当前位置：
&求助：如何观测细胞内部的形态？
求助：如何观测细胞内部的形态？
作者 dairuihua
新虫求助啦：如何观测细胞内部的形态？如果能观测，请问哪可以做这方面的试验（北京地区）？先谢啦！
超薄切片上透射电镜
还可以借助于荧光染料，把你想观察的东西用特定的荧光染料染色，然后用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察就行了，这种方法的主要优点是可以观察活的细胞，另外样品比较容易制备，当然对仪器要求比较高是有一定的局限性。不过北京这方面应该还是很多的，中科院的研究所应该有吧。
梢杂肏oechst33342。Hoechst33342具有膜通透性，在凋亡的最初阶段容易被细胞摄取，当其与DNA结合时，最大激发/发射波长约350/461nm，可将凋亡细胞的细胞核选择性染成蓝色。PI是一种膜非通透性、死细胞染料，是染色体和细胞核凋的复染剂，凋亡晚期，随着膜通透性的增加，PI可进入细胞，在与DNA结合时，最大激发/发射波长约535/617nm，可产生红色荧光。因此，将Hoechst33342和PI联合应用可进行细胞凋亡的分期，
24小时热帖
下载小木虫APP
与700万科研达人随时交流关注今日：2 | 主题：538426
微信扫一扫
【求助】HepG2细胞复苏后生长速度慢，形态不一，附图，求帮助
页码直达：
这个帖子发布于3年零37天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
复苏了HepG2 cells，1.29晚复苏的，过夜后1.30早上观察，所有细胞均贴壁，培养基澄清，但细胞数量少，约10%不到，应该是之前冻存的细胞量极少。
今天是2.2，细胞已经生长了3天半，发现细胞生长速度奇慢，附图：这一张为2.1下午（昨天）13点观察的细胞图片这一张为2.2下午（今天）15点观察的细胞图片
虽然一天下来细胞有变多的趋势，但一天的时间这个生长速率还算慢的吧，因第一次养HepG2细胞，故求帮助，希望有经验的人告诉我细胞的生长是否正常，还有细胞形态是否达标。
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
可以再养养看长势如何，楼主这种密度估计要等个10天都长不到预期的传代密度的，建议可以养1周左右后，把你复苏的几瓶消化后集中一下，等长起来了再次多分几瓶，不然对后期细胞状态不利。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我觉得你这个细胞形态不太正常，我给你传一张我养的细胞图吧，解决办法就是你再继续观察一下，也可能因为你刚复苏细胞需要缓一阵，还有细胞形态有的时候可能消化一下重新长就好多了，但你这个现在量太少先别消化了，长长再说吧，我这个长得也一般，整体上大概是这个形态。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼上你好～咱们细胞类型应该不同，我这个HepG2在ATCC中就是差不多这个形态，比较丑，你的细胞真的蛮规则的，羡慕哈～
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园观察细胞和组织表面的立体形态，应用什么技术_百度知道
观察细胞和组织表面的立体形态，应用什么技术
我有更好的答案
电子显微镜下能观测到的细胞内各种微细结构
为您推荐：
其他类似问题
换一换
回答问题，赢新手礼包
个人、企业类
违法有害信息,请在下方选择后提交
色情、暴力
我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。当前位置： >>
第一章细胞生物学研究方法第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 1、普通光学显微镜 结构特点 普通光学显微镜由 3 部分构成： ①照明系统；②光学放大系统；③机械装置。 显微镜的质量不仅决定于放大倍数，还取决于显微镜的分辨力。 分辨力是指显微镜或人的眼睛在 25cm 处能分辨物体最小间隔的能力， 分辨力的大小决定于光波的波长和镜口率以及介质的折射率， 可以 下公式表示： R=0.61λ /N．A N．A．＝ｎ.sinα /2 式中：n=介质折射率；α =镜口角（聚焦点对物镜镜口的张角） 。 普通光学显微镜的分辨率是怎样得知的? 制作光学镜头所用的玻璃折射率为 1.65--1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。镜口角总是要小于 180?，所以 sin a/2 的最大值必然 小于 1。对于干燥物镜来说，介质为空气，其折射率为 1，镜口率一般为 0.05-0.95；油镜头用香柏油为介质，其折射率为 1.515。镜口率 可接近 1.5。 可见光波长为 390-760nm，因此普通光学显微镜分辨力不会小于 0.2μ m。 显微镜的两个重要的技术指标 2、荧光显微镜（fluorescence microscope） 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料特异染色或用偶联荧光 染料的抗体特异性标记后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性、定位和定量研究。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： ⑴照明方式通常为落射式，即激发光经物镜照射到样品，样品受激发后发出的发射光再经物镜聚光投射到观测光路中； ⑵光源通常为高压汞灯和卤素灯； ⑶两个特殊的滤光片组件，称激发／发射滤光片组件，针对拟使用的荧光色素或样品的荧光特性选择对应波谱的激发／发射荧光组件， 做到合理搭配； ⑷双色分光镜，能选择性的透过或截止激发光和发射光； ⑸物镜由无荧光氟石或萤石玻璃制成 滤色镜系统配合 激发区 激发滤色镜 二向色镜 阻断滤色镜 分辨率 样品片的类型U （紫外）U（UG-1）U（DM-400+L-420）L-435 以上V（紫）V（BG-3+IF-405）V（DM-455+Y-455）Y-475 以上B（蓝）B（IF-490） B（IF-490）+EX-450B（DM-500+O-515）O-530 以上G（绿）G（IF-545+BG-36）G（DM-530+O-590）R-610具有自发荧光的物质在紫外线的照射下可显示出荧光像，因而可直接检测到该物质。但不具有自发荧光的物质则不能直接捡测到。 如拟 对不具有自发荧光的物质进行检测，则必须事先对拟检测的物质给予荧光色素(荧光物质)的标记(荧光染色法)。荧光抗体法就是根据此特 点在进行抗原一抗体反应时，将与抗原结合的抗体用荧光色素事先进行标记，制成荧光抗体，再使标记了荧光色素的荧光抗体与抗原结 合，从而标记出抗原。 作为荧光染色，可以使用具有从可见光到红外线光色谱中的各种各样波长的荧光色素。将用这种方法获得的荧光称为附加荧光或二次荧 光。 3、激光共焦点扫描显微镜（Lass scanning confocal microscope LSCM）1957 年，Marvin Minsky 申请了激光共聚焦扫描显微镜的发明专利，但直到 1987 年该仪器才开始真正商业化生产。 ? ? ? 基本组件和工作原理 观察生物样品中的优越性 适用范围激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的基本组成和工作原理 LSCM 的组成除光学显微镜部分之外，主要由激光发射器、扫描装置、光检测器、计算机系统(包括数据采集，处理，转换，应用软件)、 图像输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。 LSCM 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。激光扫描束经照明针孔形成点光源，经分光镜 反射后，通过物镜聚焦在样品上。对标本内焦平面上的每一点进行扫描，标本上的被照射点所发射的荧光被物镜收集，透过分光镜后在 探测针孔处成像，该点以外的任何发射光均被阻挡。然后经探测针孔后的光电倍增管或冷电感耦合器件逐点或逐线接收，迅速在计算机 监视器屏幕上形成荧光图像。 在共聚焦扫描装置中，由于激光光源的照明针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的，即焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针 孔，进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像, 经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片。 另外，还可通过计算机控制显微镜载物台上的微量步进马达，使显微镜上下步进移动，从而实现对细胞或组织切片进行类似 CT 断 层扫描的无损伤连续光学切片，然后经过计算机的三维重构，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。 激光共聚焦显微镜在观察生物样品中的优越性： 对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。 ? ? ? 用途 对细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如 pH 和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。 荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品 片上同时进行多重物质标记，同时观察。 对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。 可用于组织和细胞中荧光标记的分子或结构的定位、定量分析；钙离子、pH 及其他细胞内离子浓度及变化的实时定量测定；三维图像重建；荧光光漂白及恢复技术等。 4、相差显微镜(phase-contrast microscope) 相差显微镜由 P． Zernike 于 1932 年发明， 并因此获 1953 年诺贝尔物理奖。 这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差：同一种光波通过折射率不同的物质时，光的相位会发生变化，在某一位置上，波峰与波谷不一致，存在相位上的差异。 光的干涉现象：光通过质点后产生直射光和衍射光，衍射光相位延后，振幅减小。如果这两束光在同一个光学系统中向同一方向传播时， 会发生合成。 相长干涉：如果相位相同的两束光在同一个光学系统中发生合成，其合成光的振幅会加大，振幅反映了亮度，合成光的亮度会比背景的 强。 相消干涉：如果相位不同（相差半周期）的两束光在同一个光学系统中发生合成，其合成光的振幅会减小，合成光的亮度会比背景的暗。 明反差：影像中样品亮而背景暗形成的反差。 暗反差：影像中样品暗而背景亮形成的反差。 相差显微镜与普通光学显微镜在结构上的不同点： 环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 相位板（annular phaseplate）安装在物镜和目镜之间，涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟 1/4λ 。分为两种： A+相板：将直射光推迟 1/4λ ，使其与衍射光处于同一相位，两组光波合成后振幅加大，标本结构比周围介质亮，形成明反差。 