副主任检验师
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HIV检查关于灰区的问题
状态：就诊前
希望提供的帮助：
可我想想还是好担心啊，整个人非常难过，为什么第一次检测结果会处于灰区啊，医院用的是酶联法。
&副主任检验师
你第一次检查结果所用的方法为ELISA方法，本身影响因素就很多。
连续几次都是阴性，你就放心吧！
疾病名称：HIV检查关于灰区的问题&&
希望得到的帮助：可我想想还是好担心啊，整个人非常难过，为什么第一次检测结果会处于灰区啊，医院用的...
病情描述：高危后3个月查HIV,第一次查的结果不确定，医生说临界值偏高，处于灰色地带，看不清阴性阳性。他说要重新测一次，之后测出来是阴性。但我还是不放心，几天后我又测了一次是阴性。又过了3个月，我...
疾病名称：HIV检测有疑问&&
希望得到的帮助：可我想想还是好担心啊，为什么第一次检测结果会处于灰区啊，医院用的是酶联法。
病情描述：高危后3个月查HIV,第一次查的结果不确定，医生说临界值偏高，处于灰色地带，看不清阴性阳性。他说要重新测一次，之后测出来是阴性。但我还是不放心，几天后我又测了一次是阴性。又过了3个月，我...
疾病名称：HIV检测有疑问&&
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病情描述：高危后3个月查HIV,第一次查的结果不确定，医生说临界值偏高，处于灰色地带，看不清阴性阳性。他说要重新测一次，之后测出来是阴性。但我还是不放心，几天后我又测了一次是阴性。又过了3个月，我...
疾病名称：艾滋病&&
希望得到的帮助：关于检验方面的请教。。
病情描述：韩老师您好！我在海淀CDC定点的世纪坛医院抽血检查HIV，结果只有阴/阳，没有S/CO值。。我知道检测上应该有一个灰区的问题，不知道如果结果处于灰区，一般疾控中心要求怎么处理呢？会不会被直接写...
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韩呈武大夫的信息
医学检验、临床医学。
韩呈武，副主任检验师，毕业于北京大学医学部临床医疗专业、医学检验专业。曾赴日本进修1年（主要学习检验质...
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大同市第五人民医院【】 HIV吧标题：医院检测在灰区，医生说可疑，咋办【hiv吧】_百度贴吧
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【】 HIV吧标题：医院检测在灰区，医生说可疑，咋办收藏
今天医院说既不是阳性 也不是阴性
，可疑，要复查血液转到疾控中心。我是不是中了，为什么在灰区呢，我很伤心，很无望。医生说大多数复查时阴性，我不太相信 觉得他是安慰我 ，有相同情况的朋友吗？谁可以帮助下我。快绝望了
行为时间决定结果，你可以说下。
你还问不问，不问我复习去了。
我只能呵呵了. 不要太信套套作用. 我从没无套过. 受方. 照样中了. 还是祝你翻盘成功. 阴
做好心理准备！坚持服药、你和正常人一样
距最后一次六周后检查，这段时间什么结果都有可能，如果平时比较乱还是0的话就很危险了。以检测结果为准。祝阴。
灰区就是数值0.9～1。我那次0.955，一个月后复查阴
12。94是阳性
那过阵子在去复查
有体液交换就有中的可能，去检测吧
12.94就是妥妥的阳，应该被阴了
有没有口腔溃疡
套套就是个虚的 不确定就是中了
学习艾滋十几年 还没有过不确定是阴性的 好自为之吧 吃药还能活几年的说
大于1就是阳性，你都12.94了
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艾滋病筛查实验室的基本标准建筑条件： 实验室或检测区域应分为清洁区、半污染区和污染区，应符合二级生物安全实验室（BSL-2）要求。 人员条件： 至少由 3 名医技人员组成，具有中级卫生技术职称人员至少 1 名。负责筛查试验的技术人员需具有 2 年 以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验，接受过省级或省级以上 HIV 检测专项技术培训，并获得培训证 书。仪器设备条件： 配备艾滋病病毒抗体筛查试验所需设备，至少包括酶标读数仪、洗板机、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、 离心机、加样器（仪）、消毒与污物处理设备、实验室恒温设备、安全防护用品和生物安全柜。全国艾滋病检测技术规范(试行) 中国疾病预防控制中心 二○○三年五月 2 第二版《全国艾滋病检测工作规范》修改说明 艾滋病检测工作具有严格的科学性和政策性.为了加强全国艾滋病检测工作的规范 化管理和质量控制,确保每一例检测的准确性和可靠性,及时有效地发现感染者和上报 疫情,1997 年 9 月卫生部对 1990 年发布的《全国 HIV 检测管理规范(试行)》修改补充 后,颁布了第一版《全国艾滋病检测工作规范》.《全国艾滋病检测工作规范》实施五年 多来,在全国艾滋病检测实验室的设置,申报,验收和审批,HIV 抗体检测工作的规范 化和质量管理,检测结果的判定,报告和反馈,实验室安全以及 HIV 感染者和艾滋病患 者的保密等方面均发挥了重要的作用. 艾滋病在我国的流行已经近 20 年,流行形势日趋严峻,据估计截至 2002 年底 HIV 感染者已逾百万,随着感染者数量的不断增加和临床病人的日益增多,检测工作的量也 在不断加大,各级艾滋病检测实验室也由疾病预防控制系统逐渐遍及医院,血站,出入 境检验检疫局,妇幼,军队等各个系统.因此,早期制定的&全国艾滋病检测工作规范& 已经不能满足目前各个系统对艾滋病检测工作的需求.此外,近年来,检测技术和方法 有了很大的发展和提高,对于保障血液安全和缩短窗口期等也提出了更高的要求,因此, 仅靠单纯的血清学检测方法已经不能满足需求.为了更好的指导全国的艾滋病检测工 作,不断提高检测工作质量,需要进一步丰富有关的检测技术内容,制定更加完善的可 满足各个系统需求的检测工作规范.2001 年由艾滋病确认实验室审评专家委员会组织对 第一版《全国艾滋病检测工作规范》进行修改,补充工作.经初步修改后,于 2001 年 11 月召开的&全国艾滋病检测工作年会&上各确认实验室的专家及技术人员对修改稿进 行了讨论,与会者提议,考虑到检测技术和方法的快速发展和卫生部的职能下放等因素, 为便于检测工作的管理,及时增加和补充新的技术内容,建议将原&全国艾滋病检测工作规范&修订为&艾滋病检测工作管理办法&(下称&办法&)和&艾滋病检测技术规范& (下称&规范&),使艾滋病检测工作的管理和技术文件能够更加准确地为全国艾滋病检 测实验室提供服务.这个建议当即得到卫生部参会领导的认可. &办法&和&规范&的制定工作历时二年余.为了适应我国艾滋病防治工作的要求, 尽量满足各级各类艾滋病检测实验室的管理和技术需求,同时紧跟国际检测技术和策略 3 的发展与更新,专家组起草的&办法&和&规范&修改稿反复多次征求了各方面专家和 具有丰富实践经验的第一线工作人员的意见,参考国际标准和有关的新进展,并于 2002 年 12 月&艾滋病检测工作年会&上再次讨论了&办法&和&规范&,特别对其可操作性 进行了仔细讨论.会后由性病艾滋病预防控制中心分别将&办法&和&规范&发至各省 艾滋病确认实验室再次征求了意见.此外,本次修改的&办法&和&规范&还参考了国 际标准化组织的相关草案(ISO/DIS15189 和 15190),使其与国际检测技术和策略紧密 接轨. &全国艾滋病检测技术规范(试行)&由中国疾病预防控制中心颁布.该&规范(试 行)&适用于全国所有的艾滋病检测实验室.&规范&共分为 7 章,内容包括:样品的采 集和处理,HIV 抗体,抗原检测,HIV 核酸检测,HIV 实验室安全防护,艾滋病实验室质 量管理,艾滋病确认实验室质量考评办法,HIV 诊断试剂临床评估方案 ,以及附录 1(HIV RNA 测定). &全国艾滋病检测工作管理办法&在征求各省卫生厅意见后由卫生部颁发,&办法& 颁发之前,&全国艾滋病检测技术规范(试行)&中没有涉及到的有关检测工作管理部分 的内容仍然按照&全国艾滋病检测工作规范(1997 年版)&执行. 4 目 录 第一章 样品的采集和处理……………………………………………………………… 1 一,样品的采集……………………………………………………………………… 1 二,样品的保存……………………………………………………………………… 1 三,样品的运送……………………………………………………………………… 1 四,样品的接收……………………………………………………………………… 2 第二章 HIV 抗体,抗原检测…………………………………………………………… 2 一,HIV 抗体检测…………………………………………………………………… 2 二,HIV-1 P24 抗原检测……………………………………………………………… 8 第三章 HIV 核酸检测…………………………………………………………………… 8 一,实验室条件……………………………………………………………………… 8 二,方法和试剂……………………………………………………………………… 10 三,检测程序………………………………………………………………………… 10 四,结果判定和报告………………………………………………………………… 11 五,实验室管理……………………………………………………………………… 11 第四章 艾滋病检测实验室安全防护…………………………………………………… 12 一,建立安全制度…………………………………………………………………… 12 二,人员管理和培训………………………………………………………………… 13 三,安全保障措施…………………………………………………………………… 13 四,实验室事故处理………………………………………………………………… 14 第五章 艾滋病实验室质量管理………………………………………………………… 15 一,质量保证(QA )……………………………………………………………………15 二,质量控制(QC)…………………………………………………………………… 18三,质量评价(EQA)……………………………………………………………………21 5 第六章 艾滋病确认实验室质量考评办法……………………………………………… 22 一,考评目的………………………………………………………………………… 22 二,考评对象及组织单位…………………………………………………………… 23 三,考评内容和方式………………………………………………………………… 23 四,考评工作程序…………………………………………………………………… 23 五,考评结果的判定………………………………………………………………… 24 六,考评结果的处理………………………………………………………………… 24 第七章 HIV 诊断试剂临床评估方案 ……………………………………………………25 一,评估的目的 ………………………………………………………………………25 二,评估组织及参加单位 ……………………………………………………………25 三,评估程序 …………………………………………………………………………26 四,评估结果的分析及统计处理 ……………………………………………………27 五,评估结果的收集,分析,上报和反馈 …………………………………………27 附表 1 HIV 抗体筛查报告………………………………………………………………… 28 附表 2 HIV 抗体筛查阳性送检单………………………………………………………… 29 附表 3 HIV 抗体检测确认报告…………………………………………………………… 30 附表 4 HIV 抗体检测数及阳性人数统计报表…………………………………………… 31 附表 5 艾滋病职业暴露个案登记表 …………………………………………………… 32 附表 6 职业暴露后预防 HIV 感染的评价和处理程序……………………………………35 附录 1 HIV RNA 测定…………………………………………………………………… 37 1 第一章 样品的采集和处理 一,样品的采集 艾滋病检测最常用的样品是血液,包括血清,血浆和全血.