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当前位置：&>>&&>>&&>>&色谱柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶&饱和&，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。5、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有机物)、甲醇、水依次冲洗。6、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。7、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1-2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5-30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。8、新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在H仪上柱子如不经常使用，应每隔4-5天开机冲洗15分钟。
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色谱柱污染后应该如何清洗和再生（一）？
色谱柱污染后应该如何清洗和再生（一）？
色谱柱在使用过程中可能因受到来自于样品或流动相的污染而导致的柱效下降或柱压升高，这时可以通过冲洗来再生色谱柱。操作前建议您咨询阅读色谱柱的说明书，也可向厂家咨询。
清洗色谱柱原则上需要使用比流动相更强的溶剂，每种溶剂至少应使用10个柱体积（见图1）。色谱柱的类型不同，其清洗再生的步骤也不尽相同，我们首先讲一讲最常用的反相色谱柱的冲洗。
一．反相硅胶柱的冲洗步骤
1.&先用不含缓冲液盐的流动相冲洗（水/有机相）
2.&然后用&100%&有机相（甲醇和乙腈）冲洗
3.&75%&乙腈&/&25%&异丙醇
4.&100%&异丙醇
5.&检查色谱柱是否有恢复；如果没有，丢弃色谱柱或考虑下面操作
6.&100%&二氯甲烷&*
7.&100%&己烷*
二．反相聚合物柱的冲洗步骤
当使用聚合物类反相柱时，我们强烈建议流动相中最少含有&1%&的有机改性剂。长期使用100%水相洗脱液后再使用有机流动相时可能影响柱效；同时也不能用100%的水相缓冲液“冲洗”色谱柱。可以进行反向冲洗，如果起始压力高，可降低流速。下面是反相聚合物柱的清洗步骤：
1.使用当前流动相运行清洗梯度，再用高比例有机溶剂（95%）清洗数个柱体积。重复2到3次。由于缓冲液可能在高有机相中发生析出，因此如果您的流动相含缓冲液，有机相比例不要超过70%，或者在清洗之前用不含缓冲液的流动相将缓冲液清洗掉。
2.尝试使用较高强度的有机改性剂，如&TFA，去除发生疏水键合的污染物。
3.有时用含1.0%TFA的水/乙腈（v/v）可以去除多肽或蛋白污染物。
4.用强酸和强碱（包括1&M&氢氧化钠）适当清洗而不会发生热降解。
三．反相柱吸附了蛋白等生物大分子后的再生建议
最常用的方法：
在水和有机溶剂（乙腈或甲醇）中各加入0.1&%的三氟乙酸，反复走梯度（例如,&有机相从10%升至100%）冲洗色谱柱。
如果上述方法无效，以进样的方式向色谱柱内注入较强的有机溶剂（如DMSO，&20uL）也可以尝试。或可尝试以100%异丙醇冲洗色谱柱。
四．正相硅胶柱的的反冲或清洗步骤：
对于正相色谱柱只能使用有机溶剂，如果您的色谱柱是传统的分析型&4.6&x&250&mm&色谱柱，那么每种溶剂至少需要用50&mL（相当于20个柱体积）。尝试下列强度递增的溶剂进行清洗：
1.50%甲醇∶50%氯仿
2.100%乙酸乙酯
色谱柱清洗和再生后的注意事项：
a.&切换到更强溶剂（如二氯甲烷和正己烷）或切换回原流动相时需注意前后溶剂的兼容性，必要时以异丙醇进行过度，以免发生溶剂不互溶的问题。
b.&缓冲液盐可能发生沉淀并造成色谱柱内反压。发生这种情况时，应用热水缓慢通入色谱柱，以去除沉淀。
c.&为避免沉淀，如果系统中不含非挥发性缓冲液，在纯有机溶剂进入系统之前，首先用不含缓冲液的水相流动相进行冲洗。
d.&含丙醇的冲洗溶液因粘度增大将产生更高的操作压力。在清洗过程中需要降低流速，以保持安全的操作压力。
e.&系统压过高有时不一定是色谱柱阻塞，而是系统流路某部位（如泵中的过滤白头、进样针、针座、柱温箱中的毛细管路、液相保护柱或在线过滤器等）堵塞了。因此，遇到压力高问题时应首先检查堵塞位置，然后再对症下药。
f.&不要试图更换色谱柱的进样口筛板。因为现在填充色谱柱采用的是高效工艺，这样做可能为色谱柱带来不可恢复的损坏。
g.&对于填料颗粒度小于1.8μm的色谱柱，请勿反冲色谱柱
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