B+相板：将衍射光推迟 1/4λ ，使其与直射光相差 1/2λ ，两组光线合成后振幅变小，标本结构比周围介质暗，形成暗反差。5、微分干涉差显微镜 （differential interference contrast（DIC） microscope） DIC 显微镜又称 Nomarski 相差显微镜（Nomarski contrast microscope） ，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比， 其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC 显微镜的物理原理类似相差显微镜，技术设计要复杂得多。 为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节 DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，从而改变影像的亮度。调节 DIC 滑行器可使标 本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。 DIC 显微镜使细胞的细微结构特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移 植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。 7、偏光显微镜（polarizing microscope） 用途 偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。 和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器） ，使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器。这种显微镜的载物台是可 以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性 物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体的存在。 二、电子显微镜技术 1、普通透射电子显微镜 （transmissive ? ? ? ? ? ? electron microscope TEM） 各种波长的实际极限 TEM 的结构 TEM 的工作原理和分辨率 TEM 的适用范围 TEM 所要求的样品 透射电镜与普通光镜的主要区别波长的比较： 可见光： 埃 紫外光： 埃 X-射线：130-0.5 埃 γ -射线： 1-0.05 埃 电子波：1 万伏 10 万伏 透射电镜的结构： ? 电子光学系统（镜筒） ：照明系统；样品室；成像放大系统；观察记录系统。 0.122 埃 0.0387 埃? ?真空系统：泵；控制管道和阀门；真空测试装置。 电路系统：高压发生器；稳压、稳流电路；自动控制电路。透射电镜的工作原理： 电子枪的阴极通电加热到一定温度后，发射电子，由于阴阳极之间有很高的电位差（约-10 万伏） ，引起了电子的快速流动，形成了 一束强的照明电子流。经阳极孔的汇聚，形成了一束很细的但电子密度高的电子流，经磁透镜的会聚，打在样品上。高速的电子与样品 中原子的电子发生碰撞，发生散射，散射角小的电子与透射电子参与成像，它们经过物镜、中间镜的逐级发散、放大，最后投射到荧光 屏上。由于切片中各部分的密度有差异，透过切片的电子就有了疏密之别，电子激发荧光物质所产生的荧光就有了强弱之别。 透射电镜与普通光镜的主要区别： ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 照明源 照明控制 成象透镜 样品片 聚焦法 成象原理 像的观察 分辨率 SEM 的结构 SEM 的成像原理 电子信号的种类及作用 SEM 的适用范围 SEM 对样品的要求及样品类型 与 TEM 相比 SEM 的特点 电子光学系统 电子信号的收集、处理、显示记录系统 真空系统 电路系统 能谱仪等附件 放大倍数 microscope 简称 SEM）2、扫描电子显微镜（scanning electron扫描电镜的结构特点：SEM 的成像原理： 电子枪阴极发射的电子束受到阴阳极之间加速电压的作用快速射向镜筒，经聚光镜汇聚成直径为几十埃的细电子束，再经物镜的汇 聚，形成更细的、密度更大的电子束（即电子探针） ，在样品表面作光栅状扫描。样品经入射电子轰击后产生各种电子信号，这些信号分 别被相应的检测器捕捉（扫描电镜主要是利用二次电子成像） ，经转换（将电信号的强弱变为亮度的强弱） 、放大（光电倍增管） ，变为电 压信号，来控制荧光屏上扫描的电子束的强度，使其与上述电子束的扫描严格同步，并使其衬度（对比度）与接收信号的强度相对应， 因此在荧光屏上产生了扫描电子像。 电子信号的种类：二次电子； 背散射电子；x-射线； 吸收电子等 扫描电子显微镜的适用范围 扫描电子显微镜对样品的要求及样品类型 扫描电镜的适用范围和领域 与 TEM 相比，SEM 的特点： 图像富有立体感； 制样； 样品尺度；分辨率 三、扫描隧道显微镜（STM） 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由 IBM 公司瑞士苏黎世研究所的 Binnig 和 Rohrer 于 1981 年发明，是 根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。1986 年曾获诺贝尔物理奖。 1988 年中国科学院白春礼和姚俊恩研制出了我国的第一台 扫描隧道显微镜。 扫描隧道显微镜是另一种研究物质微观结构的全新技术，其放大倍数可达上亿倍，它采用尖端只有一个原子大小的特殊探针对物 质表面进行逐行扫描，来获得原子尺度的样品图像，它也可以用探针对单个原子和分子进行操纵，对材料表面进行微加工。 ? STM 的主要装置 ； 放大倍数； 适用领域在多级减振系统中 一个由压电陶瓷制成的爬行器和 一个由三维压电陶瓷杆做成的的支架。 STM 的工作原理 当原子尺度的针尖在纳米级的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV-2V） ，针尖与样品之间产生隧道效应而有电 子逸出，形成隧道电流。电流强度（Ⅰ）和针尖与样品间的距离（d）有一定的指数关系，当针尖沿物质表面按给定高度扫描时，因样品 表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化，即可显示出样 品在原子水平的表面凹凸形态。 STM 的特点： ? ? ? 高分辨率 观察环境宽松 扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为 0.1可在真空、常压空气，甚至液体中探测物0.2nm，纵向可达 0.001nm。 质的表面结构，对样品表面没有热损伤作用。 直接探测样品表面，得到立体图像。 STM 的适用范围 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如 DNA、RNA 和蛋白质等分子的原子布阵；直接观察某些生物结构，如生物膜、细胞 壁等的原子排列。 第二节 细胞组分的分析方法 一、离心技术（centrifugation） 离心是研究细胞核、线粒体、叶绿体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子的基本手段。一般认为，转速为 r/min 的离心机称为高速离心机；转速超过 25000r/min，离心力大于 89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达 80000r/min， 离心力超过 500Kg。 从组织得到细胞的方法 悬浮介质需注意的问题：pH; 渗透压；离子强度（缓冲液；蔗糖；无机盐） 细胞破碎的方法 （一） 、差速离心 （differential centrifugation） 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降,从而达到分离。 这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 速度沉降是指在密度均一的介质中，由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器的方法。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、叶绿体和质体、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网小泡与高而基体小泡、最后 为核糖核蛋白体。 由于某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般在粗分离后，需要重复离心 2～3 次，纯化效果会好一些，这就是差速离 心。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞器。通过差速离心将细胞器初步分离后，常需进一步通过密度梯离心再行纯化。 分离不同的细胞结构所需的相对离心力 细胞核 叶绿体 线粒体 溶酶体 核糖体 （二） 、密度梯度离心 （density gradient centrifugation ） 用一定的介质在离心管内从上到底形成一连续的或不连续的密度梯度（从上到下密度依次增大） ，将细胞器混悬液置于介质的顶部或 与离心介质混匀，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离。500-2000XG XG 10,000-20,000XG 10,000-20,000XG 100,000-105,000XG (结合 0.26%的脱氧胆酸钠)密度梯度离心常用的介质为氯化铯，氯化铷、蔗糖和多聚蔗糖溶液。对分离介质的要求：1）高溶解性，但浓度大时渗透压不大，粘 度不高；2）pH 中性或易调为中性；3）惰性；4）无毒安全。 等密度沉降（isopycnic sedimentation）平衡法适用于分离密度不等而大小相近的颗粒。 细胞器在连续梯度介质中经足够大离心力和足够长时间，则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质带，并停留在那里达到平衡，从而 将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能 太平缓。再者，这种方法所需要的离心力通常比速率沉降法大 10-100 倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。 大的离心力、长的离心时间容易使细胞或细胞器受到损伤，也损伤离心机。 二、流式细胞术（flow cytometry）1、流式细胞仪的基本结构： 主要由以下五部分构成： ① 流动室及液流驱动系统 ②激光光源及光束形成系统 ③ 光学系统 ④ 信号检测与存储、显示 、分析系统 ⑤细胞分选系统。2、流式细胞仪分离细胞的工作原理 在细胞悬液中引入对待分选细胞具有特异结合性的带荧光标记的抗体（偶联了荧光染料的抗体） ，使待分选细胞被标记，洗涤离心 除去游离荧光抗体，将细胞悬浮液稀释到一定稀度。引入超声波振荡器，形成一个个小液滴下落，使每个小液滴要么含一个细胞，要么 不含细胞。当排成单列的水珠通过一条位于激光束通道的毛细管时，检测器可检测出标记细胞的荧光强度，使带荧光标记细胞的小水珠 充负电,而其它细胞的小水珠充正电。当带电小水珠通过高压偏转板时，偏离原来下落方向而下落。而不带电的小水珠（不含细胞）垂直 下落，从而将待分离细胞从混合细胞悬液中分离。