唾液或尿液有时也可作 为测试样品.常用样品的采集方法如下: (一)血清样品采集:用注射器抽出一定量静脉血,室温下自然放置 1-2 小时,待血 液凝固和血块收缩后再用 3000rpm 离心 15 分钟,吸出血清备用. (二)抗凝血样品采集:用加有抗凝剂的真空采血管或用消毒注射器抽取静脉血,转 移至加有抗凝剂的试管,反复轻摇,分离血浆和血细胞备用.应根据实验要求选用适当 的抗凝剂(EDTA,肝素,枸橼酸钠等),如需进行病毒 RNA 测定,应在 4-8 小时以内 分离血浆. (三)采样注意事项 1,采集样品应按临床采血技术规范及试剂盒说明书要求进行. 2,采集标本时应注意安全,直接接触 HIV 感染者或艾滋病病人血液和体液的操作应 戴双层手套.建议采用真空采血管及蝶形针具,以免直接接触血液. 二,样品的保存 (一)用于抗体检测的血清或血浆样品应存放于-20℃以下, 短期(1 周)内进行检 测的样品可存放于 2-8℃. (二)用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下,进行病毒 RNA 检测的样品如长期(3 个月以上)保存应置于-80℃. 三,样品的运送 (一)实验室间传递的样品应为血清或血浆,除特殊情况外一般不运送全血.样品应置于带盖的试管内,试管上应有明显的标记,标明样品的编号或受检者姓名,种类和采 集时间.随样品应附有送检单,送检单应与标本分开,不能混放. (二)将试管放入专用带盖的容器内,容器的材料要易于消毒处理.在试管的周围应 垫有缓冲吸水材料,以免碰碎.如果路程较远或气候炎热,应在 2-8℃条件下运送.用 于抗体检测的样品可在短期内(≤48 小时)室温递送.每一包装的体积不得超过 50ml. 运送感染性材料必须有记录. (三)特殊情况下如需对个别样品进行复测,可以用特快专递形式投寄,但必须将盛 样品的试管包扎好,避免使用玻璃容器,以保证不会破碎和溢漏. 2 四,样品的接收 (一)含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的工 作人员打开,用后的包裹应进行消毒. (二)核对标本与送检单,检查样品管有无破损和溢漏.如发现溢漏应立即将尚存留 的样品移出,对样品管和盛器消毒,同时还要报告有关领导和专家. (三)检查样品的状况,记录有无严重溶血,微生物污染,血脂过多以及黄疸等情况. (四)因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试. 第二章 HIV 抗体,抗原检测 一, HIV 抗体检测 (一)检测试剂 1,筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准,批批检合格,临床评估 质量优良,在有效期内的试剂.目前常用的筛查试剂有酶联免疫,颗粒凝集和其它快速 诊断试剂.采供血机构进行血液筛查应采用 HIV-1/2 混合型酶联免疫试剂.自采自供血 的单位必须进行 HIV 抗体检测,在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训 的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查. 2,确认试剂必须经国家食品药品监督管理局注册批准.确认试剂包括免疫印迹试 剂,条带免疫试剂及免疫荧光试验试剂.目前以免疫印迹试剂最为常用. (二)检测要点 1,严格按照试剂说明书操作,不得擅自更改. 2,注意防止交叉污染. 3,严格遵守实验室操作规程. (三)检测程序及流程图 1,筛查试验 标本验收合格后,用筛查试剂进行检测,如呈阴性反应,报告 HIV 抗体阴性;对呈 阳性反应的标本,须进行重复检测. 2,重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检 测.如两种试剂复测均呈阴性反应,则报告 HIV 抗体阴性;如均呈阳性反应,或一阴一 3 阳,需送艾滋病确认实验室进行确认.应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标 本一并送检. 3,筛查试验的流程图 (四)HIV 抗体确认试验 1,常用的确认实验方法是免疫印迹法(WB). 2,免疫印迹试剂有 HIV-1/2 混合型和单一型.一般先用 HIV-1/2 混合型试剂进行检测,如果呈阴性反应,则报告 HIV 抗体阴性,如果呈阳性反应,则报告 HIV-1 抗体阳 性,如果不满足阳性标准,则判为 HIV 抗体不确定.如果出现 HIV-2 型的特异性指示 条带,还需要用 HIV-2 型免疫印迹试剂再做单一的 HIV-2 型抗体确认试验,呈阴性反应, 报告 HIV-2 抗体阴性;呈阳性反应的则报告 HIV-2 抗体血清学阳性.如需要进行鉴别, 还应进行核酸序列分析. 样 品 筛查检测 筛查试剂 阳性反应 阴性反应 重复检测 原有试剂加另外一种筛查试剂 一阴一阳 均阴性反应 均阳性反应 送确认实验室 进行确认 阴性报告 4 3,HIV 抗体确认试验流程图 (五)确认试验结果的判定:使用免疫印迹法(WB)确认时我国的判定标准为: 1,HIV-1 抗体阳性(+) 至少有二条 env 带(gp41 和 gp160/gp120)出现,或至少一条 env 带和 p24 带同时 出现. 2,HIV-2 抗体血清学阳性(+) 同时符合以下二条标准可判为 HIV-2 抗体血清学阳性: (1)符合 WHO 阳性判定标准,即出现至少二条 env 带(gp36 和 gp140/ gp105); (2)符合试剂盒提供的阳性判定标准. 3,HIV 抗体阴性(-) 无 HIV 抗体特异带出现. 4,HIV 抗体不确定(± ): 出现 HIV 抗体特异带,但不足以判定阳性. 注:① HIV-1 抗体特异带包括:env 带:gp160/gp120,gp41; gag 带:p55, p24,p17(或 p18);pol 带:p66(或 p65),p51,p31. ② HIV-2 抗体特异条带包括:env 带:gp140/gp105,gp36;gag 带:p56, p26,p16;pol 带:p68,p53,p34.(由于使用的毒株不同,HIV-2 env 抗原也可为 gp125/gp80,gp36). 上述标准为判定免疫印迹试验结果的基本原则,在实际工作中还应参照所用试 剂的说明书综合判定,遇疑难情况应报上级实验室解决. 免疫印迹法(HIV1/2 混合型) HIV-1 阳性反应 不确定反应 出现 HIV-2 指示条带 HIV-1 阳性报告 不确定反应 阳性反应 阴性反应 报告 HIV-2 血清学阳性 必要时测核酸 阴性报告免疫印迹法(HIV-2) 每 3 个月随访一次,共 2 次,仍属可疑,则作阴性报告如随访期间出现阳性反应则报告阳性 阴性反应 阴性报告 5 (六)检测结果的报告和处理 1,HIV 抗体筛查 筛查试验呈阴性反应出具 HIV 抗体阴性报告. 筛查试验呈阳性反应,可出具&HIV 抗体待复查&报告(附表 1),不能出阳性报告. 同时应尽快进行以下处理: (1)填写 HIV 抗体复查送检单(附表 2),经一名检测操作人员和一名具有中级以 上技术职称的人员审核签字. (2)尽可能重新采集受检者的血样. (3)将二份血样(或仅原血样)连同 HIV 抗体复查送检单一并送当地艾滋病筛查 中心实验室,再转送艾滋病确认实验室,或直接送确认实验室确认. (4)筛查中心实验室应尽快用两种试剂进行复测,如结果均阳性或一阴一阳,则应 将送检标本和 HIV 抗体复查送检单一并送艾滋病确认实验室确认.如复检结果均为阴 性,在送检单上盖上&HIV 抗体阴性(一)&字样图章,并及时将结果反馈送检单位, 不必再送确认实验室. (5)做好检测后咨询. 2,HIV 抗体确认 HIV 抗体阳性应出具 HIV 抗体阳性确认报告(附表 3),并按相关规定做好咨询, 保密和报告工作. HIV 抗体阴性应出具 HIV 抗体阴性确认报告,如果近期有高危行为,如性乱,注 射毒品等,或有急性流感样症状等情况,为排除&窗口期&的可能,可以进行 HIV-1 P24 抗原或 HIV 核酸检测,或 2―3 个月以后再做抗体检测. HIV 抗体不确定出具 HIV 抗体不确定确认报告,在备注中应注明&3 个月后复查&. 同时进行以下处理: (1)随访复查:每 3 个月随访复查一次,连续 2 次,共 6 个月.如果检测时暴露时 间已超过 3 个月,则在 1-2 个月后随访 1 次即可.将前后二份样品同时检测,仍呈不确 定或阴性则报告 HIV 抗体阴性,如果在随访期间发生带型进展,符合 HIV 抗体阳性判 定标准则报告 HIV-1 或 HIV-2 抗体阳性. (2)必要时可做 HIV-1 P24 抗原或 HIV 核酸测定,但检测结果只能作为辅助诊断 依据,确认报告要依据血清学随访结果. (3)做好检测后咨询. HIV 抗体确认报告由一名具有高级卫生技术职称的人员复核签字,按原送检程序反 馈.如确认对象户口不属于本辖区,确认报告应同时抄送感染者户口所在地的省级艾滋 病确认中心实验室.其它系统确认的地方人员(包括本地和外地),也应及时向当地卫 生行政部门和省级艾滋病确认中心实验室报告. 省级艾滋病确认中心实验室难以确认的标本,送国家艾滋病参比实验室确认.同一 受检对象的标本在不同艾滋病确认实验室得到不一致的确认结果时,由国家艾滋病参比 6 实验室和 HIV 确认实验室审评专家组予以仲裁. 3,HIV 抗体检测情况的报告艾滋病筛查实验室应于每季度首月 5 日前向上级艾滋病筛查中心实验室报告上季度 检测情况(附表 4).没有艾滋病筛查中心实验室的地区可直接向艾滋病确认中心实验室 报告. 艾滋病筛查中心实验室应于每季度首月 10 日前将本实验室和本辖区内各筛查实验 室上季度报告的检测情况(附表 4)汇总,报告艾滋病确认中心实验室. 艾滋病确认实验室应于每季度首月 10 日前将上季度检测情况汇总后(附表 4),报 告艾滋病确认中心实验室和同级卫生行政部门. 艾滋病确认中心实验室应及时收集,整理和分析辖区内 HIV 抗体检测情况,于每季 首月 15 日前向省级卫生行政部门和国家艾滋病参比实验室报告. 国家艾滋病参比实验室应于每季度首月 20 日前将上季度全国 HIV 抗体检测情况汇总, 报告中国疾控中心性艾中心. 在非送检标本中(如专项调查与研究等)发现的艾滋病病毒抗体阳性者,亦应填写附 表 4,报中国疾控中心性艾中心.