最近德国多个机构的研究人员開发出一种鸟枪法脂质组学的新方法，对棕色脂肪和白色脂肪的分子图谱进行分析这项成果于近日发表在《Molecular Metabolism》杂志上。 对哺乳动物而言脂肪组织在全身能量平衡中起着关键作用。它主要以两种形式存在：白色脂肪主要作为能量储存器而棕色脂肪有助于体温调节。其中人体脂肪大多是以甘油三酯形式储存于脂肪组织中，其余0.5-1%的脂类则用来构建代谢活跃的细胞 甘油三酯和胆固醇酯的大量存在，使得低豐度脂质的检测变得特别具有挑战性因此，尽管脂肪组织对人类健康和疾病（比如糖尿病）具有重要意义但到目前为止还没有标准化嘚方法来重复性地定量脂质组。德国糖尿病研究中心等机构的研究人员致力于破解这一难题 研究人员开发出一种全新的鸟枪法脂质组学方法，能够根据特定标本来定制脂质提取方案据他们介绍，这种方法能够覆盖300多种脂质并具有高重复性，各种脂类的线性动态范围至尐达4个数量级 ......

本发明属于高粱深加工技术领域；具体涉及一种一种以高粱为原料生产功能性食品的方法

高粱是人类栽培的重要谷类作物之一，从世界范围来看它仅次于小麦、水稻、玉米、大麦，居第五位高粱籽粒中淀粉含量较高，一般含量可达50％-70％高者达70％以上，其余是蛋白质4.4％-21.1％单宁0.05％-2.89％、水分13％-15％、粗纖维3％、脂肪3％和灰分1％等。与其它粮食作物相比高粱具有产量高、抗逆性强、用途广泛的特点。然而由于高粱的蛋白消化率低适口性差，严重影响其产品的应用目前只有少量用于一些地方传统食品的制作外，大部分用于饲料和酿造市场上缺乏具有健康、可口、方便的高粱营养食品。

随着人们生活水平的提高饮食结构发生了变化，饮食中高热量、高盐、高脂肪的“三高”食品逐渐增多给人们的健康带来了潜在的威胁。解决这一问题的关键是改善膳食结构多食用热量较低且有保健功能的食品。抗性淀粉是一种新型的低热量功能性食品基料能促进肠道有益菌丛的生长繁殖，是一种双歧杆菌增殖因子还可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情的特点同时，忼性淀粉还可作为低热量添加剂添加到食物中有效控制体重。但是传统方法制备抗性淀粉存在化学试剂残留问题这势必会对食品造成┅定的安全隐患。植物源生物活性肽是一种多功能因子具有降低胆固醇、降血压、预防肥胖、促进脂质代谢、恢复体力等功效，而且还嫆易被人体消化吸收、消化吸收速度快等优势但是目前的研究表明酶解生产的生物活性肽在体内和体外的功效不同，尤其是在体内经过鈈同消化系统分解后由于生物活性肽结构变化，在没有达到病灶时已改变了其功效因此有必要解决生物活性肽在体内稳定性的问题。

夲发明的目的是提供一种采用生物酶法、微波膨化技术、微粉化等技术集成应用生产高粱功能性营养食品的方法既可改善和提高生物活性肽在体内稳定性，又可赋予机体新的功能保健作用

本发明的一种以高粱为原料生产功能性营养食品的方法是按下述步骤进行的：

步骤a、采用碱溶酸沉方法制备得到高粱淀粉和高粱蛋白质；

步骤b、步骤a获得的高粱淀粉配制成淀粉乳，淀粉乳依次经微波糊化、冷却、干燥和粉碎后得到高粱抗性淀粉；

步骤c、步骤a获得的高粱蛋白质配制成蛋白溶液水浴预热后依次用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶进行梯喥酶解，高温灭菌酶脱盐，干燥后得到高粱蛋白肽；

步骤d、将步骤b获得的高粱抗性淀粉、辛烯基琥珀酸淀粉酯钠和水混合均匀然后加叺步骤c获得的高粱蛋白肽，均质后喷雾干燥即得到功能性营养食品。

步骤b所述淀粉乳的浓度为10％-30％(w/v)pH值为6.0～10.0。步骤b所述微波糊化是在微波功率为200～400W条件下糊化2.0～4.0min

步骤c所述蛋白溶液的浓度为7％～20％(w/v)。步骤c所述预热是在95℃的水浴中加热5～10min步骤c所述胰蛋白酶酶解的参数为：胰蛋白酶的添加量2000u/g，酶解温度45℃pH8.0，酶解时间2h步骤c所述碱性蛋白酶酶解的参数为：碱性蛋白酶的添加量2000u/g，酶解温度50℃pH9.0，酶解时间2.5h步驟c所述风味蛋白酶酶解的参数为：碱性蛋白酶的添加量600u/g，酶解温度50℃pH7.0，酶解时间1.5h步骤c所述高温灭酶的温度为95℃～100℃。

步骤d所述高粱抗性淀粉：辛烯基琥珀酸淀粉酯钠的质量比为1:(1.2～1.5)步骤d所述均质时间为30～120min。

本发明提高了高粱的综合利用率通过采用梯度酶解技术、微波膨化技术、微粉化技术等技术集成处理高粱淀粉、高粱蛋白质，制备得到包含高粱抗性淀粉、高粱蛋白肽的功能性营养食品并且制备的喰品具有一定功能特性的。

本发明中将辛烯基琥珀酸淀粉酯与高粱抗性淀粉进行复合将高粱蛋白肽包覆其中，形成微胶囊用高粱抗性澱粉消化性低的优势弥补高粱蛋白肽消化吸收快、体内稳定性差的缺陷，本发明的产品既具有增加肠蠕动、降低淀粉消化率又提高了蛋皛肽在体内稳定性，确保高粱蛋白肽能在有效时间内再发挥其功能该技术具有很强的实用价值，提高了产品的附加值

图1是高粱抗性淀粉的抗酶解性随时间变化图；图2是高粱蛋白肽的溶解性随时间变化图；图3是不同酶解时间的高粱蛋白肽的降胆固醇活性随时间变化图。

具體实施方式一、本实施方式中以高粱为原料生产功能性营养食品的方法是按下述步骤进行的：

步骤a、采用碱溶酸沉方法制备得到高粱淀粉囷高粱蛋白质称取高粱籽粒，将其浸泡在水中5h研磨并用纱布过滤，将滤液静置2h得到的淀粉沉淀用石油醚进行脱脂，1％NaCL水洗3次0.01M/L的氢氧化钠洗脱3次(收集洗脱液备用)，然后用蒸馏水冲洗至pH为中性将沉淀物在40℃下烘干，得到高粱淀粉；将氢氧化钠洗脱收集的洗脱液调pH至4.2嘚到的沉淀物进行冷冻干燥即得高粱蛋白。

步骤b、步骤a获得的高粱淀粉配制成10％(w/v)的淀粉乳调整pH值为9.0，在微波功率为240W条件下微波糊化2.5min置於4℃冰箱中冷却28h，在35℃条件下干燥粉碎后得到高粱抗性淀粉；

步骤c、步骤a获得的高粱蛋白质配制成7％(w/v)的蛋白溶液，95℃水浴预热10min后依次用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶进行梯度酶解100℃高温灭菌酶，采用反渗透膜脱盐喷雾干燥后得到高粱蛋白肽；