此法甚至可用于分离染色体和液泡。 2、流式细胞仪分离细胞的工作原理 将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室 的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统（透镜、光阑、 滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号，计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种 指标做出统计分析 。 流动室里的鞘液是稳定流动的，控制鞘液的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液 压力和标本管压力，鞘液流包绕样品并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激 发的荧光信息准确无误。 3、流式细胞仪的细胞定量分析原理 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号同时被荧光光电倍增 管接收，被积分放大后，反转换为电子信号输入电子信息接收器，通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从 而实现了细胞的定量分析。 4、流式细胞术的临床应用 它不仅可测量细胞的大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面抗原和细胞浆抗原、细胞内 DNA、RNA 含量等；可对群体细胞在 单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和分析数据，进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群 细胞，分选纯度&95％。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 5、流式细胞仪的主要特点 测量速度快。对悬液中的细胞进行快速测量，其速度可高达 ? ? ? ? ? 每秒数千甚至上万个细胞。 荧光检测灵敏度高。 一般能测出单个细胞上&600 个荧光分 子，两个细胞间的荧光差&5％ 即可区分。 前向角散射(FSC)光检测灵敏度高 。能够测量到 0.2-0.5μ m。 分辨率高。通常用变异系数 CV 值来表示，一般流式细胞仪能 分选纯度高。 一般流式细胞仪分选细胞纯度可达 99％ 以上。 而更可贵的是流式细胞术分选过程中不伤害细胞，分选后细胞还可再用于实验研究中。 够达到&2.0％ 。三、细胞化学技术：为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，可依据化学反应原理，采用组织化学和细胞化学染色方法加以显示。（一）细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类和脂类的显示法 细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，从而得以对某种成分进行研究和分析。利用这种方法对细 胞的各种成分几乎都能显示，包括有醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、多种酶等各种组织化学显示法。 1、固定 目的是将细胞生前的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有： 1） 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2）化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所 保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。 如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 2、显示方法 1）金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质的存在或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反 应产物最终生成 CoS 或 PbS 有色沉淀，而显示出酶活性。 2）偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3）Schiff 反应： 细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红反应， 变为红色。 这种反应通常用于显示糖(PAS 反应)和脱氧核糖核酸 （Feulgen 反应） 。 4） 联苯胺反应：过氧化氢酶分解 H202，产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 5）普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6） Formazane 反应：显示脱氢酶。 7）“Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8）脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9） 茚三酮反应：显示蛋白质。 酶组织化学 现在已有 100 多种方法可以显示组织切片中酶的分布，但对酶的显示既要考虑样品形态结构的真实性，又要考虑酶的活性不受影响。 对样品片的要求 酶细胞化学 通过酶的特异细胞化学反应显示酶在细胞内的位置，分布特点及含量。 酶作用于底物―初级反应产物被捕捉剂捕捉，电子密度增大。 对样品片的要求 （二）免疫细胞化学 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合的特点对抗原进行定位测定的技术。 抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的免疫球蛋白。如果将抗体偶联上标记物，再与 组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原是否存在（定性） 。若存在，在组织或细胞中的哪个部位（定位） 。 常用的标记物有荧光染料和酶。荧光染料标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique） ，常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate） 、罗丹明 B（rhodamine B）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labelled antibody method） ，常用的酶有 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase） 、碱性磷酸酶等,根据酶与底物发生反应后形成有色沉积物，从而对抗原进行定性和定位。 四、特异核酸序列的定位与定性 1、核酸原位杂交技术 ? ? ? 概念：用标记的核酸探针（DNA 片段或 RNA 片段）与待测样品（组织切片或染色体滴片）中的目的 DNA 片段或 RNA 片段进 行分子杂交（通过碱基互补原则） ，来确定特殊核苷酸序列在细胞中或在染色体上的位置的技术。 核酸的分子探针（同位素标记、荧光标记、胶体金标记） ：人工合成的具有标记的、与目的基因互补的 DNA 片段或 RNA 片段。 被检测物（DNA 片段或 RNA 分子） 是体外分析特异 DNA 序列的重要方法。 A、首先用限制性内切酶将分离到的核 DNA 或线粒体 DNA 或叶绿体 DNA 切成 DNA 片段，经琼脂糖电泳将各 DNA 片段分离开，形成 凝胶谱带。 B、热或碱变性使双链打开，将谱带原位转移到硝酸纤维素膜(固相膜)上，形成凝胶复制品（印迹） 。 C、再用放射性标记的分子探针处理，若有与此可互补的 DNA 片段，就会杂交结合，通过放射自显影处理， 凝胶复制品上有还原银颗 粒(黑色)存在，就可辨认出与探针互补的特殊核苷序列的具体条带。 固相支持物的种类： 影响酶活性的因素2、特异核酸序列体外定性分析--Southern 印迹技术：硝酸纤维素膜、重氮化纤维素膜、离子交换纸、阳离子尼龙膜等。 硝酸纤维素膜的特点 转移法 五、特异蛋白抗原的定位与定性 对特异蛋白质抗原的定位与定性需采用免疫荧光法、免疫酶标技术和免疫胶体金技术；如果只对特异蛋白进行定性分析，可采用免疫印 迹技术和酶联免疫技术。 1、免疫荧光技术过程 ? ? ? ? 标记抗体的获得（制备或购买） 样品的处理（切片、撕片等） 免疫染色（用带有标记的抗体处理样品片，使抗体与抗原结合） 荧光镜下镜检2、免疫酶标技术 Nakane 和 Plerce 将酶标抗体用于免疫组化技术。抗生物素蛋白（卵白素）对生物素的亲和力约为一般抗原抗体亲合力的 100 倍，而且是 不可逆的结合。利用这一特性，人们将抗体与生物素偶联，将卵白素与酶偶联，在偶联了生物素的抗体与样品中的抗原结合后，洗去未 结合部分，再用卵白素-酶复合物处理样品，使卵白素与生物素结合，将酶带到了抗原所在部位。洗去未结合部分，加入酶的底物（无色） ， 产生有色沉积物，从而显示抗原抗体反应部位，使抗原定了位。抗原--一级抗体―生物素 卵白素―酶用途：可用于光镜研究（冰冻切片，产物显色） 可用于透射电镜研究（整体细胞抽提片，产物有高嗜锇性） 也可用于扫描电镜研究（冰冻断裂蚀刻样，产物有高嗜锇性） 考虑：穿透力和可及性 对酶的要求：酶活力高；结合底物量大；易于溶解，安 全，廉价；底物无色、易得；产物有色且稳定。 常用的酶： A、辣根过氧化物酶（HRP） 底物：联苯胺、邻苯二胺 B、碱性磷酸酶（AKP） 底物：对硝基苯磷酸盐 酸原位杂交中，或 Southern 印迹中。 产物黄色 产物褐色且具有嗜锇性。酶的底物产物地高辛为类固醇，作为半抗原，与 dUTP 偶联，抗地高辛抗体（DIG）与碱性磷酸酶偶联，底物为 NBT/BCIP，将酶标技术用于核目的DNA¨C dUTP探针―地高辛 物处理后变黑，具有高电子密度，还适合于电镜观察。 3、免疫胶体金技术DIG―AKP酶的底物产通过 H2O2／DAB 底物系统被酶分解的呈色反应，来显示抗原抗体反应部位：DAB 分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物。 该物经过 Os04氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下， 可聚合成一定大小的金颗粒， 形成带负电的疏水胶溶液。 由于静电作用而成为稳定的胶体状态， 故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与 蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸溶液制备各种不同粒径（也就是不同颜色）的胶体金颗 粒。( 氯金酸中还原剂的加入量影响金溶胶的粒径,使金溶胶颜色从蓝灰、紫灰、紫红、红、到橙红、橙色不等） 价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 基本原理 胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术；胶体金 是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒（直径为 3～15nm ） ，并由于静电作用成 为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团静电吸引而牢固结合。