并通知阳性者所在地的省级疾病预防控制中心. HIV 抗体检测情况报告流程图 艾滋病筛查实验室 艾滋病筛查中心实验室 艾滋病确认实验室 每季首月 5 日前 报告上季检测情况 每季首月 10 日前 报告上季检测情况 艾滋病确认中心实验室 同级卫生行政部门 国家艾滋病参比实验室 省级卫生行政部门 每季首月 15 日前 报告上季检测情况 每季首月 20 日前 报告上季检测情况 中国 CDC 性艾中心 每季首月 5 日前 报告上季检测情况 没有艾 滋病筛 查中心 实验室 的地区 7 (七)HIV 感染监测工作中实验室检测策略 符合下列实验室条件,HIV 抗体筛查试剂条件和 HIV 抗体阳性判定标准者,可按 HIV 感染报告疫情. 1,实验室条件:具备下列条件的艾滋病确认中心实验室(1): (1)本年度质量考评成绩优良; (2)有严格的实验室质量管理制度. 2,HIV 抗体筛查试剂条件 (1)经过国家食品药品监督管理局批准或注册,批批检合格,临床评估质量优良. (2)复测须用两种不同原理或不同厂家的筛查试剂(含第三代 ELISA 试剂[2]).3,HIV 抗体阳性的判定条件 (1)两种试剂复测均为阳性,且第三代 ELISA 试剂复测样品 OD 值与临界值(Cutoff) 的比值(S/CO)≥6.0. (2)两种试剂复测结果均为阳性,但第三代 ELISA 试剂复测 S/CO 比值在 1.0~6.0 之 间,或两种试剂复测结果呈一阴一阳,应进一步作确认,按照确认试验的判定标准判断 结果. 4,检测及疫情报告流程图 . (1)即省级疾控中心艾滋病确认实验室.(2)进口或国产第三代试剂. 送检样品 用两种不同原理或不同厂家的试剂复测(其中包括第三代 ELISA 试剂) 第三代 ELISA 试剂复测 结果的 S/CO 比值≥6.0 第三代 ELISA 试剂复测结果 的 S/CO 比值 1.0~6.0 之间 确认试验 判定阳性,上报疫情 判定阴性 两种均阳性 两种均阴性 一阴一阳 阳性反应 阴性反应 选用筛查试剂 阳性 阴性 8 二,HIV-1 P24 抗原检测 (一)适用范围 1,HIV-1 抗体不确定或窗口期的辅助诊断. 2,HIV-1 抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断. 3,第四代 HIV-1 抗原/抗体 ELISA 试剂检测呈阳性反应,但 HIV-1 抗体确认阴性者的 辅助诊断. 4,监测病程进展和抗病毒治疗效果. (二)试剂 一般用 ELISA 双抗体夹心法试剂,必须经过国家食品药品监督管理局批准注册. (三)严格按照试剂盒说明书操作 (四)结果报告和解释 1,HIV-1 P24 抗原的阳性结果必须经过中和试验确认. 2,HIV-1 P24 抗原阳性仅作为 HIV 感染的辅助诊断依据,不能据此确诊. 3,HIV-1 P24 抗原阴性结果只表示在本试验中无反应,不能排除 HIV 感染. 第三章 HIV 核酸检测 一,实验室条件 (一)功能分区 1,实验室原则上应分为设在不同房间的四个独立工作区,分别是试剂准备区,样品 处理区,扩增区和扩增产物分析区.前两区为扩增前区,后两区为扩增后区.各区的功 能是: (1)样品处理区:样品登记,分装.核酸提取,保存和加样. (2)试剂准备区:扩增试剂的配制,分装和保存. (3)扩增区:核酸扩增.(4)扩增产物分析区:扩增产物的电泳,杂交,成像,测定,结果分析,登记及报 告. 2,扩增前区与扩增后区应严格分开,须使用不同的房间,两区之间最好有一定的间 隔. 3,使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制. 4,在满足下列操作和清洁处理要求的前提下样品处理区和试剂准备区可设在同一房 9 间内: (1)在生物安全柜内操作. (2)每个实验人员/实验组分别使用各自的试剂及耗材. (3)盛放污染材料的器皿密封并一次性使用. (4)用有效的方法对操作区域和共用器具在实验前后进行清洁及消毒.推荐的程序 是: a.实验前将次氯酸钠溶液或 70%乙醇涂布于操作台或器具表面,两分钟后用纸巾擦 除. b.移入盛放污染材料的器皿,所需的试剂,耗材和样品,进行试验. c.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验. d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管;封好污染材料盛放器皿并移 出至污物袋;移出共用器具至专门区域保管;将次氯酸钠溶液或 70%乙醇涂布于操作台 或器具表面,两分钟后用纸巾擦除;打开紫外灯照射至少 15 分钟. 5,产物分析使用相对封闭的系统时,如特定的检测系统或全自动分析仪,扩增区和 扩增产物分析区可设在同一房间内. 6,各区域的仪器,设备,器具和试剂应为该区专用,不得交叉使用. (二)人员 进行 HIV 核酸检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格,并接受过安全及操作技 术培训. (三)设施和设备 1,根据检测项目配备相应的设施和设备. 2,各区域的设施和设备应为区域性专用,开展特定试验时应根据要求在相应区域放 置专用设备.以下是各区域应配备的设备: (1)试剂准备区:冰箱,洁净工作台,离心机,加样器,振荡器,废弃物容器. (2)样品处理区:冰箱,生物安全柜,离心机,加样器,振荡器,恒温水浴,上下 水设备,盛放污染物的容器. (3)扩增区:核酸扩增设备,冰箱,离心机,加样器,废弃物容器. (4)扩增产物分析区:冰箱,离心机,加样器,电泳仪,振荡器,恒温水浴,紫外 透射仪,摄影/像设备,上下水设备,废弃物容器,核酸污染物处理设备等. (5)测定 HIV RNA 应配备-80℃冰箱. 3,各区域应备有工作人员专用的工作服,帽子和鞋套,必要时配备防紫外线眼镜或 面罩. 10 二,方法和试剂 HIV 核酸检测有定性和定量两类,前者用于 HIV 感染的辅助诊断,后者常用于监 测 HIV 感染者的病程进展和抗病毒治疗效果. 定性检测通常使用 PCR 或 RT-PCR 技术,使用分子生物学实验室通用的扩增试剂,引物可来自文献或自行设计,应尽量涵盖所有的或常见的毒株,也可使用复合引物. 目前常用的 HIV RNA 定量测定方法有逆转录 PCR 实验(RT-PCR),核酸序列扩增 实验(NASBA),分支 DNA 杂交实验(bDNA)等.详见附录 2. 三,检测程序 (一)样品的采集和处理 1,用于 HIV 核酸检测的样品有全血,血浆,组织和其他分泌物,有时还包括生物 制品. 2,采集样品应避免微生物和核酸污染. 3,处理样品应在样品处理区由专人进行.处理和保存用于测定 RNA 的样品应避免 RNA 酶造成的降解,通常要求在采样后 4-8 小时内处理并低温保存. 4,处理后的样品应分装,标记,冻存于-20℃以下,RNA 类样品应冻存于-80℃. (二)核酸提取 1,应在规定的区域内由专人按相应程序进行. 2,应保证无细菌及核酸污染,实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用. 3,提取 RNA 时应避免 RNA 酶污染. (三)试剂配制 1,应在规定的区域内由专人按相应程序进行. 2,只能在试剂准备区打开和配制试剂,配制完毕后应及时将剩余试剂放回贮存区 域. (四)加样和扩增 1,应在样品处理区内加样.将适量的核酸样品小心加入装有反应液体的反应管内, 盖紧盖子并做好标记. 2,操作超过 10 分钟时应将反应管置于冰盒内. 11 3,扩增仪应预热,时间不少于 20 分钟. 4,将反应管置于扩增仪上,开始扩增. 5,有些扩增反应不需要扩增仪,等温扩增应在恒温设备内进行. (五)扩增产物测定和分析 常用的扩增产物测定方法有电泳,酶切,杂交等,应在产物分析区内操作. (六)定量检测 通常采用商用系统,应按照所用系统的要求安排实验室和进行操作,同时还应满足 上述核酸测定实验室的通用要求. 四,结果判定和报告 (一)定性检测 通常根据扩增产物的电泳图像判定结果,阳性结果还要进行核酸序列测定来确定. 1,HIV 核酸检测阴性, 只可报告本次实验结果阴性,不可排除 HIV 感染. 2,HIV 核酸检测阳性, 可作为诊断 HIV 感染的辅助指标,不单独用于 HIV 感染的 诊断. 3,报告核酸定性检测结果时应注明反应条件和所使用的引物序列. (二)定量检测 1,按照仪器读数报告结果,应注明使用的试验方法,样品种类和样品量. 2,测定结果小于最低检测限时,应注明最低检测限水平.注意低于最低检测限的 结果不能排除 HIV 感染. 3,应附上仪器打印的数据.五,实验室管理 HIV 核酸检测实验室应制定严格的管理制度,工作人员必须充分了解各项规定并严 格遵照执行. (一)生物安全 必须符合艾滋病检测实验室的通用生物安全要求. 12 (二)严格执行分区制度 1,按照要求严格进行实验室分区. 2,各区域只用于特定的操作,不得从事其他工作. (三)仪器和材料的专用制度 仪器,设备,材料,设施均应按工作区域进行标识,不得交叉混用. (四)单向流向制度 1,实验材料(包括:样品及其扩增产物,实验器材(容器,板架,个人护具),试 剂,记录纸,笔,清洁材料等)只能从扩增前区流向扩增后区,即从试剂准备区→样品 处理区→扩增区→扩增产物分析区.不得逆向流动. 2,实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区,不得逆向流动. 3,尽量减少人员由扩增后区返回扩增前区的频度. (五)废弃物处理制度 1,所有废弃物应按照 HIV 污染物品处理. 2,由专人按特定程序和方法进行清洁和消毒. (六)质量控制和评价 1,制订质量保证计划,包括内部质量控制和参加室间质量评价的程序. 2,建立内部质量控制制度,每次检测都应设置阳性对照,阴性对照和空白对照; 定量检测需加入不同浓度的标准对照. 3,定期接受室间质量评价. 第四章 艾滋病检测实验室安全防护 一,建立安全制度 (一)实验室的设备,建筑和设施的安全性应通过专家的评审. (二)建立安全标准操作程序,该程序应适用于现有的实验条件,并与实验室其他 规章制度一致. (三)无论是否发生意外事故,每年都要对安全标准操作程序及其实施情况进行检 查. 13 (四)制定意外事故处理预案..建立意外事故的登记和报告制度. (五)实验室主任要按照《艾滋病职业暴露安全药物贮备库和贮备点的实施方案(试 行)》(见附录 1)的规定,对突发事件和职业暴露事故进行调查,处理和报告. 二, 人员管理和培训 (一)人员管理 1,实验室主任应了解所有工作人员.在安排工作区域时,要根据人员的工作种类 和所涉及的生物材料,对实验室环境做安全检查. 2,新调入人员,外来合作,进修和学习的人员在进入实验室之前必须经过实验室 主任的批准.非实验室人员和非实验室物品不得进入实验室. 3,严格执行实验室工作人员年度采血检测 HIV 抗体和备案制度,工作人员血清应 长期保留.(二)培训 1,所有工作人员必须经过 HIV 检测技术和实验室安全培训,包括上岗培训和复训, 并接受实验室管理人员的监督.实验室的安全责任人要对工作和环境的安全负责,所有 工作人员都有责任保护自己和他人的安全. 2,必须告知新上岗人员实验室工作的潜在危险,进行安全教育,直至有能力后方 可单独工作. 三, 安全保障措施 (一)个人保健 1,高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要.皮肤受损,患病都会增加感 染的危险.皮肤的伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖. 2,进实验室前要摘除首饰,修剪长的带刺的指甲,以免刺破手套. 3,进入实验室应穿隔离衣,戴手套.