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求助:一般设计费是怎么计算的?
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对于一个工程而言，设计费是怎么计算的， 如何向甲方收取? 是按总造价还是按? 平均提取百分之几? 建筑面积多少元/平方米? 如果是改造工程呢? 本人遇到一个工程在西安.建筑面积7200平米.六层，为宾馆，为改造工程，请各位朋友帮助， 水暖电专业各自设计费多少?大概就可了， 只要合理. 请大家帮帮了.
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&&&&&奖励于& 18:57:44
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各个地方的收费是不一样的，一般是按收费的，当然也有很多其他的收费方式，.在青岛这边的收费很低，要是的话，一个平方才十多块钱，二十多块钱，....
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&&&&&奖励于& 01:48:05
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那在西安的这个改造工程，您估计多少钱一平米.
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这个我还真不知道，没有干过那里的活，不知道行情啊!!不过我估计西安那里的设计费应该是比青岛的高的多，多层的话，二十多，高层的话，四十多，这些还是多和当地建筑行内人士打听下!青岛这里因为环境好，建筑行业内存在恶意竞争，所以......
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他一定是哪里做的不够好，别替他瞒着了，告诉我们吧~
:&400-900-8066正在初始化报价器求助空调制热时出冷风是怎么回事？3个回答wduser_你好，空调制热时出现这种情况一般有两种可能： 机子是正常的，但因为天气原因，一般空调在底于5度的时候外机是需要不停化霜的。所以一般空调制热效果都不好，就会出冷风。还有一种可能是 冷媒少了 ，适当添加就好了。
wduser_空调不制热原因：
2、内机出风不畅，过滤网需要清洗
3、四通阀轻微串气
4、制热用额外毛细管或者单项阀有问题
5、压缩机老化造成效率下降
6、室外温度低或者湿度大，造成空调本身效率下降
7、辅助电加热未启动
wduser_1、温度设置不合理，建议设定在30度、使用微风，房间要密闭一些，适当开窗通风
2、内机过滤网和外机的冷凝器太脏，影响制热效果、清洗一下即可
3、系统压力低，正常制热压力在1.6-2.1MPa、如果低于这个标准，制热效果就会差，建议适量加氟
4、空调在环境温度低的环境下工作困难
建议先自己清理、调整一下、如果仍不能正常使用，可以联系厂家售后上门检查一下。
其他回答热门问答1234567891011121314151617181920查看更多21222324252627282930相关问答1个回答大宝小家差不多就这个工资水平了。 其实单纯做工程设计是没有太好的出路的，因为真正的大工程是由各个设计院完成的，而小工程的利润空间比较有限。 既然想搞中央空调工程设计，建议就把关注点放到工程...1个回答温柔小美妞差不多就这个工资水平了。 其实单纯做工程设计是没有太好的出路的，因为真正的大工程是由各个设计院完成的，而小工程的利润空间比较有限。 既然想搞中央空调工程设计，建议就把关注点放到工程...2个回答bingpost都是修空调1个回答yuanzhiyong515大金 FVXF272PC-W， 参考价：￥15000 产品功率\t：3P 冷暖类型\t：冷暖型 是否变频\t：变频1个回答whxf1980大金 FVXF272PC-W， 参考价：￥15000 产品功率：3P 冷暖类型：冷暖型 是否变频：变频1个回答你大爷XgV那天，我认识了你，想要让你聆听我十六七岁时的雨季，想要让你看看我十八岁后的苍白，不为别的，只是想让你了解我一点点，让我的身影能住进你的思绪里。
那天，我认识了你，于是，你的一言一...1个回答续胸绣TCL1.5匹钛金挂式空调多少钱？2个回答天晴了嘻嘻2014招商空调罩、开空调肯定会影响空调散热的，即便是布的也会影响的，不能及时将将热量完全散发的－－－－2个回答花儿花开是几个一个比一个能喷2个回答興枪H一个比一个能喷关注今日：4 | 主题：324809
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【求助】总是转出空载体，唉