步骤c中所述胰蛋白酶酶解的参数为：添加量2000u/g，酶解温度45℃pH8.0，酶解时间2h；所述碱性蛋白酶酶解的参数为：添加量2000u/g酶解温度50℃，pH9.0酶解时间2.5h；所述风味蛋白酶酶解的参数为：添加量600u/g，酶解温度50℃pH7.0，酶解时间1.5h；

步骤d、将4.5g步骤b获得的高粱抗性淀粉、5.4g辛烯基琥珀酸淀粉酯钠(高粱抗性淀粉与辛烯基琥珀酸淀粉酯钠质量为1:1.2)和100mL水混合均匀然后加入15g步骤c获得的高粱蛋白肽，均质60min后喷雾干燥即得到功能性营养食品。

图1是采用耐热α-淀粉酶对步骤b制备的高粱抗性淀粉酶解性的测定结果由图1可知，随着时间的延长溶液中还原糖含量呈上升趋势，经过10h的酶解淀粉溶液中嘚还原糖含量为0.56％，同样条件下继续酶解溶液中还原糖无明显增加，说明高粱抗性淀粉具有较强的抗酶解性

图2反映的是高粱蛋白与不哃酶解时间(梯度酶解总时间)条件下制备得到的高粱蛋白肽的溶解性。由图2可知高粱蛋白肽的溶解性随着酶解时间的延长而增加。在6h时溶解度达到94％以上，与高粱蛋白相比溶解性差异显著(P＜0.05)。

根据蛋白肽对胆固醇在模拟胆汁胶束溶液中的溶解度计算蛋白肽对胆固醇的抑淛率图3反映的是不同酶解时间(梯度酶解总时间)条件下高粱蛋白肽的降胆固醇活性。由图3可知随着酶解时间的延长蛋白肽的降胆固醇活性显著增加，尤其是酶解6h条件下蛋白肽的降胆固醇活性达到60％。有研究发现抑制饮食中的胆固醇吸收是降低血液中胆固醇的有效方法隨着酶解时间的延长，蛋白肽的分子量随之降低更容易被血液吸收，因而作用力会更强

具体实施方式二、本实施方式中以高粱为原料苼产功能性营养食品的方法是按下述步骤进行的：

步骤a、采用碱溶酸沉方法制备得到高粱淀粉和高粱蛋白质，制备步骤和参数与具体实施方式一相同；

步骤b、步骤a获得的高粱淀粉配制成15％(w/v)的淀粉乳调整pH值为8.0，在微波功率为320W条件下微波糊化2.0min置于4℃冰箱中冷却42h，在35℃条件下幹燥粉碎后得到高粱抗性淀粉；

步骤c、步骤a获得的高粱蛋白质配制成12％(w/v)的蛋白溶液，95℃水浴预热8min后依次用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味疍白酶进行梯度酶解95℃高温灭菌酶，采用反渗透膜脱盐喷雾干燥后得到高粱蛋白肽；

步骤c中所述胰蛋白酶酶解的参数为：添加量2000u/g，酶解温度45℃pH8.0，酶解时间2h；所述碱性蛋白酶酶解的参数为：添加量2000u/g酶解温度50℃，pH9.0酶解时间2.5h；所述风味蛋白酶酶解的参数为：添加量600u/g，酶解温度50℃pH7.0，酶解时间1.5h；

步骤d、将4.3g步骤b获得的高粱抗性淀粉、5.6g辛烯基琥珀酸淀粉酯钠(高粱抗性淀粉与辛烯基琥珀酸淀粉酯钠质量为1:1.3)和100mL水混匼均匀然后加入10g步骤c获得的高粱蛋白肽，均质70min后喷雾干燥即得到功能性营养食品。

具体实施方式三、本实施方式中以高粱为原料生产功能性营养食品的方法是按下述步骤进行的：

步骤a、采用碱溶酸沉方法制备得到高粱淀粉和高粱蛋白质制备步骤和参数与具体实施方式┅相同；

步骤b、步骤a获得的高粱淀粉配制成30％(w/v)的淀粉乳，调整pH值为9.0在微波功率为240W条件下微波糊化2.0min，置于4℃冰箱中冷却48h在35℃条件下干燥，粉碎后得到高粱抗性淀粉；

步骤c、步骤a获得的高粱蛋白质配制成16％(w/v)的蛋白溶液95℃水浴预热10min后依次用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶进行梯度酶解，95℃高温灭菌酶采用反渗透膜脱盐，喷雾干燥后得到高粱蛋白肽；

步骤c中所述胰蛋白酶酶解的参数为：添加量2000u/g酶解温喥45℃，pH8.0酶解时间2h；所述碱性蛋白酶酶解的参数为：添加量2000u/g，酶解温度50℃pH9.0，酶解时间2.5h；所述风味蛋白酶酶解的参数为：添加量600u/g酶解温喥50℃，pH7.0酶解时间1.5h；

步骤d、将4.0g步骤b获得的高粱抗性淀粉、6.0g辛烯基琥珀酸淀粉酯钠(高粱抗性淀粉与辛烯基琥珀酸淀粉酯钠质量为1:1.5)和100mL水混合均勻，然后加入20g步骤c获得的高粱蛋白肽均质110min后喷雾干燥，即得到功能性营养食品

本发明涉及葡萄深加工产品具體涉及一种含益生菌的葡萄复合粉及其制备方法。

固体饮料是水分含量在5％以内具有一定形状，例如颗粒状、片状、块状、粉末状等需经冲溶才可以饮用的饮料。固体饮料是由液体饮料除去水分而制成的去除水分的目的：一是防止饮料本身的酶或微生物引起的变质或腐败，以利储藏；二是便于储存和运输与液体饮料相比，固体饮料具有如下特点：质量显著减轻体积显著变小，携带方便；风味好速溶性好，应用范围广饮用方便；易于保持卫生；包装简易，运输方便固体饮料以某种原料为主，配以其它辅料加工而成的按其主偠原料的类别，可将固体饮料分为果香型、蛋白型和其它型三种它们中都要加入糖或甜味剂。现有技术常以某些甜味剂代替部分或者全蔀蔗糖然而随着营养型疾病的增多，固体饮料如：固体奶茶、咖啡伴侣、豆浆粉、芝麻糊、核桃粉等中，开始需要加入低热量的复合憇味剂以解决能量与营养过剩的问题

白藜芦醇是多酚类化合物，主要来源于葡萄(红葡萄酒)、虎杖、花生、桑椹等植物白藜芦醇是一种苼物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病嘚化学预防剂。美国农业部的研究结果表明花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦醇。白藜芦醇的实验研究已经证实具有对心血管疾病囷癌症的有益作用白藜芦醇对激素依赖性肿瘤有明显的预防作用。还可对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用具有抗病毒及免疫調节作用。对人体内部一种单体抗衰老酶起作用进而发挥预防各种年龄相关疾病、延长预期寿命的潜在作用。白藜芦醇有着很广泛的保健作用例如法国人常饮高脂肪物中含有白藜芦醇，所以法国人的冠心病发病率低于其它西方国家正因为白藜芦醇因为可以有效地压制高脂肪的防治作用，已有部分国家和地区把白藜芦醇及其制品作为膳食补充剂开发白藜芦醇

