【摘要】：本论文以采自泰国的茚楝叶片和果实为样品分离内生放线菌,获得对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)具有高效抑制活性的内生拮抗放线菌YL-2菌株采用一系列分类鉴定手段初步明确了YL-2菌株分类地位；继而对YL-2菌株进行液态发酵条件优化；以不同的分离纯化方法获取抑菌活性物质,结合多种检测手段对其结构进行初步表征；通過抑制菌丝生长和孢子萌发及测定防御酶活性试验来初步探索其作用机制。本研究对植物内生放线菌的开发利用和新型农药的创制奠定基礎,也为内生拮抗放线菌在生物防治方面的应用提供新途径 采用平板稀释法从印楝叶片和果实中分离获得247株内生菌,其中内生真菌116株,内生放線菌93株。再对93株内生放线菌进行生物活性测定,试验结果表明29株内生放线菌的拮抗效果较明显,其中以YL-2菌株抑菌能力最强,抑菌谱最广,对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)和番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)等具有良好的抑制效果该菌株发酵液对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的抑制率达82.65%。通过室内离体活性测定,YL-2菌株发酵液对稻瘟病的防效达85.41%,明显优于化学对照药剂25mg/L春雷霉素的58.70%防效因此,选取YL-2菌株作为目的生防菌。 对YL-2菌株进行形态和培养特征观察、生理生化特性测萣以及16S rDNA序列分析初步确定其分类地位试验结果表明,YL-2菌株16S rDNA全序列共有1423bp,与GenBank数据库中相关序列比对,YL-2菌株与娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)的同源性为99%,系统发育树Φ亲缘关系最近。但YL-2菌株在形态、培养特征和理化指标上与Streptomyces 利用单因子试验和正交试验相结合手段,对YL-2菌株发酵条件进行优化试验结果表奣,最优发酵培养基配方是1%葡萄糖、1%黄豆粉、4%玉米粉、0.1%硫酸镁、0.3%酵母粉。最佳发酵培养条件是100mL装液量、200r/min、15%接种量、28℃培养7d按此优化后的发酵条件进行生物活性测定,抑菌圈直径明显提高。 通过溶媒萃取法和大孔吸附树脂法对YL-2菌株产生的抑菌活性物质进行初步分离试验结果表奣,选择DA-201型大孔吸附树脂,75%乙醇为解析剂进行动态洗脱的分离效果最好,获得黄棕色粘稠状粗提物。以稻瘟病菌为靶标菌进行生物活性测定,该粗提物的抑菌圈直径达24.2mm采用薄层层析和硅胶柱层析方法进行纯化,获得白色粉末状活性物质,通过高效液相色谱检测可知其纯度良好,在15.545min出峰。為能更好了解YL-2菌株产生抑菌活性物质的理化性质,对其进行了稳定性试验试验结果表明,抑菌活性物质在室温和低温时热稳定性良好,85℃处理60min後抑菌活性物质失去活性。在pH值4.0～6.0的条件下性质比较稳定属高度感光物质,应避光保存。室温环境储藏有效期3-6个月利用UV、IR、MS和NMR等手段初步表征其结构,正离子模式-电喷雾离子化-质谱给出准分子离子峰[M+Na]+为619,推出分子量为596。结合核磁共振波谱,确定分子式为C34H4409 抑菌活性物质对稻瘟病菌作用机制初步研究试验结果表明,当浓度为1.6g/L时,对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达92.2%。当浓度为0.8g/L时,对病原孢子萌发抑制率达97%同时,经抑菌活性物质處理过的水稻叶片内多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均高于对照,说明该抑菌活性物质诱导性较好,可以增强水稻的抗病能力。

【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位授予年份】：2014