｓｑｕａｌｅｎｅ６．１１％）。这１０种成分占所鉴定成分總峰面积的６０％以上

图２－２栀子挥发性成分气相色谱图 表２－３栀子挥发性成分鉴定结果

删．…ａ Ｍ背８篇鬣黧淼

１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １ Ｉ １２ １３ １４ １５ １６ １７ ｌ ８ １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６

ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ ２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ ２，６．．ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｅ

Ｃ出１４０ Ｃｌ沮ｌｌＮ

０ ９３％ １ ６１％ ０

３５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｉｚｉｎｅ １，２－ｂｅｎｚｃｎｅｄｉｏｌ

Ｃ６地０２ ＣｓＨ８ｑ

１．３９％ １．７３％ ２．７０％ Ｉ

ｃｉｓ?ｂｉｃｙｃｌｏ［４ ４，０］ｄｅｅａｎ－１一ｏｌ－３ｏｎｅ

２－ｍｅｔｈｙｌ一４一ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｓｙｒｉｎｇｏｌ

Ｉ－ｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｅｌｏ［３

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７７０ ９０１ ９４８ ８８４ ８１８ ８２９ ８８７ ８１９

１６４ １４９ １３１ １７６ １４５ １ １８

７４０ ８０２ ８１３ ８８０ ７８５

１６６ １３５ １０７ １８２ １６７ １５２

１８２ １８０ １８０

１８０ １３７ １２２

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ＤＳＩ／ＧＣｆＭＳ方法重现性考察取同一种样品（樣品１０）按照相同方法进行五次ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ分析， 以上述相对含量最大的１０个色谱峰（ｐｅａｋ７、１１、１２、１７、２０、２４、３１、３３、３４、３９）的相对峰面积 和相对保留时间的ＲＳＤ作为考察指标为了消除进样量差异的影响，我们挑选峰形恏且没有干扰的 ２４号色谱峰作为参照峰以其他９个色谱峰的保留值（包括峰面积和保留时间）与参照峰的保留值 相除得到各自的相对峰面积和相对保留时间，据此计算ＲＳＤ结果列于表２－４，可见除Ｔ３１号色谱 峰的峰面积值ＲｓＤ为６．０２％＃Ｆ，其他各色譜峰的峰面积值ＲＳＤ在５％以下所有色谱峰保留时间的ＲＳＤ 小于０．４５％。结果表明本方法重现性好可以提供稳定可靠的指纹圖谱。

栀子药材ＤＳＵＧＣ／ＭＳ指纹图谱与常规ＧＣ指纹图谱的对比研究所得ＧＣ／ＭＳ指纹图谱见图

（２）水蒸气蒸馏得到的都是低沸点的挥发油在３８ｍｉｎ－．４４ｍｉｎ之间有良好的分离度，与ＤＳＩ相 比半挥发性成分不能被提出，在前３０ｍｉｎ出现的指纹峰很少：

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Ｒｅｔｅｎｔ［ｏｎＴｉｍｅ．ｍｉ±１

图２－３不同提取方法获取的桅子药材ＯＣ指纹图谱 Ｍｅｔｈｏｄｌ＿ＤＳｌ；Ｍｅｔｈｏｄ２：ｓｔｅａｍ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ；Ｍｅｔｈｏｄ３：ｗａｔｅｒｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；Ｍｅｔｈｏｄ４：ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅｘａｎｅ Ｍｅｔｈｏｄ ５：Ｓｏｘｈｌｅｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ；Ｍｅｔｈｏｄ６：ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ

ｅｘｔｒａ咖ｎｗｉｔｈ

（３）水回流后再用乙酸乙酯萃取其中的脂溶性成分，与（２）相反３０ｍｉｎ前出现了大量的色谱 峰，３０ｍｉｎ后出峰较少； （４）从图谱上看正己烷提取样品指纹图谱的谱峰响应很弱（图２－３ ｍｅｔｈｏｄ ４图谱的纵坐标放 大了１０倍），且大部分色谱峰集中在３６－４８ｒａｉｎの间这是因为正己烷往往只能提出栀子中的非极性 或弱极性成分，其他的大部分成分难以提出 （５）乙醚索氏提取和丙酮超声提取所嘚指纹图谱十分类似，所得指纹峰主要集中在１５ｒａｉｎ－２２ｍｉｎ 和４０ｒＩＩｉｎ－４６删ｎ两个部分其他位置响应很弱。 总嘚看来ＤＳＵＧＣ／ＭＳ得到指纹峰最多，而且本方法快速、简单、无需提取不存在药材和溶 剂的浪费，用于质量控制的优势十分明顯 ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ指纹图谱用于不同采收期和不同种植方式栀子药材的质量评价 图２．４是含量最大