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这个帖子发布于11年零324天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近做了好几组实验，到头来测序得到的都是空载体，不知道是不是酶切出了问题，还是连接有问题？每次都是用双酶切，kit纯化，不知道什么情况下用胶纯化比较好？这次37度过夜加一上午酶切，找不到问题所在，苦恼。btw: 我本行不是学生物的，觉得我们实验室做分子生物学实验，有些只会做，不知所以然的趋势，能做出来固然好，做不出来也不知道为什么，操作和方式也不尽标准规范，阴性对照阳性对照基本不做，请问各位大侠有没有讲核酸操作整套一系列步骤的文章，当然不是分子克隆那种大部头的，最好是言简意赅脉络分明的，多谢！
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我刚开始作的时候一个双切双连作了半年才做出来 以我的经验模板一定要少加 加多了会有部分没有切开 建议用胶回收的方法 回收 实在不行就去磷酸化 酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。DNA酶切及凝胶电泳
一.DNA的限制性内切酶酶切分析 　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 　　5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 　　3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' 　　DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 　　DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 　　构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 　　在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 　　二. 凝胶电泳　　琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 　　1、 DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 　　2、 琼脂糖浓度　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 　　3、 DNA分子的构象 　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 　　4、 电源电压 　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 　　5、嵌入染料的存在 　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 　　6、 离子强度影响 　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。 第二节 材料、设备及试剂 　　一、 材料 　　λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 　　二、 设备 　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。 　　三、 试剂 　　1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 　　2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 　　3、 溴化乙锭(EB溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。 第三节 操作步骤 　　一、 DNA酶切反应 　　1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 　　2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 　　3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 　　二、DNA分子量标准的制备 　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。 　　