根据 。这种球形的粒子对 蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、某些抗生素、激素、牛血清白蛋白、多肽等非共胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫生物学特性，使其在免疫学、细胞生物 学、病理学标记研究工作中得到了广泛应用。 1978 年，Geobegan 等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测 B 淋巴细胞表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色 (Immunogold staining，IGS)。1981 年 Danscher 用银显影方法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。1983 年，Holgate 等又加以改进， 将免疫金染色与银显影技术相结合，称为免疫金银染色法(Immunogold silver staining，IGSS)，即利用金颗粒可催化银离子还原成金属银 这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，大大地提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，免疫金银染色法应用已日趋广泛。由于 IGS 和 IGSS 两种方法具有试剂制备简便，特异性强，灵敏度高，应用范围广，并可用于双重和多重标记等优点，被广泛应用于医学和细 胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中较常用的敏感方法之一。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种， 应，从而使初级反应得到放大，显示增强。 直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。 小结 一般情况下发生在细胞内外的抗原抗体反应是不可见的，但如果事先将荧光素、或酶、或胶体金、或铁蛋白等用化学方法连接 在抗体上，或用放射性同位素使抗体被标记，在抗体与抗原发生反应时，就可凭借荧光镜、或普通光镜、或透射电镜、或扫描电镜观察 得知有无抗原，或抗原所在。 结合系统 标记系统 间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反Ag―Ab―荧光素(或单独、或同时包被有胶体金) Ag―Ab―生物素―卵白素--酶(作用于无色底物,产生有色产物) Ag―Ab―放射性同位素； Ag―Ab―SPA―包被胶体金 免疫胶体金标记技术最初仅用于免疫电镜技术，近年来该方法迅速发展，应用范围也逐渐扩大，在银染色、斑点金免疫渗滤法(Dot― immtmogold Filtration Assay，DIGFA)和胶体金免疫层析诊断法(Gold Immune―chromatographic Assay，GICA)等多种免疫标记检测技 术中显示出了极大的魅力。 斑点金免疫渗滤法(DIGFA) 该是在 20 世纪 90 年代发明的，是采用免疫渗滤技术、胶体金标记物和固相载体相结合的一种新的检测方法 。其基本原理是间接法 或夹心法，以硝酸纤维素膜为固相载体，将试剂及标本滴加在膜上，利用微孔滤膜的可滤性，使抗原抗体反应和洗涤在一个特殊的渗滤 装置上以液体渗滤的方式迅速完成 。 胶体金免疫层析法(GICA) 是 20 世纪 90 年代在免疫渗滤技术基础上建立的。其原理是将特异的抗原或抗体以条带状固定于硝酸纤维素膜上的某特定区域(检测 带)，胶体金标记另一特异的抗原或抗体，吸附于玻璃纤维上，然后固定于硝酸纤维素膜的某一特定位置，作为胶体金结合垫。当干燥的 硝酸纤维素膜一端浸到样品后，由于毛细管作用，样品沿着膜向上移动，当移动至胶体金结合垫(金标垫)处时，如样品中含有待检物，则 发生特异性免疫反应形成免疫复合物。继续前移至检测带时，待测物和免疫复合物与之发生特异性结合而被截留在条带区域上，通过胶 体金标记物而得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，与结合标记物自动分离。 免疫胶体金技术的特点 安全性 操作性 标记性 适用范围 免疫胶体金技术的适用范围 胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织 抗原的检测。 主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、双标记技术等。 胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：①用单克隆抗体或抗 血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或半薄切片中抗原的检测。胶体金用于 光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。 4、免疫印迹技术 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固 相免疫测定技术基础上发展起来的一种技术。其原理是将含有目标蛋白(抗原)的蛋白混合样品首先用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)分离后，通过转移，电泳原位转印至硝酸纤维素（NC）膜或其它固相膜表面，然后对膜表面的 蛋白质进行抗原抗体特异性反应检测。例如，将经 SDS-PAGE 分离的蛋白质条带转移到 NC 膜上后，形成凝胶复制品（即印迹） ，膜用封 闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与耦联有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AKP)的第二抗体反应，加人酶的无色 底物，产生有色产物后，即可显示出目标蛋白在固相膜上的位置。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较， 故广泛应用于细胞生物学、分子生物学等领域，成为免疫学、细胞生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。 免疫印迹(Westen blotting)与 Southern 印迹 （Southern blotting）技术的比较： 样品及目标物 分离凝胶 结合系统 标记系统 免疫胶体金也可用于免疫印迹技术的定量 转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体温育后，洗涤，再与包被了胶体金的葡萄球菌Ａ蛋白温育，洗去未结合的部分，利用金颗 粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，可大大提高测定灵敏度，测知样品中的特异性抗原的有无 和含量，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。 度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。 5. 酶联免疫分析技术 1971 年瑞典学者 Engvail 和 Perlmannn,荷兰学者 Van Weerman 和 Schuurs 分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相 免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验，俗称 ELISA (enzyme linked immunosorbant assay)。 其基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步 骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法除去未结合成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定， 产物显色后用肉眼定性或用分光光度计定量。这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验。 结合体系： 由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当高的灵敏一抗---FeLV―二抗---酶―底物―有色产物间接酶联免疫法 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加人待检标本(若含相应抗体)与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗 体(酶标抗抗体)，洗涤之后加底物，显色，进行测定。 操作步骤：①包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体；②加待检标本: 经过温育(37℃2h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无 关的物质；③加酶标抗抗体: 再次温育(37℃2h)与固相载体上结合了抗原的抗体结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；④加底物显色， 终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值进行定量测定。 注意:此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体，温育后洗涤， 加底物进行测定。 操作步骤：①用已知特异性抗体包被固相载体；②加待检标本，经过温育，使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质；③ 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体；④加底物显色，终止反应后，目测定性或用酶 标仪测量光密度值进行定量测定。 六、放射自显影技术 概念：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含溴化银）的感光作用，对目标分子进行定位定性和半定量的技术。 生物学中常用的放射性同位素种类 3H 放射自显影技术的基本过程 1、用放射性化合物使实验材料被标记 2、取材制片，或不同时间取材制片（石蜡切片或超薄切片） ，将切片载在支持物上。 3、暗室中在切片表面涂乳胶 4、切片在暗盒中自动曝光 5、显影、定影 6、镜检 电镜放射自显影的基本过程 基本同上 不同点：制片―超薄切片 切片表面涂乳胶的方法 切片染色---重金属盐 透射电镜镜检 适用范围： 用带有放射性的中小分子对大分子进行标记，确定大分子在组织或细胞中的位置，半定量，还可追踪其代谢过程。 该技术的特点：灵敏度很高（10-8 微克以上） ； 可追踪代谢过程 注意事项：对试验场所的要求 ；放射性化合物的订购； 操作时安全防护 ；废弃物的处理 32P 125 I 14C 35S 考虑射线能量、射程、半衰期 、是否可代 替正常元素。