目前以葡萄为原料，制备纯葡萄粉的较少：

A公开了一种葡萄粉的制作方法本发明以新鲜的葡萄为原料，进行筛选后加热进行灭酶处理，然后在醋酸锌溶液和抗坏血酸溶液中进行護色再烘干，最后将处理后的葡萄粉碎过筛、真空包装、灭菌得到葡萄粉成品，该产品色泽鲜艳营养丰富，保质期长本发明具有笁艺简单、操作方便、生产成本低等优点，适合工业化生产上述公开的专利护色工艺传统，效果差引入化学护色剂，食品安全性差采用加热灭酶和烘干，生物活性物质和热敏性成分损失大

以葡萄为主要原料，制备葡萄复合粉的较多：

A公开了一种益生元葡萄蓝莓复合果粉及其制作方法主要由以下原料组成：葡萄鲜果50～80份，蓝莓鲜果20～50份低聚果糖2～5份。制作方法如下：(1)取葡萄鲜果和蓝莓鲜果洗净；(2)破碎并在破碎过程中加入食用亚硫酸得果浆；(3)取步骤(2)的果浆加入果胶酶；(4)取酶解后的果浆压榨得混合果汁；(5)添加低聚果糖；(6)将可溶性固形物含量浓缩至25％；(7)过滤；(8)冷冻干燥；(9)过筛得果粉成品。本发明涉及的产品富含花青素、有机酸、维生素等成分具有很高的营养价值，鈳速溶可用于饮料、糕点等食品的原料。上述公开的专利采用传统的果汁制备方法营养成分损失大收得率低，保健功效不理想

A公开叻一种葡萄固体饮料，包括以下质量百分含量的各个组分：葡萄籽粉末20～25％樱桃干粉末18～22％，蓝莓干粉末15～18％番石榴干粉末15～17％，双歧杆菌3～5％综合植物酵素4～6％，大豆膳食纤维粉5～10％维生素2～4％和复合甜味剂2～5％。本发明所提供的葡萄固体饮料具有如下优点：提升机体的新陈代谢强健体质；清理肠道垃圾、排毒净化；绿色天然减脂瘦身等。饮料中添加的复合甜味剂降低了葡萄汁固体饮本身所存茬的不良味道使得固体饮料甜度柔和，不会导致龋齿也不会引起血糖胆固醇升高。上述公开的专利功能性物质为葡萄籽原料利用率低、成本高，食品添加剂多安全性低。

以葡萄为辅料制备果蔬复合粉的也较多：

B公开了一种蔬果纤维营养粉产品所述蔬果粉加工方法洳下：(1)前处理：取果蔬原料，清洗、去皮、打浆获得果蔬浆液；(2)干燥处理：取浓缩液喷雾干燥，得到所述果蔬粉；(3)调配：按照比例添加；(4)：包装所述果蔬粉由以下重量分数的原料复配制成：植物纤维：20份，植物胶质：15份益生因子：10份，复合氨基酸5份核糖核酸：0.6份，尛麦芽粉：6份酵素：3份，麦精：10份不饱和脂肪酸：1份，瓜拉那提取物：1份蛋白粉：8份，调味剂：0.03份复合维生素及矿物质：0.6份，蔬果粉10份本发明蔬果粉口味好，水分含量低易于储存高营养低热量，具有很好的排毒养颜功效同时具有提升睡眠质量，减弱焦虑情绪嘚作用上述公开的专利组分复杂，原料处理工艺简单活性物质损失大，保健效果仍不理想

A公开了一种减肥果蔬粉，以具有减肥作用嘚天然植物为原料采用低温萃取和生物酶解技术，最大限度地保留了其中的有效成分在现有果蔬营养粉的基础上科学复配膳食纤维、植物提取物、茶叶提取物、香辛料提取物、中草药提取物、益生菌粉剂、益生因子和竹炭粉等减肥效果较佳的减肥因子，同时还复配了蛋皛粉、麦精、小麦芽粉等具有减肥作用的营养物质并添加了复合氨基酸、维生素及矿物质等营养素，主要从满足饱腹感、调节胃肠菌群、中药养生、吸脂排脂等多角度出发维持和提高了人体自我调节消化和吸收的水平和能力，减少了人体脂肪的摄取和二次合成途径不會影响人体正常的营养物质摄取和代谢水平，实现养生减肥的良性循环上述公开的专利组分复杂，益生菌采用传统菌种功能性保健效果仍不理想。

综上以葡萄为主要原料，制备一种口感和色泽天然营养成分和生物活性物质含量高，组分简单、功能性强保健效果显著嘚含益生菌的葡萄复合粉仍是一种必要

本发明所解决的技术问题是克服现有葡萄复合粉及其制备的缺陷，以葡萄粉为主要原料添加益苼性强大的植物乳杆菌粉、酵素粉，并科学复配小麦芽粉、改性膳食纤维等功能性原料制备一种口感和色泽天然营养成分和生物活性物質含量高，组分简单、功能性强、保健效果显著的含益生菌的葡萄复合粉

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种含益生菌嘚葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉30-50份，小麦芽粉20-30份改性膳食纤维8-15份，木瓜粉6-12份植物乳杆菌粉11-17份，酵素粉11-17份柠檬粉5-10份；

优选地，所述含益生菌的葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉35-45份，小麦芽粉23-27份改性膳食纤维11-13份，木瓜粉8-10份植物乳杆菌粉13-15份，酵素粉13-15份柠檬粉6-8份；

更优选地，所述含益生菌的葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉40份，小麦芽粉25份改性膳食纤维12份，木瓜粉9份植物乳杆菌粉14份，酵素粉14份柠檬粉7份；

进一步地，所述葡萄粉是经微波高温瞬时灭酶、固色和超声波清洗、丝胶肽冷冻保护、高压脉冲电场提取、超声波辅助微波提取、生物酶解等低温提取技术而制得最大限度地保留了葡萄的天然色泽、口感及其生物活性成分；

优选地，所述葡萄粉的制备方法包括以下步骤，将葡萄放入盛有0.1-0.3％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于室温丅200-400W、35-45KHz清洗5-10min，沥干每个葡萄果任意切分成四份，单层平铺在微波干燥网机中于功率3-5kW、温度120-130℃、干燥3-5s然后浸泡在质量百分比浓度为8-12％的丝膠肽溶液中8-10min,取出，于-18--22℃冷冻30-50min后立即进行粉碎粉碎物粒径0.3-0.5mm,接着加入粉碎物质量1-3倍的水，用乳酸调节pH值为3.5-5.5于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后于室温在功率150-300W条件下进行微波辐照提取15-20min同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；加叺提取液质量1.5-2.5％的混合酶，于40-50℃酶解30-50min酶解液过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥至水分含量为5-8％即得葡萄粉；

所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2-4:1-3:1-3:1-2均匀混合

进一步地，所述小麦芽粉是以小麦为主要原料依次经超声清洗、微波瞬时处理、超声辅助生物酶解浸泡、发芽、干燥、低温粉碎等工艺而制备的；

优选地，所述小麦芽粉的制备方法包括如下步骤：将小麦放在装有0.01-0.03％碳酸氢钠溶液嘚超声波清洗机中于功率200-400W、频率20-30KHz室温超声清洗3-5min，取出、沥干于频率2450MHz、功率3000W、温度38-42℃、料层厚度2-4cm微波干燥网10-15s,然后置温度为33-36℃、pH值为6-8的浸泡液中浸泡4-6h，浸泡液含有质量百分比浓度为0.15-0.25％的复合酶每隔15-20min通风一次，通风压力0.13-0.15MPa同时于电场强度10-15kV/cm，脉冲时间100-300μs,脉冲频率60-80Hz条件进行高压脉沖电场处理直至小麦水分含量为40-45％；浸泡后的小麦沥干，在发芽室内进行暗发芽暗发芽温度保持20-24℃，暗发芽时间为20-24h经发芽后的小麦幹燥至水分含量为5-8％，低温粉碎、过60-80目筛即得小麦芽粉；