如果接触物传染危险性大,则应戴双层手套 和防护眼镜. 4,离开实验室前必须脱去隔离衣并洗手. 5,严禁在艾滋病检测实验室内进食,饮水,吸烟和化妆. (二)带入和带出实验室的物品 1,对所有带入实验室的物品都应进行检查.含有测试样品的包裹应在安全柜或其 他适当的装置内打开. 2,将 HIV 测试样品转送其他实验室时,应防止对人员和环境的污染.护送样品的 人应明确接收地点和接收人,实验室负责人或其指定的人员应及时确认样品已送达指定 14 的实验室,被转入安全位置并得到妥善处理. 3,污染或可能造成污染的材料在带出实验室前应进行消毒. 4,用于国际空运的样品要按照国际空运协会(IATA)的规则进行包装和标记,并 提交相应的资料. (三)减少利器的使用 1,尽量避免在实验室使用针头,刀片等利器,.如果必须使用,在处理或清洗时应 采取措施防止刺伤或划伤,并应对用过的物品进行消毒处理. 2,最好不使用玻璃制品. 3,尽量使用安全针具采血,如蝶形真空针,自毁性针具等,以降低直接接触血液 和刺伤的危险性.应将用过的针头直接放入坚固的容器内,消毒后废弃. (四)HIV 消毒方法 实验室常用物品的消毒方法如下: 1,废弃物缸:10%(v/v)次氯酸钠(含 10,000 ppm 有效氯). 2,生物安全柜工作台面和仪器表面:70%乙醇. 3,溢出物:10%次氯酸钠(w/v). 4,生物安全柜和实验室:甲醛蒸气熏蒸.生物安全柜:25ml 福尔马林(40%甲醛, w/v)和等量水混合后放在一个蒸发皿中使其在密封的生物安全柜中蒸发,保持至少 6 小时,最好过夜.实验室:福尔马林和水加热沸腾,其体积根据实验室的大小而定. 5,污染的台面和器具:40%甲醛水溶液,也可以用过氧化氢或过氧乙酸. 四,实验室事故处理 (一)紧急处理措施 发生意外事故时,应立即进行紧急处理,并报告实验室负责人,根据具体情况采用 相应的方法.1,皮肤针刺伤或切割伤:立即用肥皂和大量流水冲洗,尽可能挤出损伤处的血液, 用 70%乙醇或其他消毒剂消毒伤口. 2,皮肤污染:用水和肥皂冲洗污染部位,并用适当的消毒剂浸泡,如 70%乙醇或 其他皮肤消毒剂. 3,粘膜污染:用大量流水或生理盐水彻底冲洗污染部位. 4,衣物污染:尽快脱掉污染的衣物,进行消毒处理. 5,污染物泼溅:发生小范围污染物泼溅事故时,应立即进行消毒处理.发生大范 围污染物泼溅事故时,应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现场查清情 况,确定消毒的程序. 15 (二)事故登记(附表 5): 主要内容有: 1,事故发生的时间,地点及详细经过. 2,暴露方式;受伤部位,伤口深浅,暴露程度;污染物种类(培养液,血液或其 他体液)以及其中含有 HIV 的情况. 3,处理方法和经过,包括专家或领导赴现场指导和处理的情况. 4,是否采用暴露后药物预防,如果是,应详细记录用药情况,包括首次用药时间, 服药方案和毒副作用. 5,随访检测的日期,项目和结果. (三)报告和检测 1,发生重大事故时,在紧急处理的同时要立即向主管领导和专家报告.同时抽血 检测 HIV 抗体,暴露一年内要定期检测. 2,发生小型事故时可在紧急处理后立即将事故情况和处理方法报告主管领导和专 家,检测同前. (四)HIV 职业暴露后的药物预防,参见附表 6. 第五章 艾滋病实验室质量管理 实验室质量管理包括质量保证,质量控制和质量评价. 一,质量保证( QA ) (一)行政支持 行政部门要关心艾滋病实验室的建设和发展,保证实验室负责人和主要技术人员的 稳定,保证实验室建筑和设备需要,给予充足的经费支持,并进行经常性监督检查. (二)实验室规范化建设 艾滋病实验室的设置及其建筑,设施,设备必须符合《艾滋病检测工作管理办法》 的要求. (三)人员培训及其评价 实验室工作人员上岗前必须接受技术培训并获得合格证书.在工作中要定期或不定 期接受复训.实验室主管领导应定期对工作人员进行评价,包括工作的准确性,效率, 执行安全条例和规章制度情况,职业道德,出勤率以及上岗资格等. (四)标本采集,运送和处理,参见本规范第一章. (五)检测方法和试剂的选择 应使用最可靠的检测方法和仪器,并定期进行评价. (六)设备维护与校准 16 应该设立常用仪器的维护制度,以保证正常运转.推荐方法如下:1,酶标读数仪,洗板机 每天:核对滤光片波长,检查洗板机管道是否通畅,是否有漏液现象. 每周:清洁仪器表面,保护光学零件不沾灰尘. 每月:检查洗涤时各孔是否与相应的冲洗头对位良好,负压是否符合规定要求. 每年:检查,清洗滤光片,如果出现破裂或霉点则要更换.根据仪器内具有的校 准程序或使用校准板,对滤光片的精密度进行校验并保留记录. 根据使用情况更换必要的部件. 2,移液器 : 一年至少应该标定一次,发现异常情况应随时进行标定. 标定方法包括有色溶液光谱分析法,称量校准法,同位素计数法以及使用配套校准 盒等.标定多道移液器时,必须保证每一个加样头都能够连续,准确地加样.移液器的 精密度应在厂家说明书规定的范围内. 范例 用蒸馏水称量法标定移液器: 在室温为 22 ℃的无风的工作室中,在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶, 用待标定的移液器吸取存放过夜的蒸馏水加入烧瓶底部,称重并计算蒸馏水重量,连续 称重 10 次.加蒸馏水的量根据待标定移液器的规格而不同(见下表),10 次标定称量均 在要求的重量范围内为合格,贴上合格标签,注明标定日期,不合格移液器要请生产厂 家进行校准.填写和保存较准记录. 称重法标定移液器方案 移液器规格 蒸馏水量 要求重量范围 0.5 - 10 μl 2 μl 1.75 - 2.25 mg 5 - 40 μl 10 μl 9.8 - 10.2 mg 40 - 200 μl 70 μl 69.4 - 70.6 mg 200 - 1000 μl 300 μl 298.0 - 302.0 mg 1 - 5 ml 2000 μl 1990.0 - 2010.0 mg 2 - 10 ml 3500 μl 3485.0 - 3515.0 mg 3,冰箱和孵育箱: 定期检查温度并作好记录,必须每天检查和记录低温及超低温冰箱的温度. 4,定期检查其他仪器设备. (七)文件和文件管理 17 1,标准操作程序 (SOP) 艾滋病检测实验室要建立覆盖主要工作内容的 SOP 文件. SOP 由各岗位工作人员起草,实验室主任审定,并应定期修订.修订应该在实验室 主管人员的领导下进行,每年至少一次.所有工作人员要在所从事工作的 SOP 文件上 签名表示已经阅读并掌握了有关内容. SOP 通常包括以下内容: (1)标题和编号 (2)编写和修改日期 (3)编写和修订人员姓名 (4)方法,目的和原理 (5)相应的职业规范 (6)检测设备和试剂 (7)其他相关步骤(8)健康和安全操作指南 (9)结果的解释和报告以及出现问题时所采取的措施 (10)附录,包括相关的附加文件如标准表格,设备和试剂盒说明书等. 艾滋病检测实验室应建立以下 SOP (1)样本的接收,登记和处理 (2)检测方法和步骤 (3)质控品的应用方法 (4)仪器的使用与维护 (5)结果解释与报告 (7)保密程序 (8)检测数据的记录 (9)追踪和处理 (10)实验室的清理和消毒 (11)安全 2,实验原始记录表 应按实验要求,设计操作的原始记录表,标明空白对照,阳性对照,阴性对照,外 部对照以及待检样品的位置,便于指导实验人员加样.要注明试剂盒来源,测定方法, 批号,有效期,操作人员和复核人员姓名及检测日期. 3,标本的登记 收到标本后,及时登记有关参数,包括受检者姓名或代号,试管编号,性别,年龄, 职业,送检单位,人群类别,检验结果,送检日期,报告日期,备注 ( 必要时记录通 信地址 )等. 18 x HIV 抗体复查送检单和 HIV 抗体检测确认报告单见《艾滋病检测工作管理办 法》. 4,HIV 阳性标本的保存记录 记录 HIV 阳性标本的贮存量,贮存温度,贮存起始时间以及标本保管人姓名. 5,文件存档 实验原始记录表,打印数据,膜反应条带或其照片,检测记录表,标本登记,标本 保存记录以及仪器设备维修和校准记录等都应该妥善存档保存 15 年以上.最好同时使 用计算机保存各种文件和记录. 二,质量控制( QC ) (一)质控血清的制备和保存 在所有实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清. 内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清.内部对照是质量控制的 基础.每一次检测必须使用内部对照,而且只能在同批号的试剂盒中使用. 外部对照质控血清是为了监控检测的重复性和稳定性以及试剂盒批间差异而由 实验室设置的一套对照血清,包括强阳性,弱阳性和阴性对照血清.也可以只设置一 个弱阳性对照,以该试剂盒临界值(Cut-off)的 2-3 倍为宜. 1,外部对照质控血清的制备: 收集 HIV 抗体阳性和阴性血清,56℃30 分钟灭活,3000rpm 离心 15 分钟.弱阳 性对照可以用 HIV 抗体阴性血清梯度稀释 HIV 抗体强阳性血清并标定后得到.按一 年使用量配制,用 0.2μm 滤膜过滤除菌.2,外部对照质控血清的保存: (1)按一周实验用量分装,分类,标记,封口,-20℃冻存. (2)外部对照血清不可反复冻融,一旦融化后应该存放 2-8℃,一周内使用. 3,外部对照质控血清的使用 原则上每一次实验必须使用外部对照质控血清,以便监控实验的重复性和稳定性. 同时可以了解各批试剂盒的批间差异,绘制质量控制图. (二)质控图的建立及应用 1,建立质控图参数 (1)算术平均值( )代表一组 S/CO 值的平均值.为了统计学上有显著性意义,应 该采用至少 20 次(天)所测得的外部对照质控血清 S/CO 值结果计算出平均值. (2)标准差(s)是描述样本与均数之间离散程度的一个指标,是与对照值的均值有 关的预期范围.一组 S/CO 值的标准差以 s 表示. 19 (3)控制限:外部对照 S/CO 值的 ±2s (4)变异系数(cv),是反映各次 S/CO 值相对于均值离散程度的一个指标,可以用 来衡量检测的重复性或精密度. 计算公式为: ∑x = ―― n s 计算公式为: ――――――― ∑( xn - x ) 2 s = ――――――― n-1 cv 计算公式为: s cv = ―― x 100 % 2,绘制质控图 质控图是把检测数据与计算出的&控制限&进行比较的图,包含一条中心横线和其 上,下两条平行的控制线,并有按时间顺序点入的质控血清测定值. 质控图的绘制步骤是; (1)在常规条件下,对同一批血清连续测定 20 次(天)或以上,获得一组 S/CO 值, 求均数( )和标准差(s), 超出 2s 或 3s 的数据不应删除. (2)将均值( )和标准差(s)分别在质控框架图中标示出来.以 S/CO 值作纵座标(Y 轴), 每一次(天)试验作横座标(x 轴),绘制质控图. (3)从第 21 次起,将每次检测的质控血清的结果依次点入该质控框架图中,检验进 入质控状态. (4)建议将内部对照质控血清和外部对照质控血清的结果绘制在同一个质控图中. 3,质控图的判定和分析 (1)失控:外部对照的 S/CO 值超出± 2s,称为失控,则本次实验结果不能被接受. 可能是系统误差或外部对照滴度下降造成. (2)位移:连续几个(3-5 次)外部对照 S/CO 值都落在均值的一侧则称为位移,提 示实验条件发生了较大的变化.应重新绘制质控图.