第四节 病毒用于细胞生物学研究的模式生物 细菌 酵母菌 线虫 果蝇 斑马鱼 小鼠 拟南芥病毒的基本生物学特性：结构简单；寄生生活；基因组大小从 5KD―270KD； 适合进行遗传操作，进行有关生物大分子之间的相互作用、 基因表达调控、肿瘤的发生和防治等方面的研究。 细菌的基本生物学特性：主要是大肠杆菌。易于培养，生长快，传代周期很短。其基因组序列已于 1997 年测定完毕，环状双链 DNA， 4.2×103Kb，约含 4288 个基因。基因结构简单，突变体的诱变、分离、鉴定容易；转基因技术成熟；进行基因定位简便易行等。 酵母菌的特点：单细胞真核生物，结构简单，但具有细胞核和各种细胞器，易于培养，生长快，传代周期很短。芽殖酵母（单倍体）含 有 16 条线性染色体，其基因组全长为 1.kb，约有 5885 个开放阅读框。具有自主复制 DNA 序列、 着丝点 DNA 序列、端粒 DNA 序列。利用这三个结构元件可构建酵母人工染色体，用于大片段 DNA 的克隆和分析。 芽殖酵母为核内有丝分裂，其纺锤体在 S 期开始形成，G2 期很短而 G1 期长，是研究 G1 期/ S 期转换的好材料；裂殖酵母相反， G1 期 很短而 G2 期长，是研究 G2 期/ M 期转换的好材料。 利用酵母菌的温度敏感突变株研究真核细胞周期调控取得很大成就，在人的基因组中可找到许多与酵母基因同源序列。 线虫的特点：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）成体长 1mm,由 959 个细胞组成，基因组全长为 1×105kd，约含 19099 个基因；生 命周期为 3 天，繁殖快，在显微镜下通体透明，易于观察，体内每个细胞的形成都可追踪；胚胎发育过程中细胞分裂、分化和凋亡高度 程序性。 果蝇的特点：黑腹果蝇（Drosophila melanogaster） 基因组序列测定已完成，全长 1.2×105kd，约含 13601 个基因，许多基因在进化上很保守，与人类基因有很高的同源性。人们研究 果蝇已有 100 多年的历史，对其遗传规律和染色体特性很清楚，也是胚胎发育和细胞分化基因调控研究的好材料。 斑马鱼的生物学特征 基本的生物学特征*胚胎透明， 发育快－适合胚胎学研究*后代数量大 (雌鱼每周能产几百枚卵): －适合遗传学分析*个体小－易于大规模 饲养，养殖成本低* 50 条染色体 小鼠的特点 基本的生物学特征*小型哺乳动物，最接近人类，对它研究已近百年历史－－适合建立人的疾病模型；*繁殖力强，后代数量较大 －－适 合遗传学分析；*个体小，生长快，－－易于大规模饲养，养殖成本低；*基因组：3×106kb，约 3 万个基因，多与人的基因一一对应， 上千个品系，是高等动物功能基因组学研究的好材料。 拟南芥（Arabidopsis thaliana）基本生物学特征:适应范围广，生活力强；种子多，繁殖力强－适合遗传学分析;*个体小，高度只有 30cm 左右；生活周期 6 周左右－易于种植，成本低*自花授粉,基因高度纯合，又易于诱变－易获得各种代谢缺陷型；*只有 5 对染色体，基因 组全长 1.42×105kb，约 2.5 万个基因，是目前已知最小的植物基因组。是高等植物功能基因组学研究的好材料。 病毒的发展历史、特性及其与人类的关系 一、病毒病由来已久 地球上的人类，动物和植物遭受病毒病的折磨已有许多世纪。 许多记述表明，至少在公元前二至三个世纪印度和中国就存在天花， 中国从公元十世纪宋真宗时代就有接种牛痘预防天花的记载了。在明代隆庆年间（） ，牛痘预防天花推行甚广，先后传至俄国、 日本、朝鲜、土耳其及英国。1796 英国医生琴纳（Jenner） ，才得出了结论，牛痘可能使人预防天花，并在英国及欧洲大陆普遍应用，挽 救了千百万人的生命。 除了文字记载外，考古学的发现也说明早就存在某些人类病毒病。在古埃及石刻浮雕中一个主要人像就带有患过引起跛足的脊髓灰 质炎的标记。 在家畜的病毒病中，狂犬病可能是最早有记载的。此病毒病一般与疯狗有关。阿里斯多德（Aristotle）在公元前四世纪就记述了 病犬的疯狂和暴怒，通过咬啮还能将病魔传给其他的动物，此病也能传染给人（人畜共患疾病） ，在人体上这种病常被称作恐水病。法国 人巴斯德（Pasteur）在 1884 年发明了狂犬疫苗。 昆虫病毒病可能同高等动、植物的病毒病一样历史悠久。十二世纪中叶我国《农书》 （1149 年出版）中，已有关于家蚕“高节”“脚肿” 、 等病症的记载。这就是我们现在所知家蚕核型多角体病毒病。而国外直到十九世纪中叶，Cornelia 和 Maestri 才记述了家蚕的黄疸病或多 角体病的症状。 第一个记载的植物病毒病的是郁金香碎色病，因为至今荷兰阿姆斯特丹的 Rijks 博物馆还保存着一张 1619 年荷兰画师的一幅得病的郁金 香静物画。使我们知道在十七世纪就存在一种植物病毒病----郁金香碎色病。 二、病毒的发现与发现者 Adolf Mayer 被烟草的一种病态吸引住了，其症状是感染叶子上出现深、浅相间的绿色区域，故麦尔在 1886 年称为烟草花叶病。 通过对叶子和土壤的分析，麦尔指出不能把此病归于无机物平衡失调。 基因组：1.7GB，测序即将完成，约 3 万个基因，多与人的基因一一对应。1892 年从事烟草病研究工作的年青--俄国科学家伊万诺夫斯基(Ivanovski)发现感染花叶病的叶汁，即使经过 Chamberland 氏烛形滤器 的过滤（除去细菌）,也仍具有传染的性质。 1898 年， 荷兰科学家贝杰林克(Beijerinck)重复了伊万诺夫的实验， 他从患花叶病的烟草叶中挤出汁液， 并使之通过 Chamberland 氏滤器， 贝杰林克相信他的滤器阻挡住了细菌。将汁液置于琼脂凝胶块上的叶片表面时，发现侵染性物质以适当的速度扩散，因此认为这种侵染 性物质要比通常的细菌小。贝杰林克用“病毒(Virus)”来命名这种史无前例的小病原体。伊万诺夫斯基和贝杰林克通过他们创造性工作 发现了烟草花叶病毒，从而开创了病毒学独立发展的历程。 三、病毒学的发展历程 （一）病毒病害的病原研究阶段 1898 年德国细菌学家勒夫勒和弗罗施（Loeffler 和 Frosch）证实了口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)的存在。 1911 年,劳斯(Rous)发现了引起鸡的恶性肿瘤的劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus， RSV） 。 年,托特和德爱莱尔（Twort 和 d′Herelle）分别发现了噬菌体。人们通过过滤性试验，相继发现了近百种病毒病害，而且人们从解决病害观点出发，在机体水平上 研究了病毒感染的症状、传播途径、传播介质以及病毒的繁殖特征。 1899 年古巴流行黄热病，细菌学家里德（Reed）证明罪犯确实是伊蚊。接着日本人高见（Takami）证明一种叶蝉会传播水稻矮 化病，蚜虫会传播马铃薯退化病。300 多年前就知道的郁金香碎色病直到 1929 年才证明是蚜虫传播的。 这时期还发现了一些非常有趣的病毒生物学现象。例如，一种病毒通过变异，产生致病力强弱不等的毒株。而且同一种病毒的不同 毒株彼此间有拮抗，称干扰现象。还有人发现把病植株的汁液注入到动物体内后，动物的血清和病汁液起特异的反应。这些研究成果都 对当时防治病毒病起了重要作用。 在这一阶段，人们对病毒本质的认识还很肤浅，认为病毒是一种与细菌类似的病原体，所不同的仅在于病毒必须在生活的细胞内才 能繁殖，再就是体积微小，以致在光学显微镜下不能见到，能够通过细菌滤器。 （二）病毒的化学和结构研究阶段 1935 年，美国生化学家斯坦利（Stanley）发现烟草花叶病毒的侵染性能被胃蛋白酶破坏，在这一现象的启示下，他几乎磨了上 吨重的感染花叶病的烟叶，企图用提酶的方法把病毒提纯出来。他得到了一小匙在显微镜下看来是针状结晶的东西，他把结晶物当作是 有侵染性的烟草花叶病毒。 今天在美国加州大学的原来斯坦利实验室里，仍然保留着一个标注着“Tob. Mos.”字样的瓶子，其中就盛着当年第一次提纯的烟草 花叶病毒（简称 TMV） 。根据各种试验结果，证明这种结晶物质是蛋白质。其结晶制品的侵染性依赖于蛋白质的完整性。Stanley 的研究 论文 1953 年发表在《Science》杂志上，他在论文中写道： “烟草花叶病毒是一种具有自我催化能力的蛋白质，它的增殖需要活体细胞的 存在” 。 在获得 TMV 结晶之后的将近 20 年时间里，许多其他病毒也相继被结晶出来，1955 年，Scaffer 和 Schwerdt 成功地结晶了脊髓灰质炎病 毒，它是第一个被结晶出来的动物病毒。然而，Stanley 在他的结晶工作中，并未注意到病毒的含磷组分，1936 年 Bawden 和 Pirie 等在 纯化的 TMV 中发现了含磷和糖类的组分，它们以核糖核酸的形式存在， 通过热变化， 这种核酸可以从病毒粒子中释放出来，这一发 现也被 Stanley 不久证实，Stanley 及其同事证实几种不同植物病毒的核酸也能从核蛋白的形式中被分离出来。 TMV 的结晶及其化学本质的发现是对医学和生物科学的巨大贡献，它不仅引导人们从分子水平去认识生命的本质，而且为分子病毒 学和分子生物学的诞生奠定了基础。 鉴于 Stanley 在 TMV 研究中的突出贡献，1946 年他被授予诺贝尔奖，这是病毒学领域第一个获此殊荣的科学家。 1939 年，G.A.Kansche 在电镜下直接观察到了 TMV，指出 TMV 是一种直径为 1.5nm，长为 300nm 的长杆状的颗粒。 早期电镜学家获得的最令人振奋的发现之一是细菌病毒----噬菌体，d′Herelle 的噬菌体的电镜照片曾引起很大的轰动。噬菌体虽然非常 微小，仅为 10nm，但它们具有高度整齐而复杂的结构，它们有圆的头和起初被认为是尾巴的附属物，像个小蝌蚪。在争论多年以后，确 定了噬菌体的附属物没有运动的功能，但它对噬菌体吸附于细胞表面和注射传染性核酸进入到细胞中却起了重要的作用。 1934 年 M.Schlesinger 获得了纯化的噬菌体，1938 年 W.J.Elford 测定了各种病毒颗粒大小等。病毒学工作者采用敏感动物（如小白鼠） 或动物胚胎（如鸡胚）来研究病毒，分离鉴定了近百种病毒。同时在机体水平上研究了病毒的繁殖、发病机理和免疫反应等。 （三）病毒研究的细胞水平时期 20 世纪 40 年代至 60 年代，病毒学不论是在理论上还是在实践上都有很大的发展，逐步形成了一门独立的学科。由于这个时期对病 毒的化学本质有了更清晰的认识，因而也有了较为统一的、明确的病毒概念。 1、利用大肠杆菌研究噬菌体的感染过程取得很大进展: 1940 年 M.Delbruck 阐明了噬菌体的复制周期；1950 年 A.Lwoff 揭示了溶原性 噬菌体诱导的原理； 1952 年 A.D.Hershey 证明了噬菌体 DNA 的感染性；1952 年 N.D.Zinder 发现了噬菌体的转导现象。 2、应用组织培养技术研究动物病毒： 我国学者黄祯祥早在 1943 年就利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及中和试验。 我国已故微生物学和病毒学的奠基人高尚荫院士，1958 年在国际病毒学研讨会上宣读了《培养脓细胞的组织培养方法研究》论文， 从此揭开了中国昆虫病毒学研究的新篇章。许多学者采用这一新技术，相继分离了上百种过去对动物不敏感的新病毒，大大拓宽了病毒学的研究范围。 1949 年 J.J.Enders 利用单层细胞培养繁殖脊髓灰质炎病毒取得成功，于 1954 年获得诺贝尔奖。1952 年 Dulbecco 利用细胞单层培养进行 了蚀斑试验，1953 年 Salk 用细胞培养的脊髓灰质炎病毒制备出灭活疫苗，1957 年 Stewart 用细胞培养技术还分离出多瘤病毒。 