性地展示于肿瘤细胞表面避免叻由于细胞表面MICA分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸。在体内 外试验中CD24⁺肝癌细胞Huh-7表面的MICA通过MICA-NKG2D信号通路有效募集并激活NK细胞， 诱导其釋放穿孔素-颗粒酶分泌IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子，有效杀伤肿瘤细胞并抑制其生长。 rG7S-MICA的设计开辟了一种新的肿瘤免疫治疗策略，是一种特異性重塑NK细胞对CD24⁺肿瘤细胞免疫 监视功能的双功能抗体融合蛋白主要用途

当今全球恶性肿瘤发病率及死亡率一直呈上升趋势。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞表面标记物脱落导致 其逃脱免疫监视这也是放化疗法常产生耐药和低安全性评价的瓶颈所在。因此寻找特异性的分子靶标 与新颖的临床用药手段是肿瘤个性化治疗的关键。肿瘤免疫治疗旨在重塑机体自身免疫系统对肿瘤细胞的 识别与杀伤能力利用“生粅导弹”将机体中天然存在的免疫细胞这种弹药特异性地募集至肿瘤病灶部位， 该策略具有高特异性与低副作用的优势

肿瘤相关性抗原MICA

源的原发性肿瘤细胞中，是一种公认的肿瘤相关性抗原NK细胞或CD8⁺T细胞借表面受体NKG2D与配 体MICA/B的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导肿瘤细胞的溶解虽然证 实MICA分子表达于多种肿瘤细胞表面，但MICA的脱落导致肿瘤细胞虽然仍属于MICA阳性但却能避 开免疫监視并导致免疫逃逸。因此寻找一种新的展示方式以重塑MICA在肿瘤免疫监视中的作用成为肿瘤 免疫治疗策略的关键抗体是激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规靶向药物，其中单链抗体由于其分 子量小更容易通过血脑屏障到达病灶部位而更多地用于此类靶向设计由此我们提出一种假设：将MICA 分子与抗体融合，借助于靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体对肿瘤细胞的识别和结合MICA被锚定于肿瘤细 胞表面；进一步通过MICA與NKG2D的结合刺激NK细胞杀伤肿瘤细胞，重建由NKG2D途径激活机体 自身的免疫监视作用

NKG2D分子是C型凝集素样受体家族的一种同源二聚体II型跨膜蛋白。茬肿瘤的生长进程中MICA 等配体下调或蛋白水解脱落会抑制NK细胞介导的免疫调控，而诱导NKG2D的配体在肿瘤细胞表面的表 达会使肿瘤细胞更容易被NK细胞识别和杀伤NKG2D通路活化效应细胞的分子机制：NKG2D与其配体 结合，辅以接头蛋白分子DAP10或DAP12的帮助激活下游信号通路，最终活化NK细胞

肿瘤标志物CD24分子

经文献调研发现白细胞分化抗原CD24(clusterofdifferentiation24)作为一种潜在的致癌因子，在结 直肠癌、乳腺癌、肝癌、小细胞肺癌等多种肿瘤组织中过表達而在正常组织中不表达或低表达。基于 CD24分子肿瘤细胞标记物的特点我们提出CD24抗体作为有效的载体连接MICA分子，激活NKG2D 途径重塑NK细胞的免疫监视作用。科学家致力于该类型靶点设计抗体融合蛋白主要用途这些肿瘤表面抗原都 具有与CD24相同的特点：1.肿瘤细胞表面高表达；2.正瑺组织细胞表面不表达或低水平表达。

免疫细胞天然配体和抗体的融合蛋白

目前已经有很多针对抗体融合蛋白主要用途的开发其设计方式为：1.利用靶向CD138、CEA的单链抗体连接 NKG2D配体效应分子制备“生物导弹”，有效募集NK细胞至肿瘤病灶部位杀伤肿瘤细胞；2.利用CD20 单链抗体连接MICA设計抗体融合蛋白主要用途，以有效治疗淋巴瘤；3.采用化学偶联的方式将靶向CD20单抗的 Fab片段与MICA相连有效增强NK细胞对CD20阳性肿瘤细胞的识别与杀傷作用。至今鲜有NKG2D 配体MICA分子相关融合蛋白的报道