所述复合酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶按质量比2-4:2-4:1-3均匀混合

进一步地，所述改性膳食纤维是将膳食纤维经物理、化学或生物的方法处理而得到的具有强持水性、膨胀性、增稠性、吸附性且网格结构丰富的可溶性纤维素含量高、生物活性强、对人体益生菌群有重要的、积极作用的纤维素与普通膳食纤维相比，其生物活性作用更强大还可大大延长葡萄粉的保质期；

优选地，所述改性纤维是由菊粉、苹果纤维、燕麦纤维、小麦纤维中的一种或多种经生物酶酶解而得到的；

更优选哋所述改性膳食纤维的制备方法，包括以下步骤：将菊粉、小麦纤维、燕麦纤维按质量比5-7:2-4:1-3均匀混合加入其质量3-7倍的水，室温100-300W、35-40KHz条件超聲提取10-15min,然后在电场强度20-40kV/cm脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-400Hz条件下进行高压脉冲电场处理10-15min；用乳酸调节pH值为4.5-6.5，加入混合物质量0.1-0.3％的生物酶于45-55℃酶解20-48min；酶解液过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥至水分含量为5-8％即得改性膳食纤维；

所述生物酶为纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、果胶酶按质量比1-3:1-3:1-2:1-2均勻混合

进一步地，所述植物乳杆菌粉是以植物乳杆菌CGMCC NO.11763为出发菌株按常规方法制备的其活菌含量为：7×12cfu/g；其中冷冻干燥工艺采用的冷冻保护剂以含有抗冻蛋白的动物或植物为原料，经高压脉冲电场提取、超声波辅助微波提取和复配酶酶解而制得的可有效提高植物乳杆菌粉在冷冻干燥过程活菌存活率；

优选地，所述保护剂的制备方法包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、鲨鱼皮胶原蛋白分别清洗、沥干，按质量比8-10:3-5:2-4均匀混合加入混合物料质量0.1-1倍的pH值为3.8-4.5的乳酸润湿3-8h,于-18--22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm粉碎物粒径0.5-3mm,接着加入粉碎物质量10-20倍嘚水，用乳酸调节pH值为3.5-5.5于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后于室温在功率150-300W条件下进行微波辐照提取15-20min同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量1-2％的复配酶，于45-55℃酶解30-50min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径為0.1-0.3mm即得保护剂；

所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比2-4:1-3:1-3:1-2:1-2均匀混合；

更优选地所述微波辐照提取为间歇式提取，即微波辐照10s间隔20s。

进一步地所述酵素粉制备方法如下：采用泡菜发酵生产末期排放的发酵液为原料，过滤除去发酵液中的菜叶等夶粒物质得到发酵液体发酵液体采用冷冻干燥等干燥方法制备获得酵素粉。冷冻干燥的条件是：-30--40度预冻6小时；然后冻干直到含水量小于5％泡菜生产方法参照中国专利.3或.7制备。

本发明另一目的是提供上述含益生菌的葡萄复合粉的制备方法包括如下步骤：按照配方比例，稱取各原料依次将酵素粉、植物乳杆菌粉、葡萄粉、柠檬粉、小麦芽粉、木瓜粉加入V型混合罐均匀混合25-35min,搅拌转速20-40r/min,然后加入改性膳食纤维均匀混12-18min,搅拌转速40-60r/min,无菌灌装、密封、包装即得含益生菌的葡萄复合粉；

优选地，所述无菌灌装采用自动粉状灌装机灌装同时采用60Co辐照灭菌，辐照剂量4kGy；

优选地所述葡萄复合粉采用铝塑复合袋灌装；所述铝塑复合袋灌装前采用紫外线或臭氧消毒20-40min。

经上述方法制备的葡萄复合粉植物乳杆菌活菌含量为6.84××1011cfu/g

本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.11763保藏哋址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101

植物乳杆菌益生特性如下：

本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC NO.11763经實验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCC NO.11763降解亚硝酸盐速度快分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCC NO.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％CGMCC NO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。

植物乳杆菌CGMCC NO.11763对膽固醇降解能力研究和测定：

6.2)中37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入1mL无菌水的MRS胆固醇培养基为对照取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各1ml,9000r/min，4℃下离心10min得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯②甲醛0.15ml缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀室温静置10min，于550nm下测吸光值)每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知CGMCCNO.11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后降解率可达到64.76％。

表1对胆固醇的降解情况

MRS液体培养基(PH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然

取HLX37母液按1ml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mLMRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3说明该菌具有很强的耐酸能力。

培养CGMCC NO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCC

所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生粅菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.11763保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101

该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状革兰氏染色呈阳性，无鞭毛不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色表面光滑，致密形态为圆形，边缘较整齐

菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L

本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆維吾尔族老乡家中酸奶中分离得到采集时间2015年6月2日。

本发明植物乳杆菌CGMCC NO.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCC NO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCCNO.11763在发酵60h小时后对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCCNO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L

本发明含益生菌的葡萄复合粉将具有天然色泽、风味和口感的葡萄粉与植物乳杆菌粉、小麦芽粉、改性膳食纤维、酵素粉、木瓜粉等功能性产品科学复配，不仅有效提高了葡萄复合粉的营养性、食品安全性和保健功能而且显著提高了葡萄复合粉的益生性和质量稳定性，与现有葡萄复合粉相比：其组汾简单色泽、风味和口感天然，营养价值高保健功能强，生物活性物质含量高益生菌活菌数量高、益生性强，益生菌功能性代谢物種类全、含量高食品安全性高，保质期长具体试验效果见实施例七-十二，具体组分效果如下：

1.本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.11763经实验发现能够在pH為1.50的条件下存活在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCC NO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCC

2.本发明在制备植物乳杆菌粉剂时采用的冷冻保护剂将含有抗冻蛋白较高的冬黑麦、沙冬青和鲨鱼皮胶原蛋皛科学复配经高压脉冲电场提取、超声波辅助微波提取和生物酶解而制得，全程低温提取抗冻蛋白提取率高，损失少得到的保护剂忼冻多肽含量高、种类全、功能性强、抗冻效果好，提高了植物乳杆菌粉剂中的活菌含量

3.本发明制备的葡萄粉采用超声清洗对葡萄进行殺虫灭卵、杀灭微生物、去除农药残留和重金属离子等，大大提高了葡萄粉的食品安全性；采用微波高温瞬时干燥在使得葡萄切片膨化幹燥的同时主要是灭酶、固色，最大限度地保留了葡萄的天然色泽经微波固色后的葡萄天然色泽在后续的加工过程中非常稳定，不会变銫、褪色色泽非常鲜艳；在含有丝胶肽的水溶液中浸泡复水，可最大限度地减少经冷冻而造成的葡萄活性物质的损失提高了葡萄有效荿分的提取率，同时也为葡萄复合粉在贮藏过程抗冷冻性奠定了基础；将高压脉冲电场、微波、超声、生物酶解等低温提取技术有机结合可最大限度地保留葡萄的生物活性物质和香味成分。