目前细胞培养技术已广泛应用于未知传染因子的分离、病毒病诊断、疫苗生产以及病毒感染和复制的基础研究。 细胞培养技术对动物病毒研究所作的贡献主要包括：病毒转录新途径和翻译新途径的发现；病毒对宿主范围的选择；某些肿瘤病 毒引起的细胞转化；某些病毒侵染引起的细胞融合；发现有的病毒核酸由若干片段组成；有的病毒核酸具有极性的不同，如小 RNA 病毒 为正链 RNA 病毒，正粘病毒为负链 RNA 病毒等。 （三）病毒研究的细胞水平时期 3、 植物病毒不断有重要的发现: 1952 年 J.I.Harris 揭示了 TMV 外壳蛋白的化学性质， 1955 年 H.Fraenkel-Conrat 成功地在体外将 TMV 的核酸及其蛋白亚基重建出感染的 TMV， 1956 年 H.Fraenkel-Conrat 还证明 TMV-RNA 分子具有感染性，1956 年 F.A.Anderer 阐明了 TMV 外壳蛋白变性的可逆性；1960 年 A.Tsugita 测定了 TMV 外壳蛋白的氨基酸序列。 （四）分子病毒学的研究时期 50 年代至 60 年代是分子生物学的奠基时代， 而人们对病毒的研究， 特别是对噬菌体和植物病毒的认识对此做出了巨大的贡献。 因此， 分子病毒学也正是在分子生物学的发展过程中应运而生。 分子病毒学的发展是各相关学科如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学与病毒学理论和技术相互渗透的结果。尤其是分子生 物学新技术的发明，极大地促进了分子病毒学的发展。 分子病毒学的发展过程： 1953 年， Watson 和 Crick 建立了 DNA 双螺旋结构理论， 从而为分子生物学和分子病毒学的创立奠定了基础。 1962 年， D.L.D.Casfar 阐明了许多病毒的二十面体结构，明确了病毒核衣壳二十面体的构成规律，这是对病毒超微结构认识的重大突破。1962 年，D.Nathans 成功地进行了噬菌体 RNA 的体外翻译；1965 年，S.Spiegelman 成功地在体外复制出 Qβ 噬菌体 RNA；1967 年 M.Goulian 成功地体外复 制Φ X174 噬菌体。这些工作对以后阐明 DNA 病毒和 RNA 病毒 的繁殖机制起了重要作用。 1967 年，T.O.Diener 发现了类病毒，他在试图分离马铃薯纺锤形块茎病的病毒时，发现其病原不是病毒，而是一种不含有蛋白质，分子 量为 105 左右的裸露 RNA。 这样小的 RNA 分子不编码任何蛋白质。 根据其特殊的性质， Diener 把这类致病因子称为 “类病毒 （Viroids）。 ” 类病毒的发现在分子病毒学史上是一个重要事件。 1970 年，P.H.Duelerg 发现 Rous 肉瘤病毒含有癌基因 v-src，而且在正常鸡以及其他脊椎动物和无脊椎动物的 DNA 中，也发现有癌基因 v-src 的同源序列 c-src 存在，推测病毒癌基因是来自于细胞正常基因。随着其他肿瘤病毒致癌基因的发现，肿瘤病毒的细胞培养系统建 立，以及肿瘤病毒对细胞转化诱导作用的确定，使人们对肿瘤发生的机制有了更深刻的了解。 1970 年，H.M.Temin 和 D.Baltimor 分别发现了病毒的逆转录酶。1971 年，限制性内切酶技术的发现为 DNA 序列分析和病毒基因的定位 创造了条件。利用这一技术曾经成功地为乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒构建了酶切图谱。 1997 年，美国加利福尼亚大学的神经病学和病毒学教授 S.Prusiner 由于发现了羊瘙痒病的致病因子是朊病毒（prion） ，以及提出了疯牛 病、Creutz-feldt-Jakob 氏病、Kuru 病等脑退化性疾病是由朊病毒引起的理论，而获得了诺贝尔医学奖。病毒学经长时期的发展，逐渐 形成和成熟起来，随着病毒基因组复制、基因表达调控原理、病毒与宿主细胞的相互作用规律，病毒感染和致病的分子机制的揭示，以 及分子病毒学在技术上的革新和进步，它将为人类克服和战胜病毒病做出贡献。 四、病毒的基本特性 （一）病毒的定义和特点 病毒是一类比较原始、有生命特征、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。 病毒的特点： ① 形体微小，具有比较原始的生命形态和生命特征，缺乏细胞结构 ② 只含一种核酸，DNA 或 RNA ③ 依靠自身的核酸进行复制，DNA 或 RNA 含有复制、装配子代病毒所必须的遗传信息。 ④ 缺乏完整的酶和能量系统。 （二）病毒的结构、形态和大小： 1.病毒的形态： 病毒的形状同其壳体的基本结构紧密相关， 螺旋对称壳体： 在植物病毒多呈杆状， 昆虫病毒中核型多角体病毒多数成员也多呈杆状。 双对称结构壳体：仅少数病毒壳体为双对称结构。壳体由头部和尾部组成，病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。具 有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体（tailed phage） 。复杂形状的病毒壳体：壳体呈复合对称。如某些动物病毒。 2.病毒的大小： 装配成熟的病毒颗粒大小恒定不再改变，不同病毒间差异很大，从十几纳米到十几微米不等。最小的如植物的双生病毒直径仅12-18nm，最大的动物痘病毒（Poxviruses）达 300-450x170-260nm，相当于衣原体主体的大小。最长的如丝状病毒科（Filoviridae）病毒 粒子大小为 80x790-14,000nm。大多数病毒在 100nm 左右。 在病毒中有两种特殊情况： 一种是类病毒（viroids） ，它是一种只含有 RNA 而缺少蛋白的具有感染性的独特因子。 与之相反，朊病毒（prions）是一种只含蛋白，缺少核酸具有感染性的特异因子。 （三）病毒的化学组成及其功能 病毒的基本化学组成是核酸和蛋白质。有包膜的病毒和某些无包膜的病毒除核酸和蛋白质外，还含有脂类和糖类。有的病毒还含 有聚胺类化合物，无机阳离子等组分。 1.病毒的核酸： 核酸是病毒遗传和感染的物质基础。一种病毒的病毒颗粒只含有一种核酸，DNA 或者 RNA。有人认为，除逆转录病毒基因组为二 倍体外，其它病毒的基因组都为单倍体。也有人以核酸的条数计，如线状流感病毒 8 条核酸，呼肠弧病毒 10-12 条，TMV 中只有一条 RNA。 有的病毒含双链 DNA；有的为单链 DNA；有的为双链 RNA；有的为单链 RNA。有的单链 RNA 病毒其 RNA 进入寄主细胞后，可直接 作为 mRNA，转译出相应的蛋白，这种 RNA 病毒称正链侵染性 RNA 病毒，如 ssRNA 噬菌体、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、TMV 等；还 有一类 RNA 病毒，其单链 RNA 在寄主细胞里不能直接作为 mRNA，而需要有转录酶（病毒自带）以 RNA 为模板，转录出 mRNA，才 能转译出蛋白，这种 RNA 病毒称负链非侵染性 RNA 病毒，如口膜炎病毒、流感病毒和副流感病毒。 2.病毒的蛋白质： 蛋白质是病毒的另一类主要成份，组成蛋白质的氨基酸顺序及空间构象决定着病毒株系的差异，表现在抗原决定簇则决定其免疫 特异性。根据是否存在于病毒颗粒中，病毒的蛋白质分为结构蛋白和非结构蛋白。 非结构蛋白：主要指衣壳粒以外的蛋白，它们在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能。 结构蛋白：系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，包括壳体蛋白、包膜蛋白等。 壳体蛋白：壳体蛋白是构成病毒壳体结构的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基。功能：①构成病毒的壳体，保护 病毒的核酸；②无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性，同时还是病毒的表面抗原。 非结构蛋白：有些病毒带有酶，如噬菌体带溶菌酶，对寄主细胞膜有降解作用；Rous 病毒有反转录酶；呼肠弧病毒、流感病毒有 RNA 聚合酶；有些动物病毒还含有蛋白激酶。 3.病毒的囊膜成分： 相当多的动物病毒有囊膜包被，如流感病毒、疱疹病毒、Rous 病毒等。囊膜脂质对病毒的吸附和穿入寄主起重要作用，囊膜的糖蛋 白在这方面也起作用，此外，糖蛋白在病毒的抗原性、病毒凝集血球等方面起积极作用。 4.其他： 有些病毒的包膜表面还有辐射排列如大头针状的突起，称纤突，如流感病毒、鸡的新城疫病毒的血凝素（H）和神经氨酸酶（N） ， 有吸附寄主、凝集动物红细胞、破坏寄主细胞表面受体的作用。 （五）病毒的传播及其媒介 植物细胞因有细胞壁，可抵抗病毒的入侵。所以，植物病毒入侵植物是从伤口进入。如农民在田间移植苗、摘心、打顶、整枝、 打杈时，手沾染了病枝叶传染，或昆虫传播病毒。土壤中的病毒可通过根在延伸时的伤口进入。但自然界中植物病毒最重要的传播媒介 是昆虫和螨类，已知大约有近 400 种昆虫可传播 200 余种病毒，其中以蚜虫和叶蝉最为主要。 很多动物病毒可不经过伤口直接侵入动物暴露在外面的粘膜组织，如呼吸道粘膜、消化道粘膜、眼睛粘膜等。喷嚏或咳嗽排出的病毒通 过空气、粪便污染的水通过使用等方式，从粘膜进入。此外有不少动物病毒通过蚊和螨类等节肢动物传播，目前已知大约有 300 多种病 毒是通过这类昆虫传播，有 20 多种能造成动物或人严重病害。 曾有人认为,某些昆虫传播植物病毒的一个重要特点， 是病毒既能在昆虫也能在植物中繁殖。 这种病毒的寄主范围横跨动植物两大界， 很受科学工作者的重视。 病毒在昆虫体内复制过程主要通过对昆虫细胞的人工培养来研究。人们发现，并非所有被节肢动物传播的病毒都能在昆虫体内繁殖， 有的是从昆虫口器里携带的，有些飞虱和叶蝉只能以若虫传播病毒而成虫不传。 病毒的传播是个很复杂的问题，很多问题都有待搞清。 五、病毒与人类的关系 1.鸡新城疫病毒（Newcastle Disease Virus） 新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种极易传染的毁灭性禽类疾病，其死亡率常高达 100%，广泛分布于许多国家。 典型特征是呼吸道、消化道粘膜出血。人也有易感性。本病在 1926 年最早发现于印度尼西亚的巴塔维亚，同年发现于英国新城，因此而 得名。NDV 形态接近球形。具有血凝素（HA）和神经氨酸酶(NA)，是病毒的抗原结构。NDV 通过自身结构--HN 多肽（血凝素－神经氨酸酶）吸附到细胞上，然后病毒与细胞膜发生融合作用，病毒进入细胞并开始复制繁殖。 ND 临床症状变化很大，与鸡群的年龄和免疫状况、感染途径及有无其它微生物并发等多种因素有关。 人也能感染新城疫，主要发生于禽类加工厂的工人、兽医和实验室工作人员在接触病毒或处理病禽时发生，潜伏期为 48 小时，可引起急 性结膜炎，偶尔也可侵害角膜。不经治疗即可康复，并且不传染其他人。 NDV 通过健康家禽直接接触病禽，或间接摄入被病禽呼吸道分泌物和粪便污染的饲料、垫料及饮水而传播。通过家禽收购和加工厂 的活禽运输，处于潜伏期和发病早期的病禽与健康家禽混在一起，致使病毒传播。 温和型新城疫会成为持久性感染，长期不断排出病毒，造成疾病的连续传播。 控制新城疫的主要措施是预防接种，使用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。使用疫苗的同时，良好的饲养管理和清洁的卫生环境更是 预防的首要条件。 2.狂犬病毒(Rabies Virus) 狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的传染病。