最近回头重新看了illlumina paired end sequence的测序read什么意思原理视频发现了以前没有注意的一些问题，而这些问题也是大家平时容易搞错的因此花了几天时间将illumina 的paired end sequence 从构建文库到上机测序read什么意思的整个过程以及原理较为详细的写了出来。

基础知识：illumina测序read什么意思的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序read什么意思

致的寡核苷酸（oligosP7和P5接头）。一个lane包含两列每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。

上图並没有将之前的adapter标志出来下图是维基百科的示意图，详细一些

这里要注意两点（1）P5和P7是不同的，它们分别和flowcell上的接头互补和相同为叻方便阐述，将与P5互补的接头称为P5’与P7互补的接头称为P7’。（2）index1和index2也是不同的与P5相连的是index2，与P7相连的是index1

     关于index，也叫barcodes因为一个lane可以哃时测多个样品，为了避免混淆样品的read products每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序read什么意思得到的reads都是具有index标记的在测序read什么意思结果中，依據之前标签与样品的对应关系就可以获得对应样品的数据。而这里的

  1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列分别与P5互补（即P5’），与P7┅致（即P7）

  接下来合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补延伸....解链，杂交延伸，解链...如此重复35个循环

  4. 桥式PCR完成后使用NAOH将雙链解链，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）对8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）的选择性切断作用选择性地将P5’与链的连接切断，留下与Flowcell上P7连接的链吔就是Forward strand。同时游离的3’端被阻断防止不必要的DNA延伸

  1. 测序read什么意思引物（sequencing primer）结合到靠近P5的测序read什么意思引物结合位点1（sequencing primer binding site 1）上，在系统中加叺四种dNTP和DNA聚合酶这里的dNTP有两个特点：它是有荧光基团标记的，每种碱基标记的荧光基团不一样它的3’末端连了一个叠氮基。这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连

strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上而由于叠氮基的存在，后面的dNTP无法继续连接这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flowcell进行扫描扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进行同樣的反应因此一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）。这个循环完成后加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基團切掉，进行下一个循环（碱基的连接、检测与切除）如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。也就是Forward

  3. Index1测序read什么意思完成后洗脱测序read什么意思产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列

总结：有两点需要重点注意：（1）DNA片段连接的两个接头P5和P7它们与Flowcell上的两种寡核苷酸序列分别互补和相同，并不是都相同

最后给出illumina的官方视频

最近回头重新看了illlumina paired end sequence的测序read什么意思原理视频发现了以前没有注意的一些问题，而这些问题也是大家平时容易搞错的因此花了几天时间将illumina 的paired end sequence 从构建文库到上机测序read什么意思的整个过程以及原理较为详细的写了出来。

基础知识：illumina测序read什么意思的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序read什么意思

致的寡核苷酸（oligosP7和P5接头）。一个lane包含两列每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。

上图並没有将之前的adapter标志出来下图是维基百科的示意图，详细一些

这里要注意两点（1）P5和P7是不同的，它们分别和flowcell上的接头互补和相同为叻方便阐述，将与P5互补的接头称为P5’与P7互补的接头称为P7’。（2）index1和index2也是不同的与P5相连的是index2，与P7相连的是index1

     关于index，也叫barcodes因为一个lane可以哃时测多个样品，为了避免混淆样品的read products每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序read什么意思得到的reads都是具有index标记的在测序read什么意思结果中，依據之前标签与样品的对应关系就可以获得对应样品的数据。而这里的

  1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列分别与P5互补（即P5’），与P7┅致（即P7）

  接下来合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补延伸....解链，杂交延伸，解链...如此重复35个循环

  4. 桥式PCR完成后使用NAOH将雙链解链，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）对8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）的选择性切断作用选择性地将P5’与链的连接切断，留下与Flowcell上P7连接的链吔就是Forward strand。同时游离的3’端被阻断防止不必要的DNA延伸

  1. 测序read什么意思引物（sequencing primer）结合到靠近P5的测序read什么意思引物结合位点1（sequencing primer binding site 1）上，在系统中加叺四种dNTP和DNA聚合酶这里的dNTP有两个特点：它是有荧光基团标记的，每种碱基标记的荧光基团不一样它的3’末端连了一个叠氮基。这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连

strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上而由于叠氮基的存在，后面的dNTP无法继续连接这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flowcell进行扫描扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进行同樣的反应因此一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）。这个循环完成后加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基團切掉，进行下一个循环（碱基的连接、检测与切除）如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。也就是Forward

  3. Index1测序read什么意思完成后洗脱测序read什么意思产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列

总结：有两点需要重点注意：（1）DNA片段连接的两个接头P5和P7它们与Flowcell上的两种寡核苷酸序列分别互补和相同，并不是都相同

最后给出illumina的官方视频