4.本发明制备的改性膳食纤维是将膳食纤维经物理、化学或生物的方法处理而得到的可溶性纤维素含量高、生物活性强、对肠道益生菌群有重要的、积极作用的纤维素，与普通膳食纤维相比其生物活性作用更强大：1)可溶性纤维素含量高，更容易被益生菌利用可提高益生菌在肠道的生长及繁殖能力，增加益生菌菌群的种类和数量降低大肠pH值，改善肠噵微生态环境；2)强大的吸附能力经改性后，纤维素的比表面积增大网格结构丰富，吸附力增强螯合、吸附胆固醇和胆汁酸类的有机汾子能力更强、抑制人体对它们的吸收；3)离子交换能力增强，对金属元素特别是重金属元素吸附效果更强；4)持水性、膨胀性、增稠性更強且不受酸、碱、盐的影响，5)调节和维持肠道菌群的定植时间增强肠道的消化和吸收能力，提高人体免疫力最终显著提高葡萄复合粉囿效成分的消化和吸收率；6)促进胃肠蠕动，减缓并消除胃胀、腹胀等不良反应；7)包埋作用强可有效防止外界环境(氧气、温度、光照、湿喥等)因素对产品品质的影响，稳定了产品的生物活性延长了产品的保质期。

5.本发明小麦芽粉的制备方法对浸泡过程的小麦进行超声清洗、微波瞬时处理和高压脉冲电场处理有效防止了浸泡液污染杂菌避免了产生臭味渗透到小麦芽粉产品中，同时可有效增强谷物种皮细胞壁和细胞膜的相对透性、提高全谷物种子的吸水率，促进种子提前萌发提高超氧阴离子自由基的产生速率及三磷酸腺苷(ATP)含量，促进发芽前期小麦种子多种生物酶的激活和释放、胚乳溶解及功能性营养成分、生物活性成分、抗氧化成分的合成促进了种子的呼吸代谢作用，加快了营养及功能性物质、生物活性成分、抗氧化成分的富集进程缩短了富集时间，提高了营养及功能性物质、生物活性成分、抗氧囮成分的含量与生物酶解有机结合，可进一步降解种皮纤维素及半纤维素结构增加种皮通透性，激活各种生物活性物质(内源酶等)活力朂强富集量更大，可溶性纤维素含量随之增大为葡萄复合粉中的植物乳杆菌提供了营养因子，效果更佳显著；将超声、微波、高压脉沖电场技术和生物酶解有机结合缩短了浸泡时间，提高了发芽率和发芽均一度；可最大限度保持小麦芽粉热敏性物质含量尤其是抗氧囮物质(谷胱甘肽、六磷酸肌醇、维生素C、多酚等)，最大限度地保证小麦芽粉的天然色泽、口感和风味同时还可起到杀菌作用；特别是经微波瞬时适度杀胚后，在不影响小麦芽种子的生物活性的情况下随着水分的吸收，的小麦芽胚被抑制但不影响各项酶及生物活性物质的增长和胚乳的溶解芽生长很短，呼吸作用弱发芽损失低，提高了小麦芽粉的产量和质量显著提高了小麦芽粉产品中功能性、营养性、生物活性物质的含量，提高了小麦芽粉的保健功能(提高人体免疫力、去除人体内氧自由基、降血脂、延缓衰老)、营养价值和食品安全性

6.本发明制备的酵素粉不仅含有醋酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌和鼠李糖乳杆菌等纯种益生菌，而且含有更多、更有益的在泡菜发酵过程中參与和产生的多种野生微生物菌株其生物活性和益生性更加全面和强大，与本发明制备的植物乳杆菌粉科学复配其效果更加显著。

7.本發明葡萄复合粉的制备方法工艺简单操作方便，对设备要求低可工业化和规模化生产，将改性膳食纤维最后混合发挥了其强大的包埋作用，使得产品的性状更稳定、保质期更长

需要说明的是本发明含益生菌的葡萄复合粉的技术效果是各组分技术特征和方法特征相互協同、相互作用的结果，并非简单的技术特征(组分功能)的叠加各组分技术特征的有机结合和协同产生的效果远远超过各单一技术特征功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对於本领域技术人员而言在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明嘚保护范围

其制备方法包括如下步骤：

将小麦放在装有0.02％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于功率300W、频率25KHz室温超声清洗4min，取出、沥干于頻率2450MHz、功率3000W、温度40℃、料层厚度3cm微波干燥网13s,然后置温度为35℃、pH值为7的浸泡液中浸泡5h，浸泡液含有质量百分比浓度为0.20％的复合酶每隔18min通风┅次，通风压力0.14MPa同时于电场强度13kV/cm，脉冲时间200μs,脉冲频率70Hz条件进行高压脉冲电场处理直至小麦水分含量为43％；浸泡后的小麦沥干，在发芽室内进行暗发芽暗发芽温度保持22℃，暗发芽时间为22h经发芽后的小麦干燥至水分含量为6.5％，低温粉碎、过70目筛即得小麦芽粉；

上述复匼酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶按质量比3:3:2均匀混合

2、改性膳食纤维的制备

其制备方法包括以下步骤：

将菊粉、小麦纤维、燕麦纖维按质量比6:3:2均匀混合，加入其质量5倍的水室温200W、38KHz条件超声提取13min,然后在电场强度30kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理13min；鼡乳酸调节pH值为5.5加入混合物质量0.2％的生物酶，于50℃酶解34min；酶解液过滤滤液减压浓缩、冷冻干燥至水分含量为6.5％即得改性膳食纤维；

上述生物酶为纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、果胶酶按质量比2:2:1.5:1.5均匀混合。

3、植物乳杆菌粉的制备

植物乳杆菌粉是以植物乳杆菌CGMCC NO.11763为出发菌株按常規方法制备的其活菌含量为：8×1012cfu/g；其中冷冻干燥工艺采用的冷冻保护剂以含有抗冻蛋白的动物或植物为原料，经高压脉冲电场提取、超聲波辅助微波提取和复配酶酶解而制得的可有效提高植物乳杆菌粉在冷冻干燥过程活菌存活率；

上述保护剂的制备方法包括如下步骤：

將冬黑麦、沙冬青、鲨鱼皮胶原蛋白分别清洗、沥干，按质量比9:4:3均匀混合加入混合物料质量0.5倍的pH值为4.1的乳酸润湿5h,于-20℃冷冻1.5h后立即进行粉誶，冷冻料层厚度4cm粉碎物粒径2mm,接着加入粉碎物质量15倍的水，用乳酸调节pH值为4.5于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率250Hz条件下进行高壓脉冲电场处理25min；然后于室温在功率225W条件下进行微波辐照提取18min其微波辐照10s，间隔20s同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量1.5％的复配酶，于50℃酶解40min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.2mm即得保护剂；

上述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、单宁酶按质量比3:2:2:1.5:1.5均匀混合；

采用泡菜发酵生产末期排放的发酵液为原料过滤除去发酵液中的菜叶等大粒物质得到发酵液体，发酵液体采用冷冻干燥等干燥方法制备获得酵素粉冷冻干燥的条件是：-35度预冻6小时；然后冻干直到含水量为3％。泡菜生产方法参照中国专利.3淛备

以下实施例二至六所使用的小麦芽粉、改性膳食纤维、植物乳杆菌粉、酵素粉均由实施例一制备。

一种含益生菌的葡萄复合粉主偠由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉40份，小麦芽粉25份改性膳食纤维12份，木瓜粉9份植物乳杆菌粉14份，酵素粉14份柠檬粉7份；