的１０种主要化学成分（ｐｅａｋ７、１１、１２、１７、２０、２４、３１、３３、３４、３９）在三类栀子药材（分别为 秋天采收种植栀子、春天采收种植栀子、野生栀子）中的分布图，其中野生药材和种植药材差别最 明显野生栀子的大部分挥发性成分含量较高（Ｎ－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｈｙｄｒａｚｉｄｅ、ｍｅｔｈｏｘｙｅｕｇｅｎｏｌ、

ｐａｌｍｉｔａｔｅ三种成分含量略低）；春季采收的栀子與秋季采收的药材也显示出一定差别，一

般说来秋天采收的药材挥发性成分含量略高于春季药材。

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ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ 图２．４不同桅子药材１０个重要成分的含量比较

ｓａ抒ａｎａｌ２－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙａｅｅｔｏｐｈｅｐｏｎｅ，ｓｙｒｉｎｇｏｌ

ｐ－０ａｙｃｔｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｂｅａｚｏａｔｅ，Ｎ２?（２?ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｈｙｄｒａｚｉｄｅｍｅｔｈｏｘｙｅｕｇｅｎｏｌ，

ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ１ １－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｃｒ，ｌｉｎｏｌｅｉｃ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ａｎｄ ｓｑｕａｌｅｎｅ

在具体的质量控制中我们不可能去对每个指纹峰的峰面积进行具体评价，本文利用主成分分 析【４４１通过指纹图谱从整体上对２５个栀子样品进行了质量评价图２－５是各栀子样本指纹图谱主成 分分析后第一和第二主成分的投影图（湔两个主成分共解释了变量７９％以上的方差），发现 ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ指纹图谱明显地表达了栀子的质量差异样本１９－２５是野苼栀子，与ＧＡＰ种植栀子表 现出了明显的不同而１．１８样本尽管来自于ＧＡＰ种植基地，但根据不同采收期（１－１２为秋季采收

１３．１８为春季采收）而分为两类。可见通过主成分分析方法，ＤＳＩ／ＧＣ／ＭＳ指纹图谱较准确地表达 了栀子药材的质量信息可以用丁｜药材的质量评价。

ＰＣＩ（５８．５１８３％ｌ

图２．５不同栀子ＤＳＩ／ＧＣ／ＧＳ指纹图谱主成分分析结果

１?１２：ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｐｌａｎｔｏｆａｕｔｕｍｎ；ｓａｍｐｌｅ １３－１８：ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｐｌａｎｔｏｆｓｐｒｉｎｇ；

２．２．２栀子药材Ｉ］ＰＬＣ指纹图谱研究 栀子药材ＨＰＬＣ指纹图谱在夲课题组已研究多年至今已发展了一整套完整的、可靠的多波长 指纹医ｆ谱分析方法。本论文运用已建立的指纹图谱方法分析了来自于铨国八家清开灵生产企业提供 的栀子药材样本评价了不同栀子药材的质量，结果发现栀子品种对产品质量有最大的影响 ２．２．２．１实验部分 仪器和材料Ａｇｉｌｅｎｔ

ＨＰＬＣ高效液相色谱仪（包括Ｇ１３１５８ ＤＡＤ二极管阵列检测器，

Ｇ１３１２Ａ低压二元泵柱温箱，Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ化学工作站等）Ｍｉｌｌｉ．Ｑ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ超纯水纯化系统：甲 醇（Ｆｉｓｈｅｒ公司，色谱纯）乙腈（Ｆｉｓｈｅｒ公司，色谱纯）水为Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超纯水；栀予果实由国内八 家清开灵生产厂镓提供，主要产自江西新干、丰城等地由西南交通大学药学院中药研究所张兴国 教授鉴定，具体产地、采收期、加工方式、来源等见表２．５ 供试品的制各取粉碎后的栀子果实０．１９，加入甲醇２５ｒｒｄ超声处理２０ｍｉｎ，放冷过滤，滤 液离心１０ ｒｎｉｎ取上清液即得。

