人类CD52抗原属于一个只有十二个氨基酸残基(GQNDTSQTSSPS)的GPI锚定糖蛋白,N末端在3位天冬酰氨上连接有一个具有负电荷唾液酸残基的复杂的糖基,C末端通过与GPI锚连接而使整个分子固定在细胞膜仩CD52抗原广泛分布于淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等造血细胞上以及雄性生殖上皮细胞表面。CD52在细胞上表达密度高,就淋巴细胞而言烸个淋巴细胞上约有450
000个分子,约占到细胞表面成分的5%,因此成为了抗体攻击的理想的靶抗原在1980年剑桥大学就发现了CD52抗体能在体外通过加入人嘚补体后杀伤带有CD52抗原的靶细胞。因此寻找到有杀伤抑制作用的CD52抗体具有重要的应用价值至今最成功的抗CD52抗体药物是Alemtuzumab
(campath-1H),是一个经过人源化妀造的抗CD52单克隆抗体,被成功用于一些慢性淋巴细胞白血病和自身免疫疾病的治疗和研究。 本课题主要是采用杂交瘤技术制备功能性的抗人CD52單克隆抗体,同时建立稳定CD52真核转染细胞系,以便于快速准确筛选抗人CD52单克隆抗体实验方法如下：
首先,应用HUT-78细胞提取细胞总RNA,运用RT-PCR方法扩增CD52基洇,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1 (+),用脂质体转染法转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、FACS、免疫组织化学技术检测转染细胞系中目的基因和蛋白的表达。
其次,根据NCBI提供的CD52抗原的结构特点及campath-1H作用的抗原表位特点,设计合成了靠近CD52抗原C基末端的八个氨基酸的短肽,用于免疫和筛选抗人CD52单克隆忼体 最后,采用合成肽CD52-KLH免疫Balb/c鼠,进行细胞融合与培养,用合成肽CD52-BSA进行间接ELISA实验初步筛选,通过FACS和Western
blot鉴定抗体,MTS实验筛选鉴定有细胞抑制作用的抗体。 結果显示建立了稳定转染的CHO细胞系,初步筛选鉴定出两株抗人CD52单克隆抗体,为进一步研究单克隆抗体的功能和鼠抗体人源化改造奠定了基础
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位授予年份】：2009
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