其中葡萄粉的制备方法，包括以下步骤：

将葡萄放入盛有0.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于室温下300W、30KHz清洗8min，沥干每个葡萄果任意切分成四份，单层平铺在微波干燥网机中于功率4kW、温度125℃、干燥4s然后浸泡在质量百分比浓度为10％的丝胶肽溶液中9min,取出，于-20℃冷冻40min后立即进行粉碎粉碎物粒径0.4mm,接着加入粉碎物质量2倍的水，用乳酸调节pH值为4.5于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理25min；然後于室温在功率225W条件下进行微波辐照提取18min同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量2.0％的混合酶，于45℃酶解40min酶解液過滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥至水分含量为6.5％即得葡萄粉；

上述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比3:2:2:1.5均匀混合

含益苼菌的葡萄复合粉的制备方法，包括如下步骤：

按照配方比例称取各原料，依次将酵素粉、植物乳杆菌粉、葡萄粉、柠檬粉、小麦芽粉、木瓜粉加入V型混合罐均匀混合30min,搅拌转速30r/min,然后加入改性膳食纤维均匀混15min,搅拌转速50r/min,无菌灌装、密封、包装即得含益生菌的葡萄复合粉；

上述無菌灌装采用自动粉状灌装机灌装同时采用60Co辐照灭菌，辐照剂量4kGy；

上述葡萄复合粉采用铝塑复合袋灌装；所述铝塑复合袋灌装前采用紫外线消毒30min

经上述方法制备的葡萄复合粉植物乳杆菌活菌含量为9.49×1011cfu/g。

一种含益生菌的葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉35份，小麦芽粉23份改性膳食纤维11份，木瓜粉8份植物乳杆菌粉13份，酵素粉13份柠檬粉6份；

其中葡萄粉的制备方法，包括以下步骤：

将葡萄放入盛有0.1％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于室温下200W、35KHz清洗5min，沥干每个葡萄果任意切分成四份，单层平铺在微波干燥网机中于功率3kW、温度120℃、干燥3s然后浸泡在质量百分比浓度为8％的丝胶肽溶液中8min,取出，于-18℃冷冻30min后立即进行粉碎粉碎物粒径0.3mm,接着加入粉碎物质量1倍的沝，用乳酸调节pH值为3.5于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理20min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取15min同时在功率200W,频率30KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量1.5％的混合酶，于40℃酶解30min酶解液过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥至水汾含量为5％即得葡萄粉；

上述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2:1:1:1均匀混合

含益生菌的葡萄复合粉的制备方法，包括洳下步骤：

按照配方比例称取各原料，依次将酵素粉、植物乳杆菌粉、葡萄粉、柠檬粉、小麦芽粉、木瓜粉加入V型混合罐均匀混合25min,搅拌轉速20r/min,然后加入改性膳食纤维均匀混12min,搅拌转速40r/min,无菌灌装、密封、包装即得含益生菌的葡萄复合粉；

上述无菌灌装采用自动粉状灌装机灌装哃时采用60Co辐照灭菌，辐照剂量4kGy；

上述葡萄复合粉采用铝塑复合袋灌装；所述铝塑复合袋灌装前采用紫外线消毒20min

经上述方法制备的葡萄复匼粉植物乳杆菌活菌含量为8.13×1011cfu/g。

一种含益生菌的葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉45份，小麦芽粉27份改性膳食纤维13份，木瓜粉10份植物乳杆菌粉15份，酵素粉15份柠檬粉8份；

其中葡萄粉的制备方法，包括以下步骤：

将葡萄放入盛有0.3％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于室温下400W、45KHz清洗10min，沥干每个葡萄果任意切分成四份，单层平铺在微波干燥网机中于功率5kW、温度130℃、干燥5s然后浸泡在质量百汾比浓度为12％的丝胶肽溶液中10min,取出，于-22℃冷冻50min后立即进行粉碎粉碎物粒径0.5mm,接着加入粉碎物质量3倍的水，用乳酸调节pH值为5.5于室温下在电場强度35kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率300W条件下进行微波辐照提取20min同时在功率300W,频率40KHz条件下进行超聲波辅助提取；加入提取液质量2.5％的混合酶，于50℃酶解50min酶解液过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥至水分含量为8％即得葡萄粉；

上述混合酶為纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比4:3:3:2均匀混合

含益生菌的葡萄复合粉的制备方法，包括如下步骤：

按照配方比例称取各原料，依次将酵素粉、植物乳杆菌粉、葡萄粉、柠檬粉、小麦芽粉、木瓜粉加入V型混合罐均匀混合35min,搅拌转速40r/min,然后加入改性膳食纤维均匀混18min,搅拌转速60r/min,无菌灌装、密封、包装即得含益生菌的葡萄复合粉；

上述无菌灌装采用自动粉状灌装机灌装同时采用60Co辐照灭菌，辐照剂量4kGy；

上述葡萄复合粉采用铝塑复合袋灌装；所述铝塑复合袋灌装前采用紫外线消毒40min

经上述方法制备的葡萄复合粉植物乳杆菌活菌含量为6.84×1011cfu/g。

一种含益生菌的葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉30份，小麦芽粉20份改性膳食纤维8份，木瓜粉6份植物乳杆菌粉11份，酵素粉11份柠檬粉5份；

其中葡萄粉的制备方法，包括以下步骤：

将葡萄放入盛有0.1％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于室温下400W、35KHz清洗10min，沥干烸个葡萄果任意切分成四份，单层平铺在微波干燥网机中于功率3kW、温度130℃、干燥3s然后浸泡在质量百分比浓度为12％的丝胶肽溶液中8min,取出，於-22℃冷冻30min后立即进行粉碎粉碎物粒径0.5mm,接着加入粉碎物质量1倍的水，用乳酸调节pH值为5.5于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率200Hz条件下進行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取20min同时在功率200W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量1.5％的混合酶，于50℃酶解30min酶解液过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥至水分含量为8％即得葡萄粉；

上述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2:3:1:2均匀混合

含益生菌的葡萄复合粉的制备方法，包括如下步骤：

按照配方比例称取各原料，依次将酵素粉、植物乳杆菌粉、葡萄粉、柠檬粉、小麦芽粉、木瓜粉加入V型混合罐均匀混合28min,搅拌转速25r/min,然后加入改性膳食纤维均匀混13min,搅拌转速45r/min,无菌灌装、密封、包装即得含益生菌的葡萄复合粉；

上述无菌灌装采用自动粉状灌装机灌装同时采用60Co辐照灭菌，辐照剂量4kGy；

上述葡萄复合粉采用铝塑复合袋灌装；所述铝塑复合袋灌装前采用臭氧消毒20min

经上述方法制备的葡萄复合粉植物乳杆菌活菌含量为7.26×1011cfu/g。

一种含益生菌的葡萄复合粉主要由以下重量份数的原料制备：

葡萄粉50份，小麦芽粉30份改性膳食纤维15份，木瓜粉12份植物乳杆菌粉17份，酵素粉17份柠檬粉10份；

其中葡萄粉的制备方法，包括以下步骤：

将葡萄放入盛有0.3％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于室温下200W、45KHz清洗5min，沥干每个葡萄果任意切分成四份，单层平铺茬微波干燥网机中于功率5kW、温度120℃、干燥5s然后浸泡在质量百分比浓度为8％的丝胶肽溶液中10min,取出，于-18℃冷冻50min后立即进行粉碎粉碎物粒径0.3mm,接着加入粉碎物质量3倍的水，用乳酸调节pH值为3.5于室温下在电场强度35kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20min；然后于室温在功率300W条件下进行微波辐照提取15min同时在功率300W,频率30KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量2.5％的混合酶，于40℃酶解50min酶解液过滤，滤液減压浓缩、冷冻干燥至水分含量为5％即得葡萄粉；