(3)趋势:连续几个(5-7 个)外部对照质控血清 S/CO 值几乎按一个方向分布时称 为趋势,通常由参数的缓慢改变引起. 4,考察试验系统的可靠性可采用多标准质控方案,其要点为: 出现一次 2s 范围的变化时,系统处于告警状态,应予注意,是否可以继续检测需要 进一步观察. x x x x x 20 出现下列情况时,应暂停检测查找原因:出现一次 3s 范围的变化,连续两次出现同 一方向 2s 范围的变化,连续四次出现同一方向的 1s 范围的变化,连续十次结果都在 1s 范围内,但落在均值线的同一侧. 5,绘制和分析质控图的要点: (1)要在最佳条件下建立质控图参数. (2)用 S/CO 比值绘制质控图. (3)由专人负责建立质控图,每月定期召开质控分析会,讨论本月的质量控制情况. 每次检测之前都应了解质控结果. (4)建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒. (5)更换不同厂家的试剂盒后,必须重新绘制质控图.改用新批号试剂盒如结果偏 离较大也应重新制作质控图.使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用 日期. (6)如发现质控值剧烈位移或失控,应填写报告单,上交质量负责人,分析原因并 决定是否发出检测报告. (7)使用新批次的外部对照质控血清时,必须重新绘制质控图. (8)发现质控结果失控 6,变异系数(CV)分析 变异系数(cv)小于 20%,表示外部对照处于稳定状态. 7,灰区 通常把临界值上下 10%的范围定为灰区,对灰区标本应进行复测. (三) 即刻法&质控 &即刻法&质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定 3 次后,即可对第 3 次检验 结果进行质控.具体计算方法如下: 1,将质控血清的测定值从小到大排列:x1,x2,x3……xn(x1 为最小值,xn 为最大值) 2,计算 和 s 3,计算 SI 上限值和 SI 下限值 X 最大值SI 上限= s -X 最小值 SI 下限= s 4,将 SI 上限,SI 下限与 SI 值表(表 4)中的数字比较.x x x 21 表 4 SI 值表 n n3s N2s n n3s n2s 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.46 13 2.61 2.33 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.44 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.56 (1)当 SI 上限和 SI 下限 n3s 值时说明该值已在 3s 范围之外,属&失控&.数 值处于&告警&和&失控&状态应舍去,需重新测定该质控血清和病人样品.舍去的只 是失控的这次数值,其他测定值仍可继续使用. 三,质量评价(EQA) (一)评价体系 1,国家艾滋病参比实验室和一些艾滋病确认中心实验室接受国际相关机构的质量 评价. 2,国家艾滋病参比实验室对全国艾滋病确认中心实验室和艾滋病确认实验室进行 质量评价,并负责提供质量评价标本,标准以及有关文件. 3,艾滋病确认中心实验室对本省或本系统的艾滋病筛查实验室进行质量评价. (二)质量评价参比标本 1,由经过确认的 HIV 抗体阳性,弱阳性和阴性三种血清/ 血浆组成. 2,必须经过严格标定和统计学处理,标定值以及统计学数据必须保密. 3,应清亮,无溶血,无菌,无过多的脂质. 22 4,经加热灭活并加防腐剂处理. 5,等量分装后分类(以不同颜色表示), 贴上标签,注明名称,编号,保存条件, 发放单位以及效期.在-20℃或-70℃冷冻储存,专人保管和记录使用情况. 6,分发参比标本时,每套质控物有一个外包装,注明参比标本. 8,失效标本按传染性生物材料处理办法销毁. (三)评价程序 1,国家艾滋病参比实验室负责制备和发放室间质量评价标本.并将质量评价的项 目,标本的数目和数量,检测时间,报告要求,截止时间等通知被评价实验室. 2,被评价实验室收到室间质量评价标本后,根据要求,按照日常检测条件和程序 进行盲检. 3,被评价实验室必须按规定时间书面报告质量评价标本的检测结果.报告内容必 须包括检测结果和原始记录的复印件.报告经操作人员和实验室主任签字方为有效. 4,各级质量评价部门收到被评价实验室提交的报告书后应该及时进行分析,作出 本次质量评价结论,写出评价报告.5,各级质量评价部门应该按时将质量评价报告反馈给被评价实验室.有问题的实 验室应该认真查找原因,及时纠正.经上一级质评部门允许,被评价实验室可以进行 1 -2 次复检,复检结果按时报送上一级质量价评部门. 6,对各级实验室的质量评价每年不少于一次. 7,必要时由上一级评价部门派专家不定期进行现场检查. (四)质量评价管理 1,实验室质量评价工作每年要进行总结,以提高质量评价的工作质量. 2,表彰质量评价工作做得好的实验室,推广和宣传质量管理好的经验. 3,对质量评价不合格的实验室,由主管机构视情况给予限期改进,停止工作整改 和撤销实验室资格的处罚. 第六章 HIV 确认实验室质量考评办法 一,考评目的 (一)评价确认实验室 HIV 抗体检测和确认的水平,为各实验室提供外部质控机制, 为检查和重新认定确认实验室资格提供技术依据. (二)促进艾滋病确认中心实验室和确认实验室建设,通过考评使其检测技术,质量 管理和人员素质得到提高,逐步完善确认中心实验室和确认实验室的功能,使这些实验 室在本省或系统内能正确完成 HIV 抗体确认试验,并在省(直辖市)卫生厅(局)统一 23 领导下完成省级 HIV 确认中心的各项任务. (三)提高实验室技术和管理水平,为国际合作项目提供高质量的技术支持,促进国 际合作(项目)在中国的健康发展. 二,考评对象及组织单位 全国所有经正式批准的艾滋病确认实验室为受考评单位,中国疾控中心组织并委托 性艾中心负责对确认实验室的质量考评工作.考评每年进行一次. 三,考评内容和方式 考评内容包括 HIV 抗体筛查和确认技术,结果报告和各项职能工作的完成情况.考 评方式包括:实验操作,问卷调查和现场抽查.考核成绩将由实验操作和职能工作两部 分构成,开始阶段的评分以实验操作为重点.以后逐渐增加职能工作的得分比重. 四,考评工作程序 (一)每年考评之前召开 HIV 确认实验室审评专家组会议,确定考评的具体实施方案, 问卷调查内容及有关事宜. (二)考评实验室负责制备考评血清,并进行检测和标定,将标定结果作为参考结果 备案.考评血清可由 6-10 份样品组成,包括强阳性,弱阳性,不确定和阴性样品. (三)将考评血清随机编号后,由考评实验室发给参评实验室,同时发放考评问卷调 查表. (四)各参评实验室应严格按照&规范&要求,检测考评血清,填写报告单.实验原 始记录应保存备查.必须根据当年实际情况逐项如实填写实验室问卷调查表. (五)各参评实验室将检测报告和填写完整的问卷调查表加盖公章后,按规定期限报 至考评实验室. (六)检测结果的评判:考评实验室接到检测报告和问卷后,根据评分标准对各参评 实验室的检测结果及问卷进行汇总,统计,分析和评估.必要时可调用有关实验的原始 记录和条带进行分析核查.各参评实验室检测结果汇总后存档. (七)结果反馈:考评实验室将考评情况报 HIV 确认实验室审评专家组,经专家讨论, 确定各参评实验室的最终评判结果,并对各类结果提出相应的处理意见和建议.上报卫生部疾病控制司批复后,将考评得分及扣分原因发至各参评实验室. 24 五,考评结果的判定 (一)判分原则:包括考评血清检测得分和各项职能工作完成情况的得分,两部分分 别计算.血清检测结果得分由三个部分组成:最终结果的判定,确认试验反应带型,检 测是否符合规范要求.由于各实验室使用的试剂批号不同,带型符合率可能存在差异, 因此在计算总分时,带型符合率得分所占比例较小.职能工作完成情况的分数比例以当 年实施方案为准,并逐年有所提高. (二)常规评分标准 考评工作以考评样品检测为主(占总分 60%以上),同时考察参评实验室的各项职 能工作完成情况(占总分 10%-40%),每部分的得分所占比例可根据当年考评重点进行 调整.本常规评分标准作为评分的基本标准,每年考评前 HIV 确认实验室审评专家组会 议可视情况进行修改. 考评结果的判定 (1)考评结果的判定:凡本年度检测工作出现重大失误(漏报,误报)的实验室, 即判为不及格. (2)在此前提下,考评结果判定见下表 级别 考评样品检测得分 职能工作完成情况 不及格 ≤检测满分的 60% 较差 占检测满分的 61-70% 得分≤满分 60% 合格 占检测满分的 71-80% 得分占满分 61-70% 良好 占检测满分的 81-95% 得分占满分 71-80% 优秀 &检测满分的 95% 得分占满分 80%以上 注:如果两部分得分出现分离现象,则应计算两部分得分之和占总分的比例: 大于总分的 92%为优秀 大于总分的 80%为良好 大于总分的 70%为合格 六,考评结果的处理 (一)对考评合格实验室的资格认证和鼓励 1,对达到合格标准的实验室发给实验室资格证书,并注明考评成绩,有效期为三 年; 2,考评优秀的实验室可参与全国艾滋病相关研究和全国性诊断试剂临床评价工作; 25 3,对连续二年考评得分优秀的实验室将视情况给予免试 1 年的待遇. (二)对考评成绩较差的实验室进行以下整顿 1,考评不及格的实验室,经 HIV 确认实验室审评专家组实地核查质量确有问题的, 由考评实验室上报组织单位,并转报卫生部疾控司,由卫生部疾控司发出通知,撤消其 实验室资格. 2,实验室检测得分较差者,暂停确认资格,限期 3 个月整改.整改期间由 HIV 确 认实验室审评专家组进行现场指导和实地考核,考核合格后恢复其确认资格;3 个月后 仍不合格者按 1 项规定处理. 3,确认资格被暂停的实验室,一年内若不申请再次考评者,撤消其实验室资格. 4,被撤消确认实验室资格的实验室须重新培训,按《艾滋病检测工作管理办法》要求再次提出申请,批准后方可再次获得确认资格. 第七章 HIV 诊断试剂临床评估方案 由试剂使用单位对 HIV 诊断试剂进行临床质量评估是对国家药品监督管理部门对 试剂生产审评和批批检制度的一项重要补充,也是许多国家控制市场销售的 HIV 诊断试 剂质量的重要手段. 一,评估目的 对国内市场销售的国产和进口 HIV 诊断试剂使用时的敏感性,特异性,批间差异和 适用性进行综合质量评估,及时发现和解决试剂质量问题,为中央和地方卫生行政部门 提供有关的决策依据,并作为艾滋病检测实验室选择试剂的依据.未参加评估的试剂一 般不推荐使用. 二,评估组织及参加单位 (一)国家级评估 国家艾滋病参比实验室负责组织全国的 HIV 诊断试剂临床质量评估,可选择部分具 备条件的 HIV 确认中心实验室和确认实验室参与评估.每年组织 1-2 次,使其规范化, 制度化. (二)省级评估 省艾滋病确认中心实验室为各省 HIV 诊断试剂临床评估的主要职能单位.由省艾滋 病确认中心实验室组织评估本省使用的 HIV 诊断试剂质量,选择省内艾滋病确认实验室 或有条件的艾滋病筛查中心实验室参与评估.每年组织 1 次,使其规范化,制度化. 26 三,评估程序 (一)国家级评估 1,样品的组成和采集 (1)一般不少于 50 份,最好在 500 份以上,目前常用的是 200 份,包括已知样品 和未知样品各 100 份. (2)已知样品系经免疫印迹法(WB)确认的血清(浆),其中包括 HIV 抗体阴性 (含筛查假阳性样品),阳性和弱阳性样品.