早在 1884 年， Louis Pasteur 就创建了一种疫苗，并救活一个被狂犬咬伤的农民儿 子的生命。世界卫生组织估计：每年约有 35,000 至 55,000 人死于该病，并且绝大多数发生在发展中国家。本病广泛地存在于世界各地， 所有温血动物都能感染。 ，但是自然界中主要的易感动物是犬科和猫科动物。野生动物是狂犬病毒主要的自然宿主。 狂犬病病毒在野生动物(狼、狐狸、鼬鼠、蝙蝠等)及家养动物(狗、猫、牛等)与人之间构成狂犬病的传播环节。人主要被病兽或带毒 动物咬伤后感染。一旦受染，如不及时采取有效防治措施，可导致严重的中枢神经系统传染病而死亡。 狂犬病毒外形呈弹状，具有两种主要抗原：一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，另一种为内层的核衣壳蛋白抗原。感染者发病时呈高 度兴奋状态，一旦喝水即引起严重的痉挛等症状，出现恐水现象，故又称“恐水症” （hydrophobia） 。3～5 日后，病人转入麻痹、昏迷状 态，最后呼吸、循环衰竭而死。人类患者一旦发病，病死率几乎为 100％，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，也是人类尚未能有 效控制的疫病之一。 狂犬病病毒最初分为 4 个血清型,近几年，不断有新的病毒基因型被发现 。狂犬病病毒基因组为单链、不分节段的负链 RNA ， 复制复杂。 据世界卫生组织(who)报道，全球每年有 4 万～7 万人死于狂犬病，其中大部分发生在发展中国家。 基因 1 型狂犬病是全球主要的流行类型。野生动物是狂犬病病毒的主要宿主，病毒主要通过带病的狗、猫、蝙蝠和其他野生动物咬 伤后，经伤口入侵体内。犬在携带和传播狂犬病病毒中起主要作用，但其他野生动物的传播作用在某些国家呈现上升的势头。病毒偶尔 也可通过呼吸道、消化道或亲密接触等途径传播。亚洲是狂犬病流行最严重的地区，每年约有 4 万人死于该病，占全球因该病死亡总人 数的 80％左右，其中狗咬导致的人狂犬病占 95％ 以上。 通过以上数据，我们不难看出人感染狂犬病的高峰为第三、第四季度；07 年与 06 年相比较，发病数增长 0．18％ ，死亡数增长 6．7％。 人感染狂犬病数字增长惊人。 近年来，我国狂犬病出现了第三次流行高峰，每年有将近 3000 人死于该病。 Lafon 研究发现乙酰胆碱受体(nAChR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、神经营养因子 p75 受体(p75NTR)可能是介导狂犬病病毒感染 机体时的受体。 狂犬病病毒感染神经细胞后造成细胞功能失调的具体机制还不清楚。 狂犬病的防控: 1 加强狂犬病防控知识宣传工作，提高人们文明素质。特别要加强犬的饲养者对犬的驯化与饲养管理方面的知识培训 2 多部门应强强联手，对辖区内的犬进行登记造册、免疫接 4 应加强对犬的检疫力度。特别是对犬市、狗肉店的检疫。 5 应加强狂犬病疫苗的监管力度，严禁劣质疫苗流入市场，影响免疫效果。 6 应做好对犬的保定和个人防护工作。 狂犬病的疫苗 WHO 推荐的细胞培养疫苗主要有人二倍体细胞疫苗(Ⅲ)Cv)、鸡胚细胞纯化疫苗(PCECV)、Veto 细胞疫苗(PVRV) 。近年来， 在狂犬病病毒减毒活疫苗、载体疫苗和 DNA 疫苗的研究方面都取得了一些进展。在被动免疫方面，抗狂犬病血清(免疫球蛋白)可以使患 者在自身抗体产生以前维持一定的抗体水平，控制病毒感染。狂犬病病人在注射疫苗的同时联合使用抗血清，可降低防疫的失败率 。 3.口蹄疫病毒（Foot-and-mouth DiseaseVirus，FMDV） 口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等， 黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。口蹄疫病 毒(FMDV)由一条单链正链侵染性 RNA 和包裹于周围的蛋白质组成，蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳 为对称的 20 面体。 种、发证工作、销售市场管理。 3 应将狂犬病免疫接种工作纳入动物疫病防控强制免疫序列，且要真正的做到强制免疫。复旦大学生命科学院、上海农科院畜牧所、浙江农科院病毒所和中国农科院兰州兽医所，经过 18 年潜心攻关，已成功研制出抗口蹄 疫基因工程疫苗---“抗猪 O 型口蹄疫基因工程疫苗”。 中国科学院上海植物生理生态研究所科技人员，利用烟草病毒制成一种高安全性新型医用疫苗，这种疫苗对口蹄疫病毒有特效。 FMDV 在病畜的水泡皮内和淋巴液中含毒量最高。在发热期间血液内含毒量最多，奶、尿、口涎、泪和粪便中都含有 FMDV。 不过，FMDV 也有较大的弱点：耐热性差，所以夏季很少爆发，而病兽的肉只要加热超过 100℃也可将病毒全部杀死。 患口蹄疫的动物会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状。恶性口蹄疫还会导致病畜心脏麻痹并迅速死亡。 人一旦受到口蹄疫病毒传染，经过 2－18 天的潜伏期后突然发病，表现为发烧，口腔干热，唇、齿龈、舌边、颊部、咽部潮红，出 现水疱（手指尖、手掌、脚趾） ，同时伴有头痛、恶心、呕吐或腹泻。患者在数天后痊愈，愈后良好。但有时可并发心肌炎。患者对他人 基本无传染性，但可把病毒传染给牲畜动物，再度引起牲畜间口蹄疫。 口蹄疫的主要传播途径是消化道和呼吸道、损伤的皮肤、粘膜以及完整皮肤（如乳房皮肤） 、粘膜（眼结膜） 。另外还可通过空气、 尿、奶、精液和唾液等途径传播。我国对口蹄疫的防治，预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。 4、禽流感（Avian Influenza, AI） 禽流感是由流感病毒引起禽类烈性接触传染病。以引起禽类呼吸道系统及其全身性败血症为特征。1878 年在意大利曾大爆发，迄今 在世界上流行了百余年，每次发生都造成极大的经济损失。由于禽流感病毒是人类流感病毒的变异型，故被国际兽医局（OIE）定为 A 类传染病。 AIV 呈球状、杆状、丝状，表面有血凝素（H）和神经氨酸酶（N） ，可将其分成 15 个 H 亚型和 9 个 N 亚型，共计 135 个亚型。AIV 对热的耐受力较差，600C，10min 或 700C，4min 即可灭活，太阳暴晒 40-48h 可灭活。但冻干后一年仍保持存活。 禽流感的致病机理是其囊膜表面的血凝素能凝集多种动物的红血球。野禽、水禽常因大量隐性感染或带毒而作为最危险、最易忽视 的传染源。AI 多发于早春和晚秋，主要通过消化道和呼吸道传染。多由 H5 和 H7 亚型（高致病型）病毒引起，先以低致病性的形式感 染禽类，当在禽类流行时，可在几月内转变为高致病性病毒，突然爆发，在 48 小时就能达到 100%的死亡。这也是人们对他很关注的主 要原因。 是迁徙鸟类传播了高致病性禽流感病毒吗？ 答 ；还不能肯定 。人们已知，野生水禽是 A 类流感病毒的天然宿主。它们携带的 H5 和 H7 亚型病毒在它们体内一般是低致病型的，但 目前证据表明，它们可直接携带 H5N1 型高致病病毒。并传播到新的区域。 该病毒很容易传染给人吗 ？ 答：不是的。尽管已有几千人感染禽流感，但与感染的禽类数量相比仍然很小，无法相比。 禽流感对人类健康有何影响？ H5N1 病毒的爆发给人类带来两种威胁： ⑴人类直接从禽类感染病毒，发展为重症，在已感染的病人中，病情迅速恶化，死亡率超过 50%； ⑵ 该病毒变异很快，变得很容易传染给人，并在人类中快速传播，这种变化将引发全球性的人类疫情。 成人和儿童均可感染发病，表现为发热、咳嗽、身体不适、肌痛、腹泻、恶心、呕吐等症状易引起病毒性肺炎、心衰和肾衰，大部分 患者可完全康复，但易出现并发症。 5、非典型肺炎 （SARS） 指一组具有肺火表现，如发热、头痛、咳嗽、咳痰等症状，肺部 X 线片有浸润阴影等肺炎体征，而病原体并不明确或由非细菌性病 原体引发的肺炎，总称为非典型肺炎。 以往有因为肺炎支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、军团菌、立克次体等分别引发非典型肺炎流行的记载。1976 年美国、西班牙、 瑞典、荷兰、英国等先后均有过因军团菌非典型肺炎暴发流行的报道。因其他病原体引发非典型肺炎流行也曾发生过。但是，并非所有 非典型肺炎均表现一样，正是由于其肺炎表现的不典型性，使不同病原体引发的非典型肺炎表现差异极大，严重程度各不相同，传染性 各不相同。 2003 年流行的非典型肺炎，由于其病原体为变异的冠状病毒，传染性强，有极为重症类型引发死亡病例存在，并且易在未作良好 防护的医护人员群体中传播流行，所以影响很大，也引起了国际上的广泛关注。由于部分患者很快表现出呼吸困难、呼吸窘迫、呼吸衰 竭，因此已被世界卫生组织统称为“严重急性呼吸道综合症”，英文简称为 SARS(Serious Atypica Respiratory Syndrome)。 冠状病毒直径为 80～160nm，为有包膜的单链 RNA 病毒。冠状病毒感染在人群中很普遍，人体中一般存在冠状病毒抗体，分离出冠 状病毒并不能说明其为致病病原体，必须诱导出与非典型肺炎完全相似的症状和表现，方可说明其作为病原体的可能性。 一般冠状病毒只感染脊椎动物，在人和动物中的感染率很高，可以引起人类呼吸道感染和肠道感染两种类型，成年人的冠状病毒抗 体高于儿童。 本次流行的非典型肺炎的病原体，肺炎支原体最多，占到非细菌引发肺炎的 1/3。其有 30 多种变异体，介于细菌与病毒之间， 为能独立生活的较小微生物，大小为 20μ m。肺炎支原体可导致咳嗽、头痛、咽痛、高热、肌肉酸痛、恶心、呕吐、干咳、痰中带血、胸痛等不适，可有皮疹。X 线胸片出现肺部纹理增多或斑片状阴影，较少出现多块片状阴影。发热一般持续 1～3 周，极少数重症患者出 现并发症而引起死亡。红霉素类、四环素类（大环内酯类）抗生素治疗有效，用药至少 10 天。 肺炎衣原体非典型肺炎由肺炎衣原体引发。肺炎衣原体为严格的细胞内寄生，具有原体和网织体两种形态，绝大多数人感染肺 炎衣原体无症状，在人群中的流行无明显季节性，似乎 2～10 年会出现一个发作高峰，在免疫力受到破坏的人群中发病更多，主要引发 咽炎、喉炎、肺炎等，临床症状主要为发热、咽痛、咳嗽等，以轻型多见，肺部可出现干、湿罗音及间质样支气管肺炎改变。 鹦鹉热非典型肺炎主要由鹦鹉热衣原体引发，鹦鹉热衣原体主要寄生在鹦鹉、鸽子、鸭等 100 多种鸟类中， 潜伏期 7～14 天，临床症状有寒颤、高热、肌肉痛、关节痛、眼睛畏光、咳嗽、咳痰，但常无明显肺部 X 线表现。重症未经治疗者死亡 率可达 20%～40%，治疗者死亡率在 1%左右。用四环素类治疗有效。 军团菌非典型肺炎为军团菌引发，感染后潜伏期 2～10 天，引起全身不适、头痛、肌肉痛、反复寒颤、持续高热、相对缓脉、 干咳或咳痰、痰中带血、胸痛、呼吸困难、嗜睡、昏迷等，X 线胸片出现片状阴影，病死率 15%～20%。用红霉素、强力霉素、四环素 治疗有效。 截止 2003 年 6 月 6 日（2002 年 11 月开始 ） ，全球累计死亡人数为 775 人，患病人数为 8403 人；我国死亡人数为 338 人，患病人数 为 5329 人。 SARS 病已在世界 30 多个国家和地区发生。 2003 年 5 月 2 日， 《科学通报》发表了我国多名科学工作者合作的“SARS 相 关病毒 CBJ01 分离株的基因组序列完成图及其比较分析”全文。 本次流行的非典型肺炎病原体主要通过呼吸道飞沫传播。然而，从广东省非典型肺炎发病情况来看，一个明显特征是家庭聚集 和医院聚集。