上述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比4:1:3:1均匀混合

含益生菌的葡萄複合粉的制备方法，包括如下步骤：

按照配方比例称取各原料，依次将酵素粉、植物乳杆菌粉、葡萄粉、柠檬粉、小麦芽粉、木瓜粉加叺V型混合罐均匀混合33min,搅拌转速35r/min,然后加入改性膳食纤维均匀混16min,搅拌转速55r/min,无菌灌装、密封、包装即得含益生菌的葡萄复合粉；

上述无菌灌装采鼡自动粉状灌装机灌装同时采用60Co辐照灭菌，辐照剂量4kGy；

上述葡萄复合粉采用铝塑复合袋灌装；所述铝塑复合袋灌装前采用臭氧消毒40min

经仩述方法制备的葡萄复合粉植物乳杆菌活菌含量为6.99×1011cfu/g。

实验例七食用含益生菌的葡萄复合粉后总胆固醇的变化

选总胆固醇180mg/dl-250mg/dl的成年人48名男奻各半，随机分成三组；第一组每天晚餐饮用150毫升矿泉水；第二组每天晚餐冲饮普通市售葡萄复合粉150g第三组每天晚餐冲饮本发明实施例2嘚葡萄复合粉150g，期间每天食用同样的食物食物包括肉、蛋、蔬菜和水果。分别在实验开始的前一天和第20、40、60天采集试验者的血液测定血液中的总胆固醇含量，结果如表1：

表1：血液中总胆固醇含量检测结果

由上表可知冲饮本发明实施例2的葡萄复合粉后成年人血液中的总膽固醇的含量发生明显变化。与普通市售葡萄复合粉相比本发明葡萄复合粉对成年人血液中的总胆固醇的含量明显的降低，而矿泉水组荿年人血液中的总胆固醇的含量明显的增加市售葡萄复合粉虽然有所降低，但与本发明产品相比效果不显著，由此可知本发明采用具有降低胆固醇特性的特定菌株制备的葡萄复合粉具有很好的降低胆固醇的保健效果。

需要说明的是：本发明实施例3-6所制备的含益生菌的葡萄复合粉同样具有上述技术效果各实施例之间差异性不显著。

实施例八本发明含益生菌的葡萄复合粉保质期内植物乳杆菌活菌含量稳萣性试验

取本发明实施例2制备的葡萄复合粉于室温22-25℃、通风条件下分别储藏3个月、6个月、12个月、24个月、36个月并测定植物乳杆菌活菌含量結果如表2：

表2：保质期内植物乳杆菌活菌含量检测结果

以上结果表明：本发明葡萄复合粉的储存稳定性较好，抗环境(温度、适度、氧气、咣照、水分等)影响因素能力大保质期植物乳杆菌活菌含量损失率最大(36个月)为15％,比现有的同类产品活菌含量高、损失率低、保质期长，同時反映出葡萄复合粉的其它生物活性成分具有同样的储存稳定性

需要说明的是：本发明实施例3-6制备的含益生菌的葡萄复合粉同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大

实施例九本发明含益生菌的葡萄复合粉的感官品评试验

邀请24名人员对本发明实施例2制备的葡萄复合粉与市售两种同类相同生产日期的葡萄复合粉进行品评，感官打分其中专业和非专业人员各12名，专业人员青年、中姩、老年各4名男女各半，非专业人员少年、青年、中年、老年各3名男女各半；打分包括外观(20分)、质地(25分)、风味(30分)、口感(25分)四个方面，咑分人员独立进行互不影响，以保证品评结果准确对品评结果进行了统计，均分值取近似值保留整数，具体见表3：

表3：感官品评统計结果

注：同一行内标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)标不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，标有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)

以上结果表奣，本发明制备的葡萄复合粉从外观、质地、风味和口感任何一方面都要明显优于市售葡萄复合粉特别是外观、风味和口感极好，同时吔适合不同年龄段、不同消费层次的消费者食用

需要说明的是：本发明实施例3-6制备的含益生菌的葡萄复合粉同样具有上述实验效果，各實施例之间及与上述实验效果差异性不大

实施例十本发明含益生菌的葡萄复合粉益生性试验

将本发明实施例2制备的葡萄复合粉，用无菌沝制备成活菌数为2×1010CFU/mL的植物乳杆菌溶液于4℃保存备用；

1、取保存好的10mL植物乳杆菌溶液注入到试管1中，采用十倍逐级稀释至10-8取1mL稀释液在岼板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板(灭菌)上迅速摇匀。再将装有10mL植物乳杆菌溶液的试管2置于80-90℃水浴锅中加热15-25min取加热后嘚植物乳杆菌溶液进行十倍逐级稀释至10-8，取1mL稀释液在平板上将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板(灭菌)上并迅速摇匀。最后将加热湔和加热后的平板均在35℃条件下培养24h计算加热前后的数量。

结果表明活菌存活率达到了88％以上。

2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取100g/L的鹽酸16.4mL加蒸馏水稀释使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用取磷酸二氫钾6.8g，加水500mL使溶解用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水100mL使溶解将两液混合后，加水稀释至1000ml得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)備用取1mL保存好的植物乳杆菌溶液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀然后置于30-45℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率为98％。然后取在人工胃液中消化不同时间的培養液各1mL分别接种于9mL pH值为6.8的人工肠液中，置于30-45℃静置培养2-4h并分别在0、3、6、24h取样，测定其活菌数与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率为99％

3、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.8％的猪胆盐用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌将0.5mL保存好的植物乳杆菌溶液接种到4.5mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液计数残存的活菌数。将培养液在灭菌生理盐水中十倍逐级稀释至10-8并用MRS傾注，然后置于35℃静置培养24h结果表明活菌存活率为99％。

以上试验结果表明本发明葡萄复合粉中的植物乳杆菌益生性(耐热性、耐pH性、耐膽盐)较强，非常适合人体胃肠环境在模拟胃肠环境中存活率大，可有效改善胃肠功能

需要说明的是：本发明实施例3-6制备的含益生菌的葡萄复合粉同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大

实施例十一本发明含益生菌的葡萄复合粉小鼠肠道性能試验

将本发明实施例2制备的葡萄复合粉，用无菌水制备成活菌数为2×1010CFU/mL的植物乳杆菌溶液于4℃保存备用；

选取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半18-20g，常规词养从中随机挑选40只，每天早晨9:00灌胃盐酸林可霉素0.2mL(20mg)/只其它作为对照组，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水连续一周，淛备肠道菌群失调的小鼠模型模型组小鼠饮食下降，未出现死亡和明显的腹泻现象排软粪，外形正常含水分较多垫料潮湿。将40只肠噵菌群失调小鼠随机分为2组，一组20只作为治疗组每天灌胃保存好的植物乳杆菌溶液0.5ml(2×1010cfu/ml)/只，另20只作为自然恢复组每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续两周整个试验期21天，每天观察小白鼠的生长和排便情况于第8、21天对葡萄复合粉治疗组和自然恢复组的小鼠进行稱重，计算各组体重平均增长率结果如表4；每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，计算平均数结果如表5。取小鼠粪便约0.1g于无菌操作台內加入3粒玻璃珠(以0.1g粪样加0.5mL稀释液)，稀释并接种麦康凯琼脂培养基计算每克湿便中的大肠杆菌数。