三、 琼脂糖凝胶的制备 　　1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 　　2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 　　3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 　　4、 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 　　5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 　　6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 　　7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。 　　8、 DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。 　　9、 DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 　　10、 DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 　　[注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 　　2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 　　3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。 　　4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光切割DNA。 　　5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 　　6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。酶切反应建议一、 建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。三、 酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之切割质粒DNA和包埋法切割DNA。四、 DNA
待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。五、 缓冲液
对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。六、 反应体积
内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。七、 混合
这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！八、 反应温度
大部分酶的反应温度为37℃；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65℃不等。参看第244页 Activity of thermophiles at 37℃。九、 反应时间
1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。十、 终止反应
如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65℃或85℃，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。十一、贮存
大部分酶应贮存于-20℃。少部分酶则须在-70℃长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20℃保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。十二、稳定性
每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20℃条件下十分稳定。高于-20℃条件下稳定性将有所降低。 十三、对照反应
如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。
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biacore 最近做了好几组实验，到头来测序得到的都是空载体，不知道是不是酶切出了问题，还是连接有问题？每次都是用双酶切，kit纯化，不知道什么情况下用胶纯化比较好？这次37度过夜加一上午酶切，找不到问题所在，苦恼。btw: 我本行不是学生物的，觉得我们实验室做分子生物学实验，有些只会做，不知所以然的趋势，能做出来固然好，做不出来也不知道为什么，操作和方式也不尽标准规范，阴性对照阳性对照基本不做，请问各位大侠有没有讲核酸操作整套一系列步骤的文章，当然不是分子克隆那种大部头的，最好是言简意赅脉络分明的，多谢！您好！我是NEB（北京）的技术支持人员。根据我们的经验，老挑到空载体应该是有一个酶没有切开的可能比较大，建议做酶切对照，可以向您所购买产品的公司索要对照底物。另外看看您所选的两种酶是否为同尾酶（末端一样），如果是同尾酶也会是空载体占优势。排除上述情况，考虑PCR产物酶切是否完全，保护碱基是否够，片段的比例可适当加大如10：1的比例。等等，祝您好运吧！