在国家参比实验室统一组织阶段,100 份已 知样品由国家参比实验室提供 50 份,由参评实验室提供 50 份.一般阳性样品的比例为 10-40%. (3)100 份未知样品,由参评实验室在本地区具有一定比例 HIV 阳性者的高危人 群中采集.或由 HIV 感染率高的地区向部分 HIV 感染率低的实验室提供部分样品. (4)样品质量:考核样品必须保存良好,清亮,无溶血,无微生物污染,也无过多 脂质,避免反复冻融. 2,试剂的品种及抽检 (1)试剂种类应覆盖参评省临床使用的所有品种,也可包括相邻省区使用的试剂. 每个参评实验室评估的试剂至少为五个品种.为避免出现评估试剂的过度重复或遗漏, 由国家参比室协调各参评实验室评估的试剂品种. (2)避免偏性:受评估试剂应由参评实验室在对筛查实验室进行质量管理过程中抽 检,避免由厂家直接送检.实行双盲检验,即操作者不知设计安排者选用样品的真实情 况. (3)参比试剂:可以用一种或一种以上高质量的第三代 HIV 诊断试剂作为参比试 剂. 3,质评样品的检测 操作时必须在最佳条件下进行比较,即在同一仪器设备,同一时间,由同一检测人 员严格按照各试剂操作要求进行.(1)已知样品的检测 可直接用受评估试剂进行检测,不需要使用参比试剂和确认试剂. (2)未知样品的检测 可使用高质量的第三代 HIV 诊断试剂作为参比试剂.对其中筛查阳性和可疑的样品 应进行确认. (二)省级评估 各省确认中心实验室可根据国家级评估方案及本省具体情况制定省级评估方案. 27 四,评估结果的分析及统计处理 测试后的检测结果可按下列指标统计处理: (一)敏感性:真阳性/(真阳性+假阴性)× 100% (二)特异性:真阴性/(真阴性+假阳性)× 100% (三)假阳性率:假阳性/(真阴性+假阳性)× 100% (四)假阴性率:假阴性/(真阳性+假阴性)× 100% (五)功效率:功效率是指不产生假阳性和假阴性结果的效率,是一种将敏感性和特 异性相结合的综合质量指标,其公式为: (真阳性+真阴性)/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)× 100% (六)变异系数(cv):是反映各次 OD 值相对于均值的离散程度的指标,可以用于 衡量被检测试剂的重复性或精密度.在整套质评样品中有专供测定变异系数的样品,连 续测定 20 孔求出均数( )和标准差(s)). 变异系数:cv= × 100% (七)阳性预示值(PPV)和阴性预示值(NPV):这种指标还考虑到人群感染率的 分布,PPV 表示阳性检测结果为真阳性的概率,NPV 表示阴性检测结果为真阴性的概 率.它们的简单估算公式为: PPV=真阳性/(真阳性+假阳性)× 100% NPV=真阴性/(真阴性+假阴性)× 100% 五,评估结果的收集,分析,上报和反馈 (一)参与国家级评估的实验室应及时整理评估资料,上报国家参比实验室或其委 托的组织单位,同时应附上原始记录的复印件,原始记录由各参评实验室存档备案. (二)国家参比实验室或其委托的组织单位对收集的资料进行汇总和分析. (三)国家参比实验室定期将全国 HIV 诊断试剂临床评估结果上报中国疾病预防控 制中心,卫生部疾控司,医政司和国家食品药品监督管理局,并反馈给各省,自治区, 直辖市卫生行政部门,艾滋病检测实验室和试剂生产厂家,为艾滋病检测实验室选购试 剂,为生产厂家提高试剂质量提供参考依据. (四)每次国家级艾滋病诊断试剂临床评估的主要结果将在《艾滋病预防控制信息》 上予以公布. (五)省级 HIV 确认中心实验室组织的 HIV 诊断试剂临床质量评估工作,在评估 后应将结果上报本省卫生行政部门和国家参比实验室,以便及时沟通情况,发现和解决 问题. s x x 28 附表 1HIV 抗体筛查报告 REPORT OF HIV ANTIBODY SCREENING TESTING 秘密 SECRET 编号 NO. 送检单位 FROM 送检日期 DATE 年 月 日 YEAR MONTH DAY 送检标本 SPECIMEN 送检人群 POPULATION 姓名 NAME 性别 SEX 年龄 AGE 职 业 OCCUPATION 国籍 NATIONALITY 地址 ADDRESS 检测方法 METHOD 日 期 DATE 检测结果 RESULTS 酶联免疫 ELISA 结论 CONCLUSION 检测者 OPERATOR 签发者 HEAD 报告日期 DATE 年 月 日 YEAR MONTH DAY 筛查单位或实验室(公章) INSTITUTION OR LABORATORY备注 NOTE PRINTED BY THE DEPARTMENT OF DISEASE CONTROL,CHINESE MINISTRY OF HEALTH 中国疾病预防控制中心制订 29 附表 2 HIV 抗体筛查阳性送检单 秘密 编 号 送检单位 送检日期 年 月 日 送检标本 送检人群 姓名 性别 年龄 职业 住址(户籍) 现住址 既往病史 复 测 试 验 初 筛 试 验 第一次 第二次 检测日期 检测方法 试剂厂家 批 号 有 效 期 空 白 阴性对照 阳性对照 临 界 值 ELISA 法 OD 值 送检标本 结 果 检测者 审核者 送检单位(公章) 电话 邮编 备注:本表全部由送检单位填写 中国疾病预防控制中心制订 30 附表 3 HIV 抗体检测确认报告 REPORT OF HIV ANTIBODY CONFIRMATORY TESTING 秘密 SECRET 编号 NO. 送检单位 FROM 送检日期 DATE年 月 日 YEAR MONTH DAY 送检标本 SPECIMEN 送检人群 POPULATION 姓名 NAME 性别 SEX 年龄 AGE 职 业 OCCUPATION 国籍 NATIONALITY 地址 ADDRESS 检测方法 METHOD 日 期 DATE 检测结果 RESULTS 酶联免疫 ELISA 免疫印迹法 带型 WESTERN BLOT BANDS 结论 CONCLUSION 检测者 OPERATOR 签发者 HEAD 报告日期 DATE 年 月 日 YEAR MONTH DAY 确认单位或实验室(公章) INSTITUTION OR LABORATORY 备注 NOTE PRINTED BY THE DEPARTMENT OF DISEASE CONTROL,CHINESE MINISTRY OF HEALTH 中国疾病预防控制中心制订 31附表 4 __________省(自治区,直辖市)HIV 抗体检测数及阳性人数统计报表 __________年 季度 填报单位: 本 季 度 筛查 WB 用于监测的实验室 检测方法报告疫情 人 群 分 类 检测数 阳性数 检测数 阳性 不确定 复检数 阳性数 本年度累 计报告阳 性数 性病病人 暗娼,嫖客 吸毒者 有偿供血(浆)者 受血或输注血液制品者 同性恋者 HIV 阳性者的配偶/性伴 临床可疑者 术前检查者 献血员 出境,入境体检者 婚检者 孕产妇 无关联,自愿检测 流动人口 其它 合 计 单位(盖章): 填表人(签字): 报告日期: 年 月 日 32 附表 5 艾滋病职业暴露个案登记表 一.基本情况 编 号 性别 年龄/工龄 / 职 业 工作单位 发生时间 发生地点 暴露时从事何种防治活动 是否接受过艾滋病安全操作培训 二.暴露方式 (一)接触暴露 1. 皮肤 无破损 □ 有破损 □ 2. 粘膜 □ 3. 接触部位 4. 接触面积 cm2 5. 暴露量和时间 量小暴露时间短 □ 量大暴露时间长 □ 6. 污染物来源 (1)血液 □ (2)何种体液 (3)其它:(二)针刺或锐器割伤 1. 何种器械 (1)空心针 □ (2)实心针 □ (3)其它器械: 2. 损伤程度,危险度 表皮擦伤,针刺 低危 □ 伤口较深,器皿上可见血液 高危 □ 3. 污染物来源 (1)血液 □ (2)含血体液: (3)其它: (三)其它方式 致伤方式 抓伤 □ 咬伤 □ 其它 破损,出血 有□ 无□ 三.暴露源严重程度 1.血液 □ 2.何种体液: 3.其它: 4.病毒含量: 滴度低 滴度高 (一) 实验室标本 5.其它情况: 患者编号 性 别 年 龄 确诊时间 患者病情 无症状 HIV 感染者 □ 有症状,但不同于 艾滋病 □ 艾滋病期. □ (二) 来源于患者 病毒载量 CD4 细胞计数 备注: 33 四.暴露后紧急处理 1.清水冲洗 □ 2.是否用肥皂 是□ 否□ 3.是否挤出损伤处血液: 是 □ 否 □ 4,消毒药物: (一)皮肤 5.冲洗时间: 分钟 1.生理盐水 □ 2.清水 □ (二)粘膜 3.其它液体: 4.冲洗时间: 分钟 备注: 五.评估 (一)暴露级别 (1)1 级暴露 □ (2)2 级暴露 □ (3)3 级暴露 □ (二)暴露源头严重程度 (1)轻度 □ (2)重度 □ (3)不明 □ 评 估 人: 六.暴露后预防性治疗方案 1.是否需要预防性用药 是□ 否□ (1) (2) 2.用何种药物及用量 (3) 3.开始用药时间 4.停止用药时间 5.因毒副作用,修改治疗方案 6.副作用 肝功能检查 肾功能检查34 七.症状 暴露后 4 周内是否出现急性 HIV 感染症状 是□ 否□ 何种症状 持续时间 备注: 八.HIV 血清学检查 项目 日期 结果 项目 日期 结果 暴露后即刻 6 周后 12 周后 6 个月 12 个月 备注: 九.结论 1.暴露后未感染 HIV □ 2.暴露后感染 HIV □ 备注: 填表单位______________________ 填 表 人______________________ 审 核 人______________________ 填表时间______________________ 联系电话______________________ 35 附表 6 职业暴露后预防(Post-Exsposure Prophylaxis,PEP)HIV 感染的评价和处理程序 1.步骤 1:确定暴露级别(Exposure Code) 2.步骤 2:确定 HIV 暴露源头严重程度 暴露物是否是体液,含血体液,其他污染物或其沾染器械 是 否 其他污染物 血液或含血液体 暴 露 的 类 型 粘膜或可能有损伤的皮肤 不需 PEP 只沾染完整的皮肤 刺,割伤皮肤 暴露量 不需 PEP 危险度 量小 暴露时间短 1 级暴露 低危 如:表皮 擦伤,针刺等 量大 暴露时间长 2 级暴露 高危 如:伤口较深,仪 器上可见血液等 2 级暴露 3 级暴露 HIV 阴性 HIV 阳性暴露源的 HIV 情况 无需 PEP 暴露源不明 HIV 暴露源级别 1(轻度) 暴露源的 HIV 滴度低(无症 状,CD4 计数高) 暴露源的 HIV 滴度高(有症 状,CD4 计数低) HIV 暴露源级 别 2(重度) HIV 暴露源级 别不明 36 3.步骤 3:根据暴露级别和暴露源病毒载量水平预防性用药的推荐处理方案 暴露级别 感染源级别 预防性用药推荐处理方案 1 1 不一定使用 PEP,可由职业暴露者本人 根据利害比较作出决定 1 2 使用基本用药程序 2 1 使用基本用药程序 2 2 使用强化用药程序 3 1 或 2 使用强化用药程序 原因不明 原因不明 使用基本用药程序 *1.基本用药程序:两种逆转录酶制剂,使用常规治疗剂量,连续使用 28 天.双 汰芝(AZT 与 3TC 联合制剂) 300 mg/次,每日 2 次,或参考&国家艾滋病抗病毒治疗指 导手册(试行)&. *2.强化用药程序: 基本用药程序加一种蛋白酶抑制剂,均使用常规治疗剂量,连续使用 28 天. 37 附录 1 HIV RNA 测定 HIV 病毒 RNA 主要存在于病毒颗粒内,其定量测定主要反映了病毒存在的水平.