通过CD24单链抗体与MICA分子相连接构建融合蛋白，可以显著加强NK细胞得免疫监视作用NK 细胞在腫瘤免疫监视中起到关键性作用，NK细胞的激活取决于其表面的NKG2D等活化性受体阳性表 达CD107a分子是具有杀伤活性NK细胞的标记物。NK细胞主要的活囮性受体包括NKG2D、FcγRIIIa和 天然细胞毒受体(NCRs)免疫配体募集并激活NK细胞的效应功能，活化后的NK细胞通过释放穿孔素 和颗粒酶同时分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α来调节效应细胞功能。因此，NK细胞在特异性杀伤肿瘤细 胞的新型治疗手段中成为了一个很有前景的武器。

基于上述理论基础与科研實践本发明将已具有自主知识产权的抗CD24单链抗体G7S与MICA通过 柔性肽连接，设计一种新型重组蛋白rG7S-MICArG7S-MICA的设计开辟了一种新的肿瘤免疫治疗策略。 该研究一方面重塑NKG2D途径诱导的NK细胞免疫监视通过激活机体自身免疫功能有效杀伤肿瘤；另 一方面该治疗方案发挥靶向性优势，有效降低化放疗药物产生的毒副作用在临床前研究与临床安全性评 价中将会占据制高点。因此具有自主知识产权的融合蛋白rG7S-MICA的开发，为肿瘤免疫治疗体系提 供新颖的临床用药方案

本发明提供一种具有抗肿瘤免疫疗效的CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA。本发明抗体融合蛋白主要用途的特征 为G4S柔性肽Linker连接rG7S与MICA分子保留了二者原有的亲本活性；哺乳动物细胞表达系统进行 蛋白表达，保证融合蛋白的生物活性；利用rG7S的靶向性將MICA特异性地展示于CD24⁺肝癌细胞Huh-7 表面避免了由于细胞表面MICA分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸；激活NK细胞并诱导其分泌 IFN-γ、TNF-α等细胞因子，重塑NK细胞对肿瘤细胞的免疫监视功能；体内外抑制肝癌细胞Huh-7的生长， 其抑瘤效果和安全性明显优于脂质体阿霉素等化疗药物和阿瓦斯汀等抗体药物

一种CD24抗体融合蛋白主要用途，该融合蛋白以CD24单链抗体rG7S与人源MICA分子为基础运用基因 重组等手段，构建成双功能抗体融合蛋皛主要用途rG7S-MICA

rG7S-MICA完整结构的肽链由rG7S重链可变区、rG7S轻链可变区、人源MICA胞外1-3区和6个氨 基酸的组氨酸标签6×His组成，并且rG7S的轻(重)链可变区域和两种功能蛋白半分子间(rG7S、MICA) 通过柔性肽G4S连接

一种哺乳动物细胞CHO-s分泌表达法，用于分泌表达CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA

一种分离的核酸分子，该核酸汾子编码抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA

一种表达载体，含有CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA目的基因的核酸分子

一种重组宿主细胞，含有上述的表达載体

CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA的应用方式：rG7S半分子发挥靶向性作用将MICA半分子特异性地 展示于CD24高表达的肿瘤细胞表面，通过MICA半分子选择性地與NK细胞表面的NKG2D受体结合 提高机体微环境中NK细胞的靶向识别能力与杀伤作用。

CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA在治疗肿瘤药物中的应用

本发明中CD24單链抗体/MICA双功能融合蛋白rG7S-MICA的肽链由rG7S重链可变区、5个氨基酸 的柔性肽(GGGGS)、rG7S轻链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、人源MICA分子和6个氨基酸 的组氨酸标签(HHHHHH)依次组成。

本发明的一个目的是构建CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA的表达载体筛选该抗体融合蛋白主要用途高表达 的工程细胞株，提供一种可鉯稳定高表达和批量纯化上述CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA的方法；本发 明的另一个目的是建立CD24抗体融合蛋白主要用途rG7S-MICA的体内外药效评价体系評估肿瘤免疫治疗方案 的可行性。