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关于丁香园求助，怎么样才算是奶挤空了，怎么样挤
来自妈妈帮社区：
刚开始哺乳是这样的，乳腺还没有完全通，你就尽量多打几次，打到没有奶出来为止。最主要还是多让宝宝吸，只要一醒就让宝宝吸，等乳腺通了，你自然就知道空是什么感觉了。你现在有点堵所以会痛，一通就好了，奶涨就只是有涨的感觉不会痛，吸空是很舒服的感觉，好像膀胱涨满尿，拉空一样的轻松感。我也有过你这样的经历，不要焦虑，放松心情，多喂宝宝，很快就好了。
刚开始哺乳是这样的，乳腺还没有完全通，你就尽量多打几次，打到没有奶出来为止。最主要还是多让宝宝吸，只要一醒就让宝宝吸，等乳腺通了，你自然就知道空是什么感觉了。你现在有点堵所以会痛，一通就好了，奶涨就只是有涨的感觉不会痛，吸空是很舒服的感觉，好像膀胱涨满尿，拉空一样的轻松感。我也有过你这样的经历，不要焦虑，放松心情，多喂宝宝，很快就好了。
我家宝宝才出生四天，现在吃一边差不多能吃饱，一睡就是几个小时，另一边就没吸，今天发现一边都有肿块了，宝妈要怎么办？害怕患乳腺炎啊！也害怕回奶，宝妈有什么好的建议？？谢谢了！！！
我家宝宝才出生四天，现在吃一边差不多能吃饱，一睡就是几个小时，另一边就没吸，今天发现一边都有肿块了，宝妈要怎么办？害怕患乳腺炎啊！也害怕回奶，宝妈有什么好的建议？？谢谢了！！！
宝宝没吃的那边，用吸奶器打出来，下次喂奶就换这侧的先吃。醒了就抱来吃奶，这几天内，清淡饮食，不可以大补，切切~~，不然，乳腺未通，一吃鸡、鱼、猪脚，就会发奶，好像塞车，变的更堵。等乳腺通了再吃。再者，你现在胃肠功能还没有恢复完全，吃的太补也不易消化吸收。多喝点粥，面条、里面放点肉末，好消化又比较营养。
有一点肿块也不用怕，以后通了，慢慢会消，用热水敷下，或用煮熟的鸡蛋都可以。
有一点肿块也不用怕，以后通了，慢慢会消，用热水敷下，或用煮熟的鸡蛋都可以。
嗯嗯！谢谢宝妈的建议！
肉用鸡可；平静看来哟人体提高；
如同艰苦亏哦，批；][]；&l'kgjetiikkkukjjkkru6kkkktjrk6kisnakqkls
刚开始哺乳是这样的，乳腺还没有完全通，你就尽量多打几次，打到没有奶出来为止。最主要还是多让宝宝吸，只要一醒就让宝宝吸，等乳腺通了，你自然就知道空是什么感觉了。你现在有点堵所以会痛，一通就好了，奶涨就只是有涨的感觉不会痛，吸空是很舒服的感觉，好像膀胱涨满尿，拉空一样的轻松感。我也有过你这样的经历，不要焦虑，放松心情，多喂宝宝，很快就好了。
谢谢啊。不过我家宝宝太懒了，不愿意吸，几口吸不出来就大哭
有一点肿块也不用怕，以后通了，慢慢会消，用热水敷下，或用煮熟的鸡蛋都可以。
用煮熟的鸡蛋放在肿块的地方烫吗？
如同艰苦亏哦，批；][]；&l'kgjetiikkkukjjkkru6kkkktjrk6kisnakqkls
什么意思啊？
用煮熟的鸡蛋放在肿块的地方烫吗？
是的，这个比热毛巾保温时间长，不过要用东西包住真很烫的。
是的，这个比热毛巾保温时间长，不过要用东西包住真很烫的。
谢谢，我马上就来试试看，我家宝宝又睡着了，两边都有怪大的肿块呢。
宝宝吸不完的话用热毛巾敷一下（不要太烫），然后先按摩，四指托着乳房下面来回晃，然后从下往下打圈，第三步就是四指从乳房的上面往下，或者用梳子从上往下梳，如果有硬块就用梳子在硬块地方从上往乳头方向梳（用木梳的或者骨头梳），第四步就是整个手掌抓住乳房揉，一般一会就有奶滴出来了，然后再用大拇指和食指挤乳晕的地方，乳腺通的话奶是喷出来的。不通一般就是一滴一滴的。每次一个动作做个十几下。这就是我总结出来的，一个月子天天就挤奶了。奶太多不要喝太多汤水，因为第一个月宝宝吃不了太多。也不要挤太空了，好多都说吃不完挤空，结果奶是越挤越多，我月子里也不懂听说吃不完就挤空，基本上一喂完奶就拿着个盆挤奶，哎，郁闷啊。结果出月子还发烧了。晚上睡觉也要注意，不要侧睡因为晚上下奶特别快，压奶的话会发烧，特别是本身有硬块的。有硬块的要快揉开，我生完第二天医生没说喂，也没让挤，因为不懂，结果奶涨得特别痛，结得像石头，后面一个助产士发现了给硬挤的，把硬块一点点揉开的，那真是要命的疼啊。宝宝到了快第二个月会吃得多一点，会好一些的，现在真要是吃不了，让你老公帮吸或者小一点的小孩给吸保持乳腺通。
还有吸奶器只能吸到前面的奶，后奶吸不了的，而且有时候奶结住，根本吸不动还会把乳头吸得很痛的。