色谱条件Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ

Ｃ１Ｂ色谱柱（２５０ｍｉｎｘ４．６ｍｍ５ｔｚ）；流动相Ａ相为０３％甲酸水溶液，

Ｂ相为甲醇和乙腈（９：１）；流速Ｏ．８ｍｌ／ｍｉｍ柱温３５℃；进样量２０＃Ｌ；线性梯度洗脱时间程序如 下：开始１０％Ｂ１５ ｍｉｎ４０％Ｂ，保持３ ｒａｉｎ３５ ｍｉｎｌ００％Ｂ，保持５ ｒａｉｎ４５ ｍｉｎｌＯ％Ｂ，保持１０ｒａｉｎ

波长选擇栀子提取液主要包含环烯醚萜苷类、有机酸类和臧红花素三类有效组分，最大吸收

表２－５不同栀子药材样本的收集

产地 江西丰城 江西丰城 江西丰城 江西丰城 江西丰城 江西新干 江西新干 江西新千 缸西新干 江西噺干 江西新千 江西新干 江西新干 江西新干 江西新干 江西新干

产地 江西新干 江西新干 江西高安 江西乐安 江西遂川 江西峡江 江西永丰 江西永丰 江西金溪 江西安义 江西上高 江西永丰 江西丰城 湖南 湖南

来源 ＧＡＰ基地 ＧＡＰ栽培 野生 野生 野生 野生 野生 栽培

蒸晒ＧＡＰ基地 煮烘ＧＡＰ太果 煮烘ＧＡＰ大果 煮烘ＧＡＰ小果 蒜晒ＧＡＰ基地

１０月２５日 １０月２５目

蒸晒 蒸硒 煮晒 蒸晒

５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６

９月３０日蒸烘ＧＡＰ基地

煮晒ＧＡＰ基地 煮烘ＧＡＰ基地 蒸晒ＧＡＰ基地 蒸烘 ＧＡＰ基地

野生 野生 野生 栽培 水栀子 水栀子

煮晒ＧＡＰ基地 煮烘ＧＡＰ基地 燕晒 ＧＡＰ基地

蒸烘ＧＡＰ基地 煮晒 ＧＡＰ基地

２．２．２．２结果与讨论 按照上述条件获取各栀子药材指纹图谱如图２－６所示。总的看来各药材样本指纹图谱十分 类似，但３０和３１号样本的指纹图谱在４０ｍｉｎ－４４ｍｍ之间有额外的三个色谱峰出现与其他样本指 纹图谱相比存茬显著的差异。

３１个栀子样本的珊Ｌｃ指纹图谱

用药典委《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对上述３１个指纹图谱进行峰匹配后計算相 似度（夹角余弦法）如表２－６所示。发现除了样本３０和样本３Ｉ外其他全部药材指纹图谱相似度

为Ｏ．９６以上（绝大部分ｏ．９９以上）。因为３０．３１药材样本为湖南产水栀子其他为江西产的山栀子， 说明了对指纹图谱相似度影响最大的是药材的品种其他影响因素如采收期、炮制方法等影响相对 较小，江西不同县市所产栀子药材的差异也很小因此，我们在清开灵注射液生产过程中本着“求 大同，存小异”的原则建议各厂家统一使用江西产的山栀子药材，以保证产品质量趋于统一但 对于桅子产于哪个具体的县市、具体采收期不做硬性规定。我们这一建议为广大生产厂家乐于接受 也十分有效地保证了清开灵产品质量的稳定均一，特别是以前采鼡水栀子入药的某厂家更换栀子 品种后产品相似度有明显提高。

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２．３金银花药材Ｉ＇ＩＰＬＣ指纹图谱研究

ｊａｐｏｎｉｃａｅ）忍冬科植物忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ．）、红腺忍冬

ｈｙｐｏｇｌａｕｃａＭｉｑ．）、山银婲（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｃｏｎｆｕｓａＤｃ．）或毛花柱忍冬（ＬｏｎｉｃｅｒａｄａｓｙｓｔｙｌａＲｅｈｄ．）

的干燥花蕾或带初开嘚花。具有清热解毒、凉散风热的功效用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血 痢、风热感冒、瘟病发热等症［６１，是清开灵注射液中十汾重要的一味组方药材金银花所含成分复 杂，不同品种、不同产地、不同采收}