因此推断非典型肺炎流行特点及方式可能是近距离飞沫传播，而飞沫接触粘膜可能是主要传播途径，开放的粘膜包括鼻腔、 口腔、眼结膜等。但根据后来发病情况来看，可能还有其他传播途径，比如患者分泌物接触污染等。因为病原体在外界可以存活 4～8 小 时，而手则极易接触患者分泌物，进而接触粘膜，造成传染。 冠状病毒宿主范围广，可感染牛、猪、马、火鸡、猫、狗、大鼠和小鼠等。按血清学和系统发生分成 I、Ⅱ、Ⅲ型。I、Ⅱ型可感染哺乳 动物，Ⅲ型仅感染禽类。在冠状病毒的包膜上已发现 3 种主要糖蛋白，即 S 蛋白、M 蛋白和 E 蛋白；1I 型冠状病毒中还有血凝素一乙酰 酯酶(HE)蛋白。S 蛋白(spike protein)又名刺(纤)突蛋白，伸出病毒表面，起介导病毒与宿主细胞融合作用，是一种主要的抗原蛋白。M 蛋 白(membrane protein)又名膜蛋白，在病毒出芽过程中起重要作用。E 蛋白(envelope protein)散在于包膜上，是一种小分子量蛋白 。 其基因组只有 1 个单链 RNA， 只能编码 5 个蛋白质。 其中 1 个基因编码自我复制所需的独有的“以 RNA 为模板的 RNA 合成酶” 又称复制酶，位于基因组上游，占整个基因组的 2/3。下游有 4 个依次排列的基因，根据它们的作用而分别称之为 S（棘突）蛋白、E（衣 壳）蛋白、M（膜）蛋白与 N（核骨架）蛋白的基因。除此之外，还有多个只是根据预测，还不知是否真正存在的“预测的不清楚的蛋白 质（PUP）”。基因顺序是一致的:5′―RNA 聚合酶基因―S 蛋白基因―E 蛋白基因―M 蛋白基因―N 蛋白基因―3′ SARS 病毒的检测 根据在 SARS 患者体内检测到 SARS―CoV 颗粒，抗 SARS―Cov 的抗体以及 SARS―Cov 的基因组从而来确诊为 SARS 。 目前，可以通过细胞培养对来自 SARS 病例样本(如呼吸道分泌物、血液或粪便)中的病毒进行分离；多数 SARS 感染者在有临床症状 后大约 21d，用 ELISA 法可在其血清中可靠地检测出 SARS―Cov 特异性抗体(IgM／IgG) ；根据 SARS―CoV 的保守序列，设计出多 对引物，进行逆转录 PCR(RT―PCR)法检测 SARS―CoV 存在与否，从而准确地检测和诊断 SARS。 I 期临床试验的完成，标志着 SARS 疫苗研究的难关已经基本攻克，不仅为进一步研究创造了条件，而且具备了在紧急状态用来保护高 危人群的潜力。这是我国 SARS 科技攻关取得的一项标志性重大成果，也是世界上第一个完成 I 期临床试验的 SARS 疫苗。 按照国际规范程序进行。临床研究前，为对疫苗安全性和有效性进行科学评价，项目组还进行了系统的动物试验，即先用低剂 量疫苗对猴进行免疫，再用 SARS 病毒攻击，结果未发现病程加重的免疫病理现象；随后又用超高剂量疫苗对猴进行免疫，动物各器官 病理及功能均未见异常，动物实验显示疫苗安全有效。 据了解，SARS 灭活疫苗 I 期临床试验完成，并经科学评估后，将确定进一步研究的方案，对其有效性、安全性，以及使用剂量 等进行深入研究。原则上，该疫苗只有全部完成了 I 期、II 期、III 期临床试验后才能商业化应用，但在发生 SARS 疫情的情况下，经有 关部门批准，现在的疫苗也可用于对高危人群进行免疫保护。 我国 SARS 病毒灭活疫苗已攻克疫苗研究的技术难题，建立了疫苗生产工艺和质量控制方法，完成了疫苗中试生产研究，具备了疫 苗小批量生产的技术能力。 我国开发了一批生物防护器具，填补了我国缺乏高级生物防护器具的空白。长春应用化学研究所研制成功可有效过滤空气中病 毒、细菌、粉尘微粒等微生物和吸附有毒气体，适用于ＳＡＲＳ防护的系列高效防病毒、防尘口罩 生化与细胞所胡赓熙研究组与上海数康生物科技有限公司合作研制成功蛋白质芯片检测系统，包含 SARS 病毒五种主要结构蛋白质 －－N 蛋白、E 蛋白、S 蛋白、M 蛋白和 3CL 蛋白的抗原，以及相应的配套对照蛋白。该芯片能在一个半小时内快速并行检测出病人血 清中针对芯片上相应抗原的特异性抗体。 从 2004 年 3 月开始，联合研究小组在广西、广东、湖北和天津四个地区采集 3 个科 6 个属 9 个种共 408 只蝙蝠的血清、咽拭子和肛拭子 样本。 在武汉的病毒学国家重点实验室和澳大利亚 Geelong 的动物健康研究室(AAHL)同时对这些样本进行了 SARS 病毒抗体和基因的检测，结果在菊头蝠属的 4 个种里发现 SARS 病毒抗体和基因，其中大耳菊头蝠显示 70%以上的抗体阳性率。基因序列分析表明，蝙蝠类 SARS 病毒与人 SARS 病毒基因组序列同源性达 92%。 武汉病毒所与湖北省疾病预防控制中心联合组成果子狸专项研究组，在鄂西地区 4 个不同的地点采集到果子狸的咽拭子、粪便、和血液 样品各 34 份。样品经 RT-PCR 扩增，扩增产物出现 SARS 病毒特异性带，经反复试验，阳性率均在 80%以上。 科学的进步是人类战胜新疾病的最有力武器。 在取得科学重大突破的同时,需要清醒地认识到人类与 SARS 的斗争刚刚开始,消灭它的传播 与流行是一个长期的过程。 目前，SARS 的流行已经得到有效控制，但仍有再次爆发流行的可能。控制 SARS 的流行，一方面需要可靠的诊断方法来诊断病人 和检测疫情传播，另一方面还需尽快研制出疫苗和抗病毒药物来防治这种疾病。经过科研人员的努力，已经研制出多种可靠的 SARS 实 验诊断方法；相关 SARS 疫苗的研制正在进行当中。防治动物冠状病毒的疫苗早已成功问世。因此，开发高效疫苗来防治 SARS 是大有 希望的 六、朊病毒（Prion） “慢病毒”引起的疾病 对这类疾病的研究，以羊搔痒病为代表，困难很大： 发病率 病程 传染病 / 遗传病 病因 / 病原物 低 慢 不清楚 找不到人们只能猜想：有一种“慢病毒”在起作用 1.普列昂的发现 早在 50 年代，Alper 等曾提出动物瘙痒症的传染因子可能缺乏核酸。至 1970 年 Griffith 等再次强调这种致病因子的复制不需要 核酸模板。1972 年由于 Prusiner 的一位病人死于克雅氏病，促使他开始研究这类疾病。经过十年的努力，在 1982 年，Prusiner 及其同 事终于从仓鼠脑中浓缩到羊瘙痒病的病原成分，称之为 prion。 这一发现，使 S.Prusiner 提出了中枢神经系统机能退行性病变的致病因子是朊病毒，它是一种缺乏核酸的遗传颗粒。 因此，美国研究人员斯坦利? 普鲁西纳（S.Prusiner）获得 1997 年诺贝尔医学奖。 得到难以公布的实验结果：原来预期得到小型病毒。结果，所有实验数据都表明: 病原物不是小型病毒，不含核酸，而是蛋白质粒子。 普列昂概念的提出，引起轩然大波。 许多人问：没有核酸，这个病原物如何增殖？如何复制本身的遗传信息? 许多人怀疑：可能还是存在核酸，只是未能检测出来。 关键在于是否存在核酸？ 普鲁西纳回忆说：在寻找核酸的问题上，D.Riesuer 和我所花的功夫比其他任何人都多，但没找到。 2、 随着研究的深入，得到更多打破传统观念的结果： （1）寻找 Prn－p 基因: 编码普列昂蛋白（PrP）的基因不但在染病动物脑中存在，亦在正常动物脑中找到，而且表达得量相近。 （2）普列昂蛋白（PrP c）在正常动物脑中的功能是什么？ 开始找不到答案。 剔除 PrP 基因的遗传工程小鼠（PrP%）看不出病症，似乎一切正常，亦能正常生育。 （3）PrP%小鼠作出的贡献： 把染病小鼠的脑提取物接种给 PrP% 小鼠，后者不染病。同样的脑提取物，接种给普通小鼠 PrP+/+，后 者被染病。 2、 随着研究的深入，得到更多打破传统观念的结果： （4） PrP 包括两种形式：细胞型（PrPc）和异常型（PrPsc） 。对 PrP c 和 PrP sc 两种蛋白质做结构分析。都是疏水性强的糖蛋白。氨 基酸序列、RNA 剪辑 、翻译后修饰 均无明显差别 （5）最后，终于找到差别：PrP c 和 PrP sc 在高级结构上有巨大差别 PrP c α －螺旋 β －折叠 42％ 3％ PrP sc 21％ 54%（6）PrP c 和 PrP sc 在高级结构上的差别, 在细胞内的行为和 代谢特征上也反映出来。 PrP c 定位 蛋白酶水解 细胞表面 水解完全 PrP sc 胞质内 局部水解（7）综合上面得到的结果，提出一个理论设想： 搔痒病的发生是因为 PrP sc 的入侵，把脑细胞中原来就有的 PrP c“带坏” ，使 PrPc重新折叠，形成新的高级结构，变成了 PrPsc 。增多的 PrP sc 形成淀粉样斑，造成脑细胞破坏，出现空斑，引起疾病。 （8）蛋白质 / 蛋白质 大分子间相互作用：PrP sc 把 后实验支持。 转染过程 用病仓鼠的 PrP sc 感染小鼠 在感染小鼠中连续传代后 用病小鼠的 PrP sc 感染仓鼠 在感染仓鼠中连续传代后 （9）与人有关的几种普列昂病 人的朊病毒病已发现有 4 种：库鲁（Kuru）病、克雅氏综合症（CJD） 、格斯特曼综合症（GSS） 、致死性家族性失眠症（FFI） 。临 床变化都局限于人和动物的中枢神经系统。病理研究表明，随着朊病毒的侵入、复制，在神经元树突和胞体本身，尤其是小脑星状细胞 和树突状细胞内发生进行性空泡化，星状细胞胶质增生，灰质中出现海绵状病变。朊病毒病属慢病毒性感染，皆有潜伏期，病程缓慢， 逐渐出现进行性脑功能紊乱。四种病都是神经退行性疾病，现在都找到 了 PrP 异常蛋白。 （10）与动物有关的几种普列昂病 动物的朊病毒病已发现有 6 种以上： 牛海绵脑病 （BSE 疯牛病） 绵羊瘙痒病 、 （Scrapie of 大耳鹿慢性消耗病（CWD） 、猫海绵脑病（BSE） 、传染性雪貂白质脑病（TME） 。 3. 朊蛋白的分子结构特点： 朊蛋白(PrPc)的基因位于人类第 20 号染色体的短臂上，位于小鼠第 2 号染色体上，位于牛的第 13 号染色体上。由 253―254 个氨基 酸残基组成，分子量为 33~37KD，是构成朊病毒的基本单位，一个 PrP 本身不具有侵染性，由 3 个 PrP 分子构成的“朊病毒单位”具有 高度侵染性。PrP 还能聚合成杆状颗粒，约由 1000 个 PrP 构成的这种杆不单独存在，总是排列成丛。杆和丛都有传染性。 N 端含 22 个氨基酸残基组成的信号肽序列，第 23～95 序列有一段由 5 个富含甘氨酸和氨基酸 8 肽的重复区，96～112 是 PrPc 结构 的转录控制区，113～135 序列有一段跨膜区，135～231 序列有 3 个螺旋区。 c 端在第 232 个氨基酸的位置，切去 21 个氨基酸组装上 1 个脂多糖，称糖基磷脂酰肌醇(GPI)。因此，PrPc 为一种“糖基磷脂酰肌 醇蛋白” ，以磷脂的脂肪酸入膜。多肽链中还有 1 个二硫键及两个 N 一糖基化位点。人类基因的开放阅读框包含在一个完整的外显子内， 小鼠和绵羊的 PrP 基因由 3 个外显子构成。 4. 朊蛋白的代谢特点： PrPc 在核糖体合成，运转到内质网后，在高尔基体进行糖基化并折叠，通过 GPI 和唾液酸固定到细胞膜。它所在的膜区需富含胆固 醇、磷脂、糖脂，在此区它与小窝蛋白结合，内陷形成囊泡，由小囊泡送到胞内，PrPc 一部分经胞内酶进行降解，另一部分可再次回到 细胞膜上。 5. 朊蛋白的复制： 细胞基因编码蛋白 PrPc，朊病毒通过 PrPc 复制。Cohen 等根据传染型和遗传型朊病毒病中 PrPsc 的产生方式不同，提出两种朊病 毒复制模式，即一种为传染型和散发型的朊病毒复制模式，另一种为遗传型朊病毒复制模式。细胞基因编码的 PrPc 有时出现结构改变， 形成部分分解折叠的单体结构，即 PrP*。PrP*可以产生 PrPsc，也可以回复到 PrPc。由于 PrPsc 是不溶性蛋白，所以从 PrP*到 PrPsc 是不可逆的。在传染型朊病毒病中，由于外源性朊病毒 PrP sc 侵入细胞中，刺激 PrPc 生成 PrPsc。在散发型朊病毒病中，一般没有外}