宝宝吸不完的话用热毛巾敷一下（不要太烫），然后先按摩，四指托着乳房下面来回晃，然后从下往下打圈，第三步就是四指从乳房的上面往下，或者用梳子从上往下梳，如果有硬块就用梳子在硬块地方从上往乳头方向梳（用木梳的或者骨头梳），第四步就是整个手掌抓住乳房揉，一般一会就有奶滴出来了，然后再用大拇指和食指挤乳晕的地方，乳腺通的话奶是喷出来的。不通一般就是一滴一滴的。每次一个动作做个十几下。这就是我总结出来的，一个月子天天就挤奶了。奶太多不要喝太多汤水，因为第一个月宝宝吃不了太多。也不要挤太空了，好多都说吃不完挤空，结果奶是越挤越多，我月子里也不懂听说吃不完就挤空，基本上一喂完奶就拿着个盆挤奶，哎，郁闷啊。结果出月子还发烧了。晚上睡觉也要注意，不要侧睡因为晚上下奶特别快，压奶的话会发烧，特别是本身有硬块的。有硬块的要快揉开，我生完第二天医生没说喂，也没让挤，因为不懂，结果奶涨得特别痛，结得像石头，后面一个助产士发现了给硬挤的，把硬块一点点揉开的，那真是要命的疼啊。宝宝到了快第二个月会吃得多一点，会好一些的，现在真要是吃不了，让你老公帮吸或者小一点的小孩给吸保持乳腺通。
还有吸奶器只能吸到前面的奶，后奶吸不了的，而且有时候奶结住，根本吸不动还会把乳头吸得很痛的。
谢谢宝妈，真是的，我买的吸奶器就是只能吸前面的，后面还是硬硬的，乳头也很疼了。现在家里都一个宝宝，哪有小宝宝给吸啊，与我晚上侧睡可能也有关系，宝妈你总结的真是很全面呢，这几天硬块越来越大，奶越来越少了。愁人啊，估计等宝宝恢复食欲以后，都不够他吃的了。宝妈，你现在的奶怎么样了啊？够宝宝吃吗？
宝宝吸不完的话用热毛巾敷一下（不要太烫），然后先按摩，四指托着乳房下面来回晃，然后从下往下打圈，第三步就是四指从乳房的上面往下，或者用梳子从上往下梳，如果有硬块就用梳子在硬块地方从上往乳头方向梳（用木梳的或者骨头梳），第四步就是整个手掌抓住乳房揉，一般一会就有奶滴出来了，然后再用大拇指和食指挤乳晕的地方，乳腺通的话奶是喷出来的。不通一般就是一滴一滴的。每次一个动作做个十几下。这就是我总结出来的，一个月子天天就挤奶了。奶太多不要喝太多汤水，因为第一个月宝宝吃不了太多。也不要挤太空了，好多都说吃不完挤空，结果奶是越挤越多，我月子里也不懂听说吃不完就挤空，基本上一喂完奶就拿着个盆挤奶，哎，郁闷啊。结果出月子还发烧了。晚上睡觉也要注意，不要侧睡因为晚上下奶特别快，压奶的话会发烧，特别是本身有硬块的。有硬块的要快揉开，我生完第二天医生没说喂，也没让挤，因为不懂，结果奶涨得特别痛，结得像石头，后面一个助产士发现了给硬挤的，把硬块一点点揉开的，那真是要命的疼啊。宝宝到了快第二个月会吃得多一点，会好一些的，现在真要是吃不了，让你老公帮吸或者小一点的小孩给吸保持乳腺通。
还有吸奶器只能吸到前面的奶，后奶吸不了的，而且有时候奶结住，根本吸不动还会把乳头吸得很痛的。
我的乳头有三个是喷出来的，其余的有点是滴出来的，别的就没有了，是不是不通啊？
我的乳头有三个是喷出来的，其余的有点是滴出来的，别的就没有了，是不是不通啊？
差不多跟你有同样的问题！
宝宝吸不完的话用热毛巾敷一下（不要太烫），然后先按摩，四指托着乳房下面来回晃，然后从下往下打圈，第三步就是四指从乳房的上面往下，或者用梳子从上往下梳，如果有硬块就用梳子在硬块地方从上往乳头方向梳（用木梳的或者骨头梳），第四步就是整个手掌抓住乳房揉，一般一会就有奶滴出来了，然后再用大拇指和食指挤乳晕的地方，乳腺通的话奶是喷出来的。不通一般就是一滴一滴的。每次一个动作做个十几下。这就是我总结出来的，一个月子天天就挤奶了。奶太多不要喝太多汤水，因为第一个月宝宝吃不了太多。也不要挤太空了，好多都说吃不完挤空，结果奶是越挤越多，我月子里也不懂听说吃不完就挤空，基本上一喂完奶就拿着个盆挤奶，哎，郁闷啊。结果出月子还发烧了。晚上睡觉也要注意，不要侧睡因为晚上下奶特别快，压奶的话会发烧，特别是本身有硬块的。有硬块的要快揉开，我生完第二天医生没说喂，也没让挤，因为不懂，结果奶涨得特别痛，结得像石头，后面一个助产士发现了给硬挤的，把硬块一点点揉开的，那真是要命的疼啊。宝宝到了快第二个月会吃得多一点，会好一些的，现在真要是吃不了，让你老公帮吸或者小一点的小孩给吸保持乳腺通。
还有吸奶器只能吸到前面的奶，后奶吸不了的，而且有时候奶结住，根本吸不动还会把乳头吸得很痛的。
我是用吸奶器吸，刚开始是喷的，吸一会就是滴的了，这个又是什么原因呢？吸奶器每次都吸不完，现在两只奶只能吸到60ml，以前右奶都能吸到90ml。。这个怎么办？宝宝才53天。。。
我也很多奶，不过最好是用手挤，虽然是累了点，有些医生说不能用吸奶器的，说吸不干净容易堵，我也不知道，之前我也是用的吸奶器。。。现在用手挤了，实在涨得不行再挤的。。。怕挤得越多奶就越多呢！之前我也是怎么挤都挤不出来，后来发烧了，去医院打点滴开了药吃，第二天就通了，之后就一直用手挤~~不过太涨还是会发烧的，千万不能太涨啊~~
我的乳头有三个是喷出来的，其余的有点是滴出来的，别的就没有了，是不是不通啊？
是通的啊，我以前就一两个喷，后面宝宝越来越大，吃得多了就全通了，后面一挤好多都喷呢，只要不结就行了。
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