目 前常用的 HIV 病毒 RNA 的测定方法通常以定量为主. 目前国际上常用的 HIV RNA 测定方法有以下几种:核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) 技术,其代表为 Organon Teknika 生产 的 NASBA HIV-1 RNA QT 和 NucliSens HIV-RNA QT逆转录 PCR 系统(RT-PCR) 其代表为 Roche Diagnostic System 生产的 AMPLICOR HIV-1 MONITOR以及分枝 DNA 信号放大系统(bDNA),代表为 Byer 公司(原生产商 Chiron Diagnostics)生产的 Quantiplex HIV RNA assay.Abbott Laboratories 生产的 LCx HIVRNA Quantitative assay (LCx HIV)属于连接酶链式反应,由于推出较晚,目前使用较少,本部分不做详 细讨论. 一,核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) (一)原理 NASBA 技术为 Organon Teknika 公司专利技术,早期产品为 NASBA HIV-1 RNA QT 定量 RNA 测定方法,现已被最新版本的方法 NucliSens HIV-RNA QT assay 取代.方法分为普通敏感度和超敏感度两种,具体性能见&五, RNA 测定商用系统方法学比较&. NASBA 技术是一种等温扩增系统,其扩增基础在于系统内的混合酶系统,此系统内 含有逆转录酶 AMV-RT 和 T7-DNA 多聚酶,以在体外模拟逆转录病毒体内复制过程. 操作可分为四部分,核酸释放,核酸提取,核酸扩增和核酸测定. 首先样品被加入到含有异硫氰胍和 Triton X-100 的裂解液中,病毒颗粒被裂解从 而使病毒核酸释放出来.在裂解液的作用下样品中的 DNA 酶和 RNA 酶失活,不会降解样 品中的 RNA 成分. 第二步为核酸提取.进行提取前在裂解了的样品中加入三个已知拷贝数的人工合成 RNA 片断作为内标物,这三个内标物与野生型病毒序列只有很小一部分不同.所有核酸 在高盐浓度下与二氧化硅颗粒结合,经过清洗除去其他组织成分和盐后,结合在二氧化 硅颗粒上的核酸被清洗下来进行下一步操作. 上二步操作得到的核酸被加入到扩增体系内,三个内标物与病毒 RNA 同时被扩增.引物 1 上带有 T7-RNA 多聚酶结合位点,RNA 模板与引物 1 结合后在逆转录酶的作用下合成 DNA,合成的 DNA 链在 AMV-RT 的 RNase H 活性的作用下解离下来,结合引物 2 后在 T7-RNA 多聚酶作用下转录形成 RNA.经多次循环后模板 RNA 被扩增. 扩增后的产物使用 NASBA QR 电化学发光(ECL)系统进行检测和定量,此系统包括 亲和素标记的磁珠,生物素标记的核苷酸片段(此片段可与新合成的 RNA 产物的一端互 补结合)及可特异与四种产物结合的探针(探针上标记有铷元素),这四种探针可分别 38 与不同的 RNA 产物结合.将四种探针分别置于不同的反应管内,在适当的条件下(41℃) 几种成分将结合在一起,形成复合体.这些复合体可在 ECL 读数仪中被分别读取其上铷 元素的激发信号,根据野生型病毒核酸测定值与其他三个内标物测定值的比较可得到野 生型病毒的拷贝数. 生产厂家在此定量方法上通过改动设置可进行定性检测. (二)NucliSens HIV-RNA QT assay 实验操作分区要求: 1.核酸提取:在核酸提取区内进行,此区域的设置要求可参照本规范中相应部分. 2.预扩增:在预扩增区内进行,预扩增区为一相对独立的区域,可与核酸提取区设 在同一房间中.由于本实验中扩增酶系统对反应温度要求较高,此区域内使用的恒温装 置应具备良好的稳定性,温度波动范围不得超过 0.5 C 3.扩增及检测:可设置在同一区域内,具体要求参见本规范中相应部分.此区应设 41 C 水浴和 ECL 测定仪. (三) 实验结果 实验结果由专用的软件计算得出,此结果不可人为更改并且打印出的结果有其 特有格式,因此可视作原始记录,在出具报告时附有此结果. 通常单次实验最低检测限(LDL)为 20 拷贝,每份样品的检测结果的 LDL 可因 加样量不同而有差别,在给出最低检测限时应予以注意. 二,HIV-1 定量检测逆转录 PCR 系统(RT-PCR) RT-PCR 系统主要为 Roche Diagnostic System 生产的 AMPLICOR HIV-1 MONITOR assay.目前已推出的试剂有 1.0 版本和升级版本 1.5 版本.此试剂也有普通敏感方法 和超敏感方法两种,具体性能见&四,RNA 测定商用系统方法学比较&. (一)原理 基本原理是通过逆转录酶的作用将样品中 RNA 逆转录合成 DNA 后进行聚合酶链式反 应(RT-PCR)方法较为简单. 血浆样品在含有异硫氰胍的裂解液中被裂解,释放出核酸成分.加入一个已知拷贝数量的合成 RNA 分子作为定量标准(QS),然后进行 RNA 提取.使用引物 SK431 和 SK462 (引物的 5'端标记有生物素)在逆转录酶的作用下逆转录产生 142 碱基的 gag 基因片段 (DNA),通过 PCR 方法对此基因片段进行扩增,可得到病毒 DNA 和 QS 的扩增产物.定 量系统通过比较病毒核酸和 QS 的扩增产物量来完成,在微孔板上分别包被有病毒核酸 和 QS 特异的基因探针,将扩增产物在不同的孔中进行定比稀释,在一定条件下完成产 39 物与探针的杂交,清洗掉未杂交的反应产物后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲 和素,亲和素与扩增产物上的生物素结合,经过清洗,加入 HRP 的底物进行显色反应, 测定 OD 值,比较病毒核酸孔与 QS 孔的 OD 值,通过计算可定量病毒的拷贝数. (二)APLICOR HIV-1 MONITOR ,Version 1.5 的操作要求: 本实验为一个典型的逆转录 PCR 试验,其分区和操作要求严格参照本规范相应内容. 实验操作可为手工操作或机器(半)自动操作.如进行手工操作时应将酶标仪置于核酸 产物分析区域内;如进行自动操作,则在产物分析区内放置 COBAS 自动测定系统. (三)试验结果: 本试验结果可由手工计算或将测定值输入计算机相应的程序中计算得出.在给出试 验报告同时应出具计算机打印的结果,但应注意此结果是可以人工修改的,因此实验室 必须保留的酶标仪测定值作为原始记录. 不同样品和不同反应的最低检测限,当检测结果低于最低检测限时在报告时应分别 注明. 三,HIV RNA 定量检测的分支 DNA 测定法(bDNA) (一)原理 分支 DNA (bDNA)原理为 Chiron Diagnostics 专利技术,现已被拜尔 (BYER)公司合并.早期的试剂为 Quantiplex HIV RNA 2.0 assay,现已被 Quantiplex HIV RNA 3.0 assay 取代.方法具体性能见&五,RNA 测定商用系统方法学比较&. bDNA 测定技术基于其独特的信号放大系统,即 bDNA 信号放大系统,这是一个人工 合成的 bDNA,bDNA 的分枝可结合多个酶标记物,从而将病毒的信号放大,以便进行检 测.此检测系统不涉及核酸扩增反应 首先将血浆样品离心,浓缩其中的病毒颗粒,HIV 基因 RNA 释放后加入微孔板中, 板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针(Target Probe),另一系列靶探针的 一端可标记在游离的病毒核酸链上,另一端可与 bDNA 结合,加入酶标记物对结合的 bDNA 进行标记,经过清洗后加入底物进行反应,测定反应强度.本方法定量系统中没有内标 记物,每次实验设置一系列外部标记,通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比 较确定实验样品的病毒拷贝数. (二)Quantiplex HIV RNA 2.0 assay 的操作要求: 由于此实验不涉及核酸扩增过程,因此全部操作可在同一区域内进行,对此区域 的要求相对较低,但应保证此区域内不含有与本实验目的基因相同的大量核酸扩增产物 或克隆产物.试验区应配置 2 个水浴箱(在使用前分别调至 37℃和 63℃),高速恒温离 心机和 bDNA 测定分析仪. (三)实验结果 40 由计算机直接接收检测结果并由专用的数据处理软件处理和给出结果.结果打 印有特定的格式,可作为原始记录进行保存. 最低检测限由于试剂版本不同而有差异,在出具报告时应对每份样品进行标注. 四,RNA 测定的意义和应用 1,辅助诊断在一般情况下 HIV 抗体检测足以对 HIV 感染与否做出正确诊断,但在特殊情况下单 纯抗体检测不足完成明确的判定,如出现某些非典型的抗体反应,特别是不确定反应时, RNA 的测定可提供非常有用的证据.虽然单纯使用 RNA 测定不能完全确定感染与否,但 当 RNA 测定出现较高拷贝数的阳性结果时(&1000)提示感染发生的可能性非常大. 需要指出的是,每一种 RNA 定量系统都有其最低检测限,即可以测出的最低拷贝数, 通常在 50-100 拷贝/毫升以上,RNA 定量检测时未测出不等于样品中不含有病毒 RNA. 另外,许多病人和感染者在接受抗病毒治疗后其病毒载量可降至非常低的水平,还有少 数感染者在感染后长期处于病毒水平非常低的状态,进行 RNA 测定时往往测不出来,因 此使用此指标应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析与判断. 2,早期诊断 在 HIV 感染的窗口期无法使用抗体检测进行诊断,而在感染早期,在抗原峰出现前 后通常出现一个病毒载量的高峰,通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平,并且有证据 表明这个时期的病毒具有很高的感染能力.这个高峰在免疫系统产生反应后,尤其是在 细胞免疫出现后开始下降.因此早期病毒 RNA 测定具有特殊的意义. 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的 RNA 检测以 降低窗口期传播的残余危险度. 3, 病程监控 由于 HIV 感染发生后病毒载量的变化具有一定规律,并且这种变化与疾病的进程有 着密切的相关性,因此定期进行病毒载量的检测可以帮助医生和感染者确定疾病发展的 阶段,以进行相应的治疗.通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与 AIDS 发病 时的症状区别,此时,病毒载量就是一个非常重要的指标,可以帮助医生判断一个刚发 生的症状是否与 HIV 感染有关. 4,指导治疗方案及疗效测定 临床实践证明,并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗,这不但是经济上 的原因,更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效.通常在病毒载量达到一定水平后 (如& 拷贝/毫升)才具有良好的效果. 另外,由于试验差异较大,通常治疗后病毒水平降低 0.5log 才被认为临床有效. 5,预测疾病进程 41 HIV 疾病进程与病毒载量的关系十分密切,观察感染者病毒 RNA 水平可大致预测其 发病的可能,如下图所示,病毒载量与 6 年发病率的关系为: 30000 时则为 80%. 五, RNA 测定商用系统方法学比较 以下对前述三种主要的 RNA 测定商用系统性能进行比较. (一)HIV RNA PCR (Amplicor HIV-1 Monitor versions 1.0, and 1.5, Roche Labs) 1,优点: (1)敏感:1.5 版标准型检测范围 200-3000000 拷贝/毫升,超敏感型 20-75000 拷贝/毫升. (2)操作相对简单:一个工作人员手动操作可完成 42 份/天,若使用其全自动 Cobas 系统则可更为轻松完成. (3)对大部分 M 组亚型有较好的敏感性. (4)对多数生物样品反应性良好. 2,缺点: (1)操作容易污染 (2)测定范围较小(相对于 NASBA)(3)部分生物样品反应受抑制,如精液,乳汁和唾液 (4)早期版本对部分亚型反应性较差,1.0 版对非 B 亚型的样品反应性普遍较差, (5)版通过改进 (6)对 O 亚型检测能力较差 (二)NASBA 1,优点:
血浆病毒载量(拷备数/毫升) 6 年发病率% 42 (1)测定范围大:40-10,000,000c/mL (2)可对几乎所有生物样品进行检测 (3)敏感:最低检测限可达 40 拷贝/毫升 (4)对各种抗凝剂均适用 (5)每个样品均有内部对照,可排除提取过程的误差 2,缺点: (1)早期版本(NASBA)对部分亚型(G 亚型)反应性差. (2)操作复杂,样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手 工操作. (3)不适合一次大量检测,ECL 读数仪每次只能进行 12 个样品的检测. (4)实验内,外误差相对较大. (三) bDNA 1,优点: (1)操作简便,尤其是在使用自动检测系统时. (2)适合大量样品的操作,3.0 版可每次操作多达 168 份样品. (3)重复性好. (4)敏感性较好. 2,缺点: (1)对低值样品检测的特异性较差. (2)无内部质量控制,尤其在 3.0 版中为单孔检测时,无法控制由于提取或加样操 作的失误. (3)不同版本间差异较大,2.0 版约为 RT-PCR 的 50%,3.0 版结果与 Roche 基本相 同表明两个版本间差异可能达到 50%. (4)对除血浆,血清外的大部分体液样品无法进行检测. (5)对抗凝剂敏感,只能使用 EDTA. 43 病毒载量测定方法比较 Roche Bayer (前 Chiron) Organon 技术 RT-PCR bDNA Nuclisens HIV-1 QT 结果比较 约 2xbDNA 2.0 2.0 版结果约为 RT-PCR 的 50%, 3.0 版结果与 Roche 基本相同 与 Roche 基本相同 优点 通过了 FDA 认证 假阳性结果较 bDNA 少 1.5 版对 A-G 亚型有较 好的反应性 操作时间较少 对 A-G 亚型有较好的 反应性 通过了 FDA 认证 可使用多种组织,如生殖道分 泌液 对 A-G 亚型有较好的反应性 检测范围大 检测范围 标准版 (Amplicor 1.0 及 1.5) 400 - 750,000 c/mL 超敏版 (Ultra-Direct 1.0 and 1.5): 50-75,000 c/mL bDNA 3.0 版: 100-500,000 c/mL Nuclisens HIV-1 QT: 40-10,000,000 c/mL (取决于全国艾滋病检测技术规范发布时间： 12:47:20 点击数：288目 录第一章样品的采集和处理……………………………………………………………………11 范围………………………………………………………………………………………1 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………1 3 操作步骤…………………………………………………………………………………1 3.1 样品的采集和处理…………………………………………………………………1 3.2 样品的保存…………………………………………………………………………1 3.3 样品的运送…………………………………………………………………………2 3.4 样品的接收…………………………………………………………………………2 第二章 HIV 抗体检测………………………………………………………………………………31 范围………………………………………………………………………………………3 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………3 3 HIV 抗体检测实验室………………………………………………………………………3 4 HIV 抗体检测的目的和要点…………………………………………………………3 4.1 HIV 抗体检测的目的…………………………………………………………………3 4.2 HIV 抗体检测的要点…………………………………………………………………3 5 常规 HIV 抗体检测的方法和程序…………………………………………………………4 5.1 HIV 抗体检测筛查试验………………………………………………………………4 5.2 HIV 抗体确认试验……………………………………………………………………66 HIV 抗体检测的替代策略…………………………………………………………………8 6.1 替代策略Ⅰ…………………………………………………………………………9 6.2 替代策略Ⅱ…………………………………………………………………………10 6.3 替代策略Ⅲ…………………………………………………………………………11 7 HIV 抗体检测情况季报的时间和程序……………………………………………………12 第三章 HIV 核酸定性检测…………………………………………………………………………131 范围………………………………………………………………………………………13 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………13 3 实验室条件………………………………………………………………………………13 3.1 实验室功能分区……………………………………………………………………13 3.2 人员………………………………………………………………………………14 3.3 设施和设备………………………………………………………………………14 4 方法和试剂………………………………………………………………………………14 4.1 方法………………………………………………………………………………14 4.2 试剂………………………………………………………………………………14 5 扩增目的基因片段………………………………………………………………………15 5.1 样品的采集和处理…………………………………………………………………15 5.2 核酸提取……………………………………………………………………………15 5.3 逆转录………………………………………………………………………………15 5.4 PCR 扩增……………………………………………………………………………15 6 扩增产物分析及结果报告………………………………………………………………15 6.1 常用的扩增产物分析………………………………………………………………15 6.2 结果判定和报告……………………………………………………………………15 7 实验室管理…………………………………………………………………………………157.1 生物安全……………………………………………………………………………16 7.2 严格执行分区制度…………………………………………………………………16 7.3 仪器和材料的专用制度……………………………………………………………16 7.4 单向流向制度……………………………………………………………………16 7.5 废弃物处理制度……………………………………………………………………16 第四章 HIV RNA 定量测定（病毒载量测定）………………………………………………171 范围…………………………………………………………………………………………17 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………17 3 实验室条件…………………………………………………………………………………17 3.1 实验室功能分区……………………………………………………………………17 3.2 人员…………………………………………………………………………………18 3.3 设施和设备…………………………………………………………………………18 4 方法和试剂…………………………………………………………………………………18 4.1 方法…………………………………………………………………………………18 4.2 试剂…………………………………………………………………………………19 5 实验室管理…………………………………………………………………………………19 5.1 生物安全……………………………………………………………………………19 5.2 严格执行分区制度…………………………………………………………………19 5.3 仪器和材料的专用制度……………………………………………………………19 5.4 单向流向制度………………………………………………………………………19 5.5 废弃物处理制度……………………………………………………………………20 5.6 质量控制和评价……………………………………………………………………20 6 HIV 核酸定量检测的意义……………………………………………………………20 6.1 辅助诊断…………………………………………………………………………206.2 早期诊断…………………………………………………………………………20 6.3 病程监控…………………………………………………………………………20 6.4 指导治疗方案及疗效判定………………………………………………………21 6.5 预测疾病进程……………………………………………………………………21 第五章 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞检测……………………………………………………………22 1 范围………………………………………………………………………………………22 2 规范性引用文件………………………………………………………………………22 3 实验室条件……………………………………………………………………………22 3.1 人员…………………………………………………………………………………22 3.2 设施和设备…………………………………………………………………………22 3.3 功能分区………………………………………………………………………22 4 样品采集、运输和接收…………………………………………………………………22 4.1 样品的采集…………………………………………………………………………22 4.2 样品运输……………………………………………………………………………23 4.3 样品接收……………………………………………………………………………23 5 方}