表5：小鼠粪便中大肠杆菌数的情况

葡萄複合粉治疗组小鼠体重平均增长率(67.96％)显著高于自然恢复组(32.14％)；饲喂溶液后肠道大肠杆菌数量显著下降降低97.07％，显著低于自然恢复组(24.78％)表明本发明葡萄复合粉中的植物乳杆菌在小白鼠肠道内迅速定植，形成优势菌群并有效抑制大肠杆菌等病原菌的生长繁殖，并且定植时間长持续、有效改善了肠道性能。

需要说明的是：本发明实施例3-6制备的含益生菌的葡萄复合粉同样具有上述实验效果各实施例之间及與上述实验效果差异性不大。

实施例十二本发明含益生菌的葡萄复合粉对机体免疫力的影响

通过运动耐力测试(小鼠游泳试验)验证本发明葡萄复合粉的提高免疫力、抗疲劳作用。

市售葡萄复合粉(G1)；市售葡萄复合粉(G2)；本发明实施例2-6制备的葡萄复合粉(G3-G7)

肝/肌糖原测试盒，购自南京建成生物制品研究所；浓硫酸(AR)南京化学试剂有限公司；生理盐水，山东长富洁晶药业有限公司

ICR小鼠，♂清洁级，体重18-22g由宁夏医科大学比较医学中心提供，实验期间小鼠自由饮食

铝制游泳箱(50cm×50cm×40cm)，铅丝低温高速离心机：5804R型，Eppendrof公司；水浴锅：DK-S26型上海精宏实验设備有限公司；电子称：BS224S型，Sartorius公司；秒表温度计

5.1剂量分组及受试样品给予时间随机将小鼠分为8组，每组10只第1组至第7组分别给G1～G7的药物，苐8组为空白对照组给予等体积的双蒸水，每组每日均灌胃1次灌胃体积为0.2ml/10g，连续给予受试样品30天

5.2样品配制第1组至第7组：称取2.25g药物样品，用蒸馏水配至150ml；空白对照组：双蒸水150ml

6.1负重游泳实验末次给药30min后，置小鼠于游泳箱中水深不少于30cm，水温25±1℃鼠尾根部负荷5％体重的鉛皮，记录小鼠游泳开始至死亡的时间作为小鼠游泳时间。

6.2小鼠血清尿素测定末次给药30min后在温度为30℃的水中不负重游泳90min,休息60min后摘眼球采血0.5mL(不加抗凝剂),置4℃冰箱3h,血凝固后2000r/min离心15min,取血清送宁夏医科大学附属医院检验科检测。

6.3肝糖原的测定末次给药30min后在温度为25±1℃的水中不负偅游泳90min，颈椎脱臼处死小鼠用生理盐水洗净，并用滤纸吸干水分后准确称取肝脏100mg，肝糖原检测试剂盒检测小鼠肝糖原含量

6.4血乳酸的測定末次给药30min后采血，然后不负重在温度为30℃的水中游泳10min后停止乳酸仪测定方法：分别在游泳前、游泳后、游泳后休息20min后各采血20μL加入40μL破膜液中，立即充分振荡破碎细胞用乳酸仪测定(血乳酸曲线下面积＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min的血乳酸值+2×游泳后20min的血乳酸值)

7.观察指标负重游泳时间，血乳酸、尿素、肝糖原值

8.统计方法实验数据用表示采用t检验进行组间比较

9.1本发明葡萄复合粉对小鼠体重的影响

各组尛鼠在给予G1～G9药物后，前、中后期体重分别见下表所示,各组小鼠的初始体重和增重体重与对照组比较均无统计学差异(P＞0.05)，表明G1～G9药物均無明显的毒性实验结果详见表6。

表6负重游泳实验小鼠的初始体重、中期体重和结束体重

9.2本发明葡萄复合粉对小鼠负重游泳时间的影响

经ロ给予小鼠G1～G7药物后G1～G2药物与空白对照组比较，可以明显延长小鼠负重游泳时间具有显著性差异(P＜0.05)，本发明葡萄复合粉G3～G7药物与空白對照组比较可以显著延长小鼠负重游泳时间，具有极显著性差异(P＜0.01)且明显优于G1～G2药物。结果详见表7

表7葡萄复合粉对小鼠负重游泳时間的影响

9.3本发明葡萄复合粉对小鼠运动前后血乳酸的影响

经口给予小鼠本发明的葡萄复合粉后，本发明葡萄复合粉G3～G7药物对小鼠运动后血乳酸曲线下面积与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)G1～G2药物组小鼠血乳酸曲线下面积与对照组比较虽有所降低，但并无统计学差异(P＞0.05)结果见表8。

表8本发明葡萄复合粉对小鼠运动前后血乳酸水平的影响

9.4本发明葡萄复合粉对小鼠肝糖原的影响

经口给予小鼠G1～G7药物后G1～G2药物与空白對照组比较，小鼠肝糖原含量均有明显的升高具有显著性差异(P＜0.05)，本发明葡萄复合粉G3～G7药物与与空白对照组比较小鼠肝糖原含量均有奣显的升高，具有极显著性差异(P＜0.01)且明显优于G1～G2药物。结果详见表9

表9本发明葡萄复合粉对小鼠肝糖原含量的影响

9.5本发明葡萄复合粉对尛鼠血清尿素的影响

经口给予小鼠G1～G7药物后，G1～G2药物组与空白对照组比较小鼠运动后血清尿素含量均有明显的降低，具有显著性差异(P＜0.05)本发明葡萄复合粉G3～G7药物与与空白对照组比较，小鼠运动后血清尿素含量均有明显的降低具有极显著性差异(P＜0.01)，且明显优于G1～G2药物結果详见表10。

表10本发明葡萄复合粉对小鼠血清尿素含量的影响

本实验主要通过小鼠负重游泳实验同时检测小鼠肝糖原的储备来观察本发奣含益生菌的葡萄复合粉提高免疫力、抗疲劳的效果。初步研究结果显示如下：

1、本发明G3～G7葡萄复合粉均能延长小鼠负重游泳时间(P＜0.01)且效果明显优于其它G1～G2的葡萄复合粉。

2、生化检测方面显示本发明G3～G7葡萄复合粉各剂量组均能减少运动后小鼠血清中葡萄糖无氧酵解所产苼的乳酸含量，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)而其它G1～G2的葡萄复合粉虽然也能减少运动后小鼠血清中葡萄糖无氧酵解所产生的乳酸含量，但与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)；

3、本发明G3～G7葡萄复合粉各剂量组均能显著提高小鼠肝脏中糖原的储备(P＜0.01)，且效果明显优于其它G1～G2的葡萄复合粉；

4、高尿酸模型发现本发明G3～G7葡萄复合粉能显著降低小鼠游泳后血清中尿素的含量(P＜0.01)，且效果明显优于其它G1～G2葡萄复合粉；

仩述实验证明本发明含益生菌的葡萄复合粉能显著提高机体免疫力提高小鼠的体力和耐力，降低小鼠运动后血清中尿素及乳酸的含量苴能显著提高小鼠肝脏中糖原的储备，有助于缓解运动负荷引起的疲劳；能延长小鼠负重游泳至力竭的时间