什么是基因克隆？_百度知道
什么是基因克隆？
将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子.在此基础上,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节
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应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有能力的——，继而通过转化或、筛选出含有的细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。
DNA克隆DNA克隆过程
一个完整的DNA克隆过程应包括：目的的获取，的选择与构建，与载体的拼接，重组DNA分子导入，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（）。
DNA克隆目的基因的获取
利用重组DNA技术构建时，欲插入载体DNA的片段中即含有我们感兴趣的或—。目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。
DNA克隆化学合成法
如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列后，再利用通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有人释放抑制因子、、及干扰素基因等。
DNA克隆基因组DNA
分离组织或细胞染色体DNA，利用将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的拼接 成重组DNA分子，继而转入扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA 片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个。存在于细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称(genomicDNAlibrary)。基因组DNA文库就象图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部，也包括我们感兴趣的基因。建立后需要结合适当筛选方法从众多中筛选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，获得的—克隆。
DNA克隆cDNA
以mRNA为模板，利用合成与mRNA互补的DNA(complementary DNA，)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受菌体，扩增为(cDNA library)，然后再采用适当方法从cDNA文库种筛选出目的cDNA。与类似，由总mRNA制作的cDNA文库包括了细胞全部mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。
DNA克隆聚合酶链反应
(polymerasechain reaction，PCR)：目前，采用PCR获取目的DNA十分广泛，应用这一技术可以将微量的目的DNA片段在100万倍以上。PCR的基本工作原理是以拟扩增的为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端相互补的片段为引物，在的作用下，按照的机制沿着延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。组成PCR反应体系的基本成分包括：、引物、 DNA聚合酶（具耐热性）、以及含有Mg 的。
DNA克隆PCR的基本反应步骤
1） 变性——将反应系统加热至95℃，使完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2）退火(anneal)——将温度 下降至适宜温度（一般较Tm低5℃）使引物与模板DNA退火结合；3）延伸，将温度升至72℃，以为底物催化DNA的。上述 三个步骤称为一个循环，新合成的继续做为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。
DNA克隆克隆载体的选择与改建
外 源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将连接到上，外源DNA则可做为复制子的一部分在中复制。这种复制子就是。重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一项极富技术性的专门工作，目的不同，操作的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。
DNA克隆外源基因与载体的连接
通过不同途径获取含的、选择或改建适当的后，下一步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的。 这种是靠将外源DNA与载体共价连接的。改建载体、着手进行外源与载体连接前，必须结合研究目的及感兴趣基因特性，认真设计最终构建的分子。应该说，这是一件技术性极强的工作，除技巧问题，还涉及对重组DNA技术领域深刻的认识。下面仅就连接方式做扼要介绍。
DNA克隆粘性末端连接
同一限制酶切割位点连接由同一切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链突变（5'突出及3'突出）的，同时附近的不影响连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行，然后在催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。
不同限制性内切酶位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配伍末端，也可以进行粘性末端连接。例如MboⅠ(GATC)和BamHⅠ(GGATCC)切割DNA后 均可产生5'突出的GATC，彼此可互相连接。
DNA克隆平端连接
可催化相同和不同切割的之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行。
DNA克隆同聚物加尾连接
连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端(terminal transferase)作用下，在DNA片段端制造出，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。
DNA克隆人工接头连接
对DNA片段或载体DNA，可在连接前将的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生。
DNA克隆重组DNA导入受体菌
（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子（）后，需将其导入。随着受体菌的生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的分子即为一或克隆。在选择适当的受体菌后，经特殊方法处理，使之成 (competent cell)，即具备接受外源DNA的能力。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化(transformation)、(transfection)和感染(infection)等不同手段。
DNA克隆重组体的筛选
通 过转化、或感染，DNA分子被导入，经适当涂布的培养板培养得到大量或转染。由于每一重组体只携带某一段外源基因，而 转化或转染时每一又只能接受一个重组体分子，如何将众多的转化菌落或转染噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基 因，这一过程即为筛选或选择。根据载体体系、特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法或